氯菊酯末端结构域-配体相互作用调节AP-1和GGA适配器介导的甘露糖6-磷酸受体的分类^*

细胞转染

为了耗尽内源性蛋白质，根据制造商手册，使用寡效胺（Invitrogen）作为转染试剂进行了两轮siRNA敲除。第二次转染后的第二天，将细胞在Matrigel-coated盖玻片上分裂，或分成6孔板用于制备裂解物，并在第二天用于实验。

根据制造商手册，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）短暂过度表达荧光标记蛋白。转染后1天，使用Matrigel-coated盖玻片上分离的细胞。

MHC I类内部化

对于MHC I类内化实验，HeLa细胞接种在Matrigel-coated玻璃盖玻片上。接种后24小时，细胞在补充了10 m的DMEM中与抗MHC I类抗体（克隆w6/32，eBiosciences）孵育米HEPES、pH 7.4和0.1%FCS在冰上放置15分钟。在PBS中短暂清洗后+10 m米氯化镁₂，细胞在30μ米化合物（网格蛋白活性化合物：Pitstop-2和Pitstop-2-100，以及它们各自的网格蛋白非活性化合物：Pitstop-2阴性对照化合物（Pitnot-2）和Pitstop-2-100阴性对照化合物（Pitnot-2-100））或补充有0.1%FCS和10mL的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中的0.1%DMSO米HEPES，pH 7.4，在37°C下保持30分钟。在冰镇PBS+10 m中清洗三次后米氯化镁₂在室温下，将细胞固定在4%多聚甲醛、4%蔗糖、pH 7.4的PBS中15 min。

为了结合非内化MHCⅠ类的表面表位，细胞在4°C下与未标记的山羊抗鼠抗体（1:10）在山羊血清稀释缓冲液（10%山羊血清，15 m米磷酸钠缓冲液，pH 7.4，100 m米NaCl），无洗涤剂。第二天，在室温下用山羊血清稀释缓冲液和补充有1 mg/ml皂苷的山羊血清稀释液使细胞渗透20分钟，然后用Alexa 488标记的荧光山羊抗鼠二级抗体对内化的MHCⅠ类抗体进行染色。

转铁蛋白回收

HeLa细胞在12孔板的盖玻片上分裂。第二天，70%的融合细胞在无血清DMEM中饥饿1小时。然后使用20μg/ml转铁蛋白进行转铁蛋白摄取^{Alexa亚历克赛488}（Invitrogen）在37°C下保持30分钟。在PBS+10 m中清洗电池两次后米氯化镁₂在冰上，以0.1的速度在冰上进行酸性清洗米乙酸钠，pH 5.3，含0.2米NaCl保持3分钟，然后在PBS+10 m中再清洗细胞两次米氯化镁₂0分钟时间点在4%多聚甲醛中固定15分钟。将含有1 mg/ml未标记转铁蛋白和30μ米岩屑-2，30μ米分别加入对照Pitnot-2或相应量的DMSO，并立即将其转移到37°C。7.5或15分钟后，将细胞转移到冰上，用PBS+MgCl清洗两次₂，然后进行修复。

VSVG分泌

HeLa细胞在12孔板的盖玻片上分裂。第二天，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将80–90%的融合细胞转染VSVG-SP-GFP。在37°C下孵育4小时后，更换培养基，将细胞移到39°C再培养6小时，以在表达期间将VSVG-SP-GFP捕获在ER中。总表达时间10小时后，用10μg/ml环己酰亚胺培养细胞，并将其转移至19°C，以允许VSVG-SP-GFP转运至TGN。一小时后，30μ米岩屑-2，30μ米Pinot-2或DMEM中相应数量的DMSO（0.1%），含0.1%FCS和10m米将pH值为7.4的HEPES添加到细胞中，并在19°C下再预培养10分钟。然后用PBS+10 m清洗时间点“0 min chase”米氯化镁₂在冰上，在4%多聚甲醛中固定15分钟。将剩余的细胞转移到32°C，追踪60分钟，清洗并如上所述固定。

免疫荧光和共焦显微镜分析

为了进行免疫染色，在实验前24小时将HeLa细胞接种到Matrigel涂层玻璃盖玻片上。将细胞在室温下固定在4%多聚甲醛、4%蔗糖的PBS（pH 7.4）中15分钟，或在−20°C下在冰冷的甲醇中固定7分钟。细胞在山羊血清稀释缓冲液中渗透（10%山羊血清，15 m米磷酸钠缓冲液，pH 7.4，100 m米NaCl）补充0.3%Triton X-100或1 mg/ml皂苷，并在30μl初级抗体溶液中进行处理以进行免疫染色（室温下1小时）。在广泛清洗后，用二级抗体对样品进行染色（1:200，室温下1小时）。

用倒置荧光显微镜（Zeiss）观察转铁蛋白循环和VSVG分泌。使用Slidebook软件分析总强度。利用ImageJ分析VSVG-SP-GFP在细胞中的分布。

对于所有其他实验，细胞通过旋转盘共焦显微镜成像（PerkinElmer Life Sciences）。在活细胞显微镜下，细胞被分割到涂有Matrigel的盖玻片上。添加0.1%二甲基亚砜或30μ米成像缓冲液中的化合物（Pitstop-2、Pitstop-2-100、Pitnot-2或Pitnot-2-100）（Hanks的平衡盐溶液补充10 m米HEPES、pH 7.4和0.1%FCS）。使用Volocity软件（PerkinElmer Life Sciences）对时间推移序列进行分析并生成波形图。

使用旋转圆盘共焦显微镜（PerkinElmer Life Sciences）进行光漂白后荧光恢复（FRAP）分析。对于活细胞成像，表达GPI-GFP的HeLa细胞在PBS中清洗一次，然后在补充有30μ米岩屑-2，30μ米空速塞-2-100，30μ米皮特诺-2，30μ米Pinot-2-100或0.1%二甲基亚砜。在化合物培养5–30分钟后，在37°C下进行FRAP实验。细胞在漂白前以1帧/秒的帧速率成像5秒，然后在125μm的圆形区域漂白²直径。漂白后，立即以2.5图像/秒的帧速率对细胞进行60秒的成像。通过比较光漂白校正后漂白前后的荧光强度，分析漂白区的荧光恢复情况，并与未积极漂白的对照区进行比较。

对于CLC-Kaede光转化实验，在加入30μ米岩屑-2，30μ米通过旋转圆盘共焦显微镜在成像缓冲液中检测Pinot-1或DMSO（0.1%）。成像10秒后，使用405-nm激光线将细胞的TGN区域从Kaede 488光转换到Kaede 568。紧接着，以2秒/帧的帧速率额外采集2分钟的延时序列。使用Volocity软件（Improvision）定量荧光强度和Pearson相关性。

细胞裂解液的制备和免疫印迹

为了分析敲除效率或蛋白质降解，在6孔板中从HeLa细胞制备全细胞裂解物。将细胞转移到冰上，用冷PBS+10 m清洗三次米氯化镁₂，刮入500μl PBS。在4°C和1000×克用50μl细胞裂解缓冲液（20 m）代替PBS米HEPES，pH 7.4，100 m米氯化钾，2米米氯化镁₂，1%Triton®声波风廓线仪X-100，1米米PMSF和0.3%（v/v）蛋白酶抑制剂混合物）。在冰上培养30分钟后，在17000×克，4°C以清除细胞碎片。测定蛋白质浓度，样品缓冲液（62.5 m米添加Tris、pH 6.8、10%甘油、5%2-巯基乙醇、3%十二烷基硫酸钠和0.05%溴酚蓝最终浓度），并将裂解液煮沸5分钟。

为了制备胞浆膜分馏物，去除内源性氯氰菊酯重链的HeLa细胞被拆分到6厘米的培养皿中，并与30μ米DMEM中的Pitstop-2或0.1%DMSO，补充0.1%FCS和10m米HEPES-NaOH（pH 7.4）在37°C下保持20分钟。然后在冰上用冷PBS+10 m清洗两次米氯化镁₂完全去除洗涤缓冲液后，在100μl不含洗涤剂（20 m）的裂解缓冲液中收集细胞米HEPES-NaOH，pH 7.4，100 m米氯化钾，2米米氯化镁₂0.3%蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）和1 m米PMSF）使用电池刮刀。通过重复冻融循环（三次）溶解细胞。细胞裂解物通过一个27加仑的针头提取20次以使其均质。随后在4°C下用1000×克收集上清液，保存20μl作为Western blot中的总细胞裂解物进行分析，而剩余的转移到TLA管中，在4°C下旋转180000×克收集上清液（定义为细胞溶质部分），测定蛋白质浓度，并添加样品缓冲液。将膜颗粒重新悬浮在等于细胞溶质部分体积的样品缓冲液中。将来自三个独立实验的样品用于SDS-PAGE和Western blot，以比较不同蛋白质的膜结合程度。使用ImageJ凝胶分析工具进行定量。

氯菊酯TD-Ligand相互作用调节TGN/内体氯菊酯动力学

以前的研究表明，Pitstop-2不会改变细胞中的网格蛋白募集和分布，但由于与其辅助蛋白配体的结合受损，会降低质膜CCP处的网格蛋白动力学(44). 一个类似的部分重叠的辅助蛋白网络调节TGN/内胚体膜交通中的网格蛋白功能(14)尽管这一问题从未直接得到解决。为了验证网格蛋白TD-ligand相互作用调节TGN/内体网格蛋白功能的假设，我们分析了融合到光开关荧光蛋白Kaede的表达网格蛋白LC的HeLa细胞中网格蛋白的动力学。暴露在紫外线下会导致Kaede从绿色荧光转换为红色荧光(35). 我们利用这一特性研究了氯氰菊酯在TGN上的动力学行为。在经二甲基亚砜处理的对照细胞中，氯氰菊酯LC-Kaede在TGN处的局部光转换导致转换区域的红色增强和相应的绿色荧光氯氰菊酯LC点的丢失。由于与周围非光转换区的网格蛋白分子交换，绿色荧光网格蛋白斑点在3分钟内恢复(图3,A类和C类). 在用Pitstop-2处理的细胞中观察到的恢复效率低得多，这表明对网格蛋白TD功能的干扰会损害TGN处网格蛋白的动力学(图3,B类和C类). Pitstop-2处理细胞中绿色和红色荧光氯氰菊酯种群混合减少进一步支持了这一结论(图3D类). 因此，与已报道的质膜CCPs类似，氯氰菊酯TD-ligand相互作用调节TGN/内体界面处的氯氰菊酯动力学。

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图3。

急性抑制氯氰菊酯TD功能会损害TGN/内体界面处氯氰菊酯池的交换。 A类和B类，氯氰菊酯LC-Kaede的紫外线激发导致绿色到红色照明TGN区域。180秒的光转换后混合红色和绿色在DMSO处理的对照细胞中观察到氯菊酯LC群体(A类,箭头)但在30μ米停车场-2(B类).比例尺，10微米。C类，中显示的数据的量化A类和B类(n个=3个独立实验；t吨=0 min设置为零）。在Pitstop-2-处理的细胞中，TGN中绿色荧光的恢复受损。D类与用二甲基亚砜或对照化合物培养的细胞相比，用Pitstop-2处理的细胞中氯氰菊酯LC-Kaede的红色和绿色群体的共同定位降低。描述了光电转换后不同时间点的皮尔逊相关系数减去0分钟的值(n个=3个独立实验；*，第页< 0.05; **,第页< 0.005).

急性干扰氯氰菊酯TD功能后AP-1和GGA涂层载体的迁移率降低

已经证明，在存在Pitstop-2的情况下，Clathrin和AP-2向质膜CCPs的补充不会受到干扰。为了分析对氯氰菊酯功能的干扰是否影响AP-1或AP-3适配器对TGN或内膜的膜募集，我们分离了内源性氯氰菊酯缺失的HeLa或用Pitstop-2处理(图4A类). 正如预期的那样，Pitstop-2对氯氰菊酯或AP-2与膜的结合没有影响，证实了早期的结果(31). 与AP-2类似，Pitstop-2对AP-1和AP-3适配器在胞浆和膜组分之间的分配也没有影响，这表明不需要使用网格蛋白来招募或稳定膜上的AP复合物。在氯氰菊酯击倒细胞中进一步证实了AP-1、AP-2和AP-3募集的氯氰菊酯独立性(图4A类).

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图4。

急性抑制氯氰菊酯TD功能后，未受干扰的膜募集，但AP-1涂层的动力学受损。 A类，总细胞裂解物的免疫印迹(TCL公司)和胞质(塞浦路斯)和膜(内存)HeLa细胞的部分。注意，与对照细胞相比，内源性CHC耗竭的细胞中AP的膜募集相等（模拟）。Pitstop-2的存在对蛋白质分布没有额外影响(n个=3个独立实验）。B类稳定表达AP-1 eGFP-σ1的BSC-1细胞的活细胞共聚焦成像。30μ的应用米与DMSO处理的对照组相比，Pitstop-2降低了AP-1动力学。比例尺，10微米。显示的是倒置的波形图，表示通过共焦成像在2 Hz下获得的完整时间推移序列（2分钟）。C和D类，平均寿命(C类)和相对流动性(D类)AP-1（σ1）-GFP阳性结构(n个=3个独立实验；*，第页< 0.05; **,第页< 0.005).

为了研究Pitstop-2对AP-1动力学的影响，稳定表达eGFP-tagged AP-1σ（eGFP-σ1）的活BSC-1细胞(34)用时间分辨旋转圆盘共焦显微镜以0.5 Hz的帧速率成像2分钟。在对照细胞中，AP-1涂层载体表现出高度动态行为，其特征与AP-2在质膜上的特征相似，与已发表的数据一致(45). 添加Pitstop-2对AP-1与细胞膜的结合没有明显影响，但在几分钟内，正如在波形记录仪中观察到的那样，导致AP-1动力学停滞(图4B类)，而非活性对照化合物没有影响（未显示）。对eGFP-AP-1σ阳性结构平均寿命的定量分析显示，在Pitstop-2存在的情况下，其平均寿命从46秒显著增加到84秒(图4C类). 此外，单个eGFP-AP-1σ点的均方位移从~124nm×s减少了一半以上⁻¹至54 nm×s⁻¹Pitstop-2中-与二甲基亚砜处理的对照细胞(图4D类).

除AP-1外，甲氰菊酯的TGN/内体池与GGA蛋白相关，GGA蛋白是调节TGN和内体之间MPR分类的单体适配器，以及其他货物（参考文献。46). 活细胞旋转圆盘共焦成像显示，Pitstop-2对氯氰菊酯TD功能的急性扰动干扰了GGA1-eGFP、GGA2-eGFP和GGA3-eGFP阳性结构的动力学(图5,A–C)，与AP-1的效果类似。相反，Pitstop-2对COPI涂层载体的动力学没有影响(例如，ϵCOP-eGFP(37))在高尔基(图5D类)这些结果表明，网格蛋白TD功能调节TGN/内体界面AP-1和GGA载体的动力学。

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图5。

氯菊酯TD功能调节GGA，但不调节COPI动力学。表达GGA1-eGFP的HeLa细胞的活细胞共焦成像(A类)、GGA2-eGFP(B类)、GGA3-eGFP(C类)，或ϵ-COP-eGFP(D类). 在37°C、30μ米Pitstop-2或DMSO（0.1%）。Pitstop-2的应用对GGA1-eGFP的细胞分布没有影响(A类)、GGA2-eGFP(B类)或GGA3-eGFP(C类)但阻碍了他们的发展。COPI-eGFP定位和动力学不受Pitstop-2治疗的影响。D类，kymographers表示在2 Hz下获得的完整时间推移序列（2 min）(n个=3个独立实验）。比例尺，10微米。

急性氯氰菊酯TD功能干扰对TGN MPR恢复的影响

新合成溶酶体酶的MPR分选到内溶酶体系统是由涂有网格蛋白、AP-1和/或GGA的载体介导的(15,–17). AP-1功能障碍的一个标志是MPR的外周弥散，这是由TGN逆行分选缺陷引起的(10). 由于Pitstop-2介导的对氯氰菊酯TD功能的干扰阻碍了AP-1和GGA动力学，因此似乎也可能导致MPR错配。为了研究这一点，我们分析了稳定表达阳离子非依赖性（CI）MPR融合eGFP（GFP-CI-MPR）的跨膜和细胞质域的HeLa细胞(17). 在对照细胞中，GFP-CI-MPR集中在TGN处的管状元件中，经常可以看到这些元件分离并向细胞外围移动，有时断裂成较小的管状碎片。早期研究表明，这些小管含有AP-1(17)AP-1损失导致含MPR结构的外围分散(10). 为了评估氯氰菊酯TD是否在TGN维持MPR的功能上是必需的，我们用Pitstop-2处理细胞，并在90分钟的时间过程中监测GFP-CI-MPR的动力学。在使用Pitstop-230分钟内，GFP-CI-MPR的结构逐渐开窗，在60-90分钟时，GFP-CI-MPR的原TGN池已分散成多个较小的碎片(图6,A–C). 定量分析表明，在60-90分钟内，Pitstop-2介导的对氯氰菊酯TD功能的干扰导致含GFP-CI-MPR片段的数量增加了约2倍，相应的物体尺寸减小（4.2±0.9μm²在控制中与1.7±0.3微米²Pitstop-2处理细胞）。

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图6。

氯氰菊酯TD功能的急性抑制导致MPR分散。 A类稳定表达eGFP-CI-MPR的HeLa细胞的活细胞共焦成像。应用Pitstop-2可使GFP-CI-MPR分散到内体。比例尺，10微米。B类和C类，中所示数据的量化A类Pitstop-2对氯氰菊酯的抑制导致总数显著增加(B类)和相对大小(C类)包含eGFP-CI-MPR的对象。对于C类，将数据归一化为DMSO处理的对照细胞（设置为1）(n个=3个独立实验；**，第页< 0.005).

为了排除GFP-CI-MPR分布的这些变化是由高尔基功能的一般影响引起的，我们研究了VSVG从高尔基复合体到细胞表面的分泌交通。为此，我们利用了一种温度敏感的VSVG-SP-eGFP融合蛋白，该蛋白在19°C培养期间被捕获在高尔基复合体中。移到32°C可使VSVG-SP-eGFP退出并分泌到质膜(18). 在32°C下追逐60分钟后，定位于TGN和质膜的VSVG SP eGFP之间比率的定量分析显示，与DMSO、Pitstop-2或无活性对照化合物（Pitnot-2）孵育的细胞之间没有差异(图7). 这些发现证实了TGN中VSVG的组成性分泌是氯菊酯/AP-1独立的，因此不受Pitstop-2的影响，这与早期数据一致(18,19).

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图7。

在存在Pitstop-2的情况下，VSVG-SP-GFP分泌不受影响。 A类在19°C下孵育60分钟后，VSVG-SP-GFP在高尔基体中积聚。在32°C下追踪60分钟VSVG-SP-GFP导致分泌到质膜。DMSO和Pitstop-2处理的细胞荧光分布无明显差异。比例尺，10微米。放大后的荧光强度增强，以更好地显示质膜上的VSVG-SP-GFP。B类，中所示数据的量化A类与DMSO或非活性Pitnot-2对照化合物处理的细胞相比，Pitstop-2处理的细胞从TGN向质膜的VSVG-SP-GFP分泌未受干扰(n个=3个独立实验）。