钙调神经磷酸酶Aβ通过活化T细胞核因子（NFAT）调节NADPH氧化酶（Nox）的表达和活性^*

摘要

介绍

在糖尿病肾脏中，对高血糖最早的反应之一是肥大。尽管最初是适应性的，但在人类和糖尿病动物模型中，长期肥大已被证明可以预测蛋白尿和随后肾功能的丧失(三). 调节肾肥大的信号通路很复杂，尚未完全理解。钙调神经磷酸酶（Cn）²是一种钙和钙调素依赖性磷酸酶，在生长因子和肽下游发挥作用，诱导糖尿病肾脏肥大(1,2,4,–7).体外Cn被胰岛素样生长因子-I和转化生长因子-β激活，并参与肾系膜细胞的肥大和基质调节。体内环孢素或他克莫司抑制Cn可阻断糖尿病大鼠的肾小球和全肾肥大(1,8). 最近，我们发现糖尿病全肾和肾小球肥大是由CnAβ介导的(2). 我们已经证明，CnAβ调节活化T细胞（NFAT）的核因子(9)，核转录因子Rel家族成员(10). 然而，调节肾脏肥大的CnAβ/NFAT下游靶点尚不清楚。

在糖尿病肾脏中，NADPH氧化酶（Nox）的上调导致活性氧（ROS）生成增加，继而导致肾脏损伤(11,12). Nox1、Nox2和Nox4在肾脏中表达(13)但Nox4在肾对高血糖的反应中起关键作用(14,–17). 在本研究中，我们验证了以下假设：CnAβ和Nox在一个共同的信号通路中发挥作用，以调节高糖引起的肥大。

实验程序

结果

高糖是诱导培养肾细胞肥大的有效机制。然而，HG对Cn的直接影响以前还没有被研究过。用增加浓度的HG处理肾成纤维细胞10分钟，然后用在体外酶测定。图1A类表明HG以剂量反应方式激活Cn。12.5米米随后的所有实验均选择葡萄糖。接下来，利用WT、CnAα和CnAβ生成的肾成纤维细胞系，研究HG对Cn催化亚基的两种主要亚型CnA a和CnAβ的影响^−/−，或CnAβ^−/−肾皮质（如前所述(9)). 通过qRT-PCR验证每种亚型的损失(图1B类). 接下来，每个细胞系用12.5m米检测葡萄糖和Cn酶活性。图1C类表明，尽管与WT细胞相比，HG的基础活性较低，但CnAα的活性增加^−/−细胞。相反，CnAβ的基础活性与WT无差异^−/−细胞，HG无变化。同样，当WT或CnAα^−/−用血管紧张素II或TGF-β处理细胞，但在CnAβ中未观察到反应^−/−单元格(图1D类). 这些数据表明，CnAβ而不是CnAα是由肥大信号机制诱导的。Cn的激活需要催化亚单位结合调节性钙结合亚单位（B）和钙调素。为了证实CnAβ在肥大信号中的选择性作用，通过从对照细胞或HG处理细胞中拉下钙调蛋白，然后对每个亚型进行免疫印迹，来测定活性CnAα或CnA？的相对数量。在WT成纤维细胞中，CnAα是基础条件下与钙调蛋白相关的主要亚型，且不随HG处理而改变(图1E类). CnAα与CnAβ中钙调蛋白的结合^−/−细胞与WT相似，但在CnAα中不存在^−/−单元格，如预期。相比之下，尽管在基础条件下与钙调蛋白结合的CnAβ水平很低，但HG增加了CnAα结合(图1F类). CnAα增强了CnAβ与钙调蛋白的结合^−/−细胞和在CnAβ中缺失^−/−，正如预期的那样。综上所述，这些数据表明，HG选择性诱导CnAβ，而CnAα具有组成活性。

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图1。

钙调神经磷酸酶的β亚型（CnAβ）被高糖选择性激活。 A类暴露于葡萄糖或钙（Ca）含量增加的WT肾成纤维细胞中的Cn酶活性²⁺)10分钟的时间由在体外Cn分析。所示数据为平均值±S.E(误差线)三次反应*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; **,第页与对照组相比<0.001。B类WT、CnAα和CnAβmRNA的表达^−/−和CnAβ^−/−用qRT-PCR检测肾成纤维细胞。所示数据为4-9个重复/组的平均值±S.E.。*，第页与WT相比<0.05。C类WT、CnAα中的Cn酶活性^−/−和CnAβ^−/−肾成纤维细胞暴露于正常葡萄糖（NG）或HG中48小时，通过在体外Cn分析。所示数据为8个重复/组的平均值±S.E.。*，第页< 0.05; **,第页与NG相比<0.01；#，第页与WT NG相比<0.05。D类WT、CnAα中的Cn酶活性^−/−和CnAβ^−/−肾成纤维细胞暴露于血管紧张素II或TGF-β10分钟后，通过以下方法测定在体外Cn分析。所示数据为一式三份反应的平均值±S.E.。*，第页< 0.05; **,第页与对照组相比<0.01。E类和F类Cn催化亚型与钙调蛋白的结合(CaM公司)在WT中测定，CnAα^−/−和CnAβ^−/−通过CaM下拉分析，NG或HG暴露48小时后的肾成纤维细胞。通过密度测定法半定量了与CaM结合的CnAα和CnAβ的相对量。将数据相对于WT NG进行归一化并绘制图表。所示数据为四个独立实验的平均值±S.E.。*，第页与NG.#相比<0.05，第页与WT NG相比<0.05。

接下来，研究了每个Cn亚型在诱导肥大中的作用。首先，用增加浓度的HG处理WT细胞48小时，并测定蛋白质/DNA比率作为肥大的衡量标准。图2A类显示12.5米米HG足以诱导肥大，与HG诱导的Cn最大活性相当图1A类接下来是WT、CnAα^−/−和CnAβ^−/−用HG处理细胞，并测定其对蛋白质/DNA比率的影响。图2B类表明HG诱导WT和CnAα肥大^−/−成纤维细胞，而CnAβ^−/−单元格没有响应。有趣的是，当CnAα^−/−用钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司预处理细胞(塔克)，HG刺激的肥大被消除(图2C类). 这些数据表明CnAβ介导HG介导的肥大。为了证实CnAβ在肥大中的特定作用，在正常培养条件下用空载体、CnAα或CnA？cDNA转染WT细胞，然后在72小时后评估蛋白质/DNA比率。CnA(图2D类).

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图2。

CnAβ介导细胞肥大。 A类通过评估蛋白质/DNA比率，在暴露于葡萄糖量增加的48小时后，检测WT肾成纤维细胞的肥大。所示数据为平均值±S.E(误差线)三个独立实验的结果，第页< 0.05; **,第页与低血糖相比<0.01。B类检测WT、CnAα肥大^−/−，或CnAβ^−/−通过评估蛋白质/DNA比率，用NG或HG处理肾成纤维细胞48小时。所示数据是与WT NG相关的三个独立实验的平均值±S.E，第页< 0.05; **,第页< 0.01.C类，在他克莫司治疗后评估肥大(塔克)CnAα^−/−肾成纤维细胞暴露于NG或HG 48 h。数据显示为8个重复/组相对于对照NG的平均±S.E.。**，第页< 0.01.D类表达72小时后，在载体、CnAα或CnAβcDNA转染的WT肾成纤维细胞中评估肥大。所示数据是相对于向量**的三个独立实验的平均值±S.E，第页< 0.01.

对Cn的药理抑制已被证明可以阻止肥大在体外(4,6)和体内(1,8). 同样，阻断由氮氧化物引起的慢性氧化应激可抑制肥大在体外(4,17)和体内(14,17). 特别是，Nox4亚型与糖尿病肾脏改变有关(12,15,21,22). 在图3A类，使用NADPH氧化酶活性的通用抑制剂DPI和Nox2和Nox4的特异性抑制剂Fulvene-5证实了NADPH氧化酶在肾成纤维细胞对HG反应中的作用(23). 数据表明，用DPI或Fulvene-5预处理可阻断HG介导的WT肾成纤维细胞肥大，证实NADPH氧化酶在HG反应中发挥中心作用。接下来，在HG处理48小时后评估ROS的生成。图3B类显示HG诱导细胞ROS显著增加，DPI可抑制ROS。此外，用Fulvene-5靶向Nox2和Nox4也能减弱ROS的生成，表明Nox2/Nox4诱导足以应对HG介导的氧化应激。因此，我们检查了CnAβ和Nox是否在一个共同的信号通路中合作。首先，比较WT和CnAβ对HG处理48小时产生的ROS的反应^−/−细胞。图3C类表明CnAβ的缺失降低了基底细胞ROS，并阻止了HG介导的ROS生成。与这些一致在体外研究结果表明，小鼠肾脏的基础活性氧降低(图3D类). 这些结果表明，CnAβ也是Nox的上游体内.

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图3。

Cn和NADPH氧化酶参与细胞肥大和ROS生成。 A类在添加NG或HG 48小时之前，通过评估蛋白质/DNA比率，在用DMSO（对照）、DPI或富尔烯-5预处理30分钟的WT肾成纤维细胞中测量肥大。所示数据为平均值±S.E(误差线)相对于对照NG的8个重复/组。**，第页< 0.01.B类在添加NG或HG 48 h之前，用二甲基亚砜（对照）、DPI和富尔烯-5预处理30 min的WT肾成纤维细胞中的ROS生成通过Amplex红试验进行检测。所示数据是相对于对照NG的8个重复/组的平均值±S.E.。**，第页< 0.01; #,第页与对照NG相比<0.05。C类WT和CnAβ中的ROS生成^−/−Amplex Red检测暴露于NG或HG 48 h的肾成纤维细胞。数据显示为12个重复/组的平均±S.E.。***，第页与NG相比<0.001，第页与NG WT相比<0.01。D类，WT中检测到ROS生成(n个=4）和CnAβ^−/−(n个=8）肾脏组织，采用Amplex红试验。所示数据为归一化为mg组织的平均±S.E.。*，第页与WT相比<0.05。铝合金，任意灯光单位。

因此，对WT和CnAβ中Nox亚型的表达进行了研究^−/−细胞。在WT细胞中，HG增加了Nox2和Nox4的表达，但不增加Nox1的表达(图4A类)，与以前的出版物一致(12,24). 有趣的是，CnAβ中基础Nox1上调^−/−细胞，而Nox2和Nox4显著减少。此外，HG对Nox2或Nox4的反应没有增加(图4,B类和C类). 在Nox2和Nox4 mRNA中观察到类似的变化；HG刺激野生型成纤维细胞中的Nox2和Nox4 mRNA，但CnAβ中基础和HG刺激的Nox2和Nox4表达降低^−/−(图4,D类和E类). 在CnAβ的肾脏中，Nox2和Nox4蛋白表达持续降低^−/−老鼠(图4F类). 这些数据表明，CnAβ调节Nox2和Nox4的表达和活性体外和体内.

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图4。

CnAβ调节Nox亚型的表达。 A类检测WT和CnAβ中Nox1、Nox2和Nox4蛋白的表达^−/−NG或HG治疗48小时后通过Western blot检测肾成纤维细胞。所示数据代表了四个独立实验。否2(B类)和Nox4(C类)蛋白质表达通过密度计定量，归一化为WT-NG，并绘制图表。数据为±S.E(误差线)归一化为WT NG.*，第页< 0.05; #,第页< 0.05; ##,第页与WT NG.No2相比<0.01(D类)和Nox4(E类)检测WT和CnAβmRNA表达^−/−qRT-PCR检测成纤维细胞暴露于NG或HG 48 h。所示数据为3-6个重复/组的平均值±S.E.（标准化为WT NG）。*，第页< 0.05; **,第页与NG相比<0.01；#，第页与NG WT相比<0.05。F类，在WT和CnAβ的全肾裂解物中检测了Nox2和Nox4蛋白的表达^−/−Western blot分析小鼠。所示数据代表了四个独立实验。

为了证实CnAβ在Nox2和Nox4上游的作用，用siRNA选择性地敲除WT细胞中的CnAα。图5A类表明si-CnAβ有效地降低了CnAβmRNA，有趣的是，也升高了CnAα，与图1用敲除细胞系。同样，si-CnAβ阻断了HG介导的WT细胞Cn活性激活(图5B类). 用扰乱的si-RNA或si-CnAβ处理的WT细胞暴露于HG 48小时，然后测定蛋白质/DNA比率。图5,C类和D类，表明CnAβ的敲低可减弱HG介导的细胞肥大和ROS生成。最后，si-CnAβ显著降低WT成纤维细胞中的Nox2和Nox4 mRNA(图5,E类和F类). 这些数据证实，CnAβ调节肾成纤维细胞中Nox2和Nox4的表达。

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图5。

CnAβ调节活性氧的生成。 A类用qRT-PCR方法检测了用打乱或CnAβ靶向（si-CnAβ）寡核苷酸转染的WT肾成纤维细胞中CnAα和CnA？mRNA的相对表达。所示数据为平均值±S.E(误差线)一式三份样品。**，第页与加扰相比<0.01。B类si-CnAβ或干扰转染WT肾成纤维细胞暴露于NG或HG 48 h后，Cn酶活性由在体外Cn分析。所示数据为8个重复/组的平均值±S.E.。*，第页与加扰NG相比<0.05；#，第页与加扰HG相比<0.05。C类通过评估蛋白质/DNA比率，在打乱和si-CnAβ转染的WT肾成纤维细胞中测量肥大。所示数据为8个重复/组的平均值±S.E.（标准化为加扰NG）。**，第页与NG相比<0.01。D类Amplex Red检测了暴露于NG或HG 48 h的打乱或si-CnAβ转染WT肾成纤维细胞的ROS生成。数据显示为标准化为打乱NG的8个重复/组的平均±S.E.。*，第页与NG.#相比<0.05，第页与NG WT.Nox2相比<0.05(E类)和Nox4(F类)用qRT-PCR检测打乱或si-CnAβ转染WT成纤维细胞的mRNA表达。所示数据为归一化为加扰NG的三份样品/组的平均值±S.E.。**，第页< 0.01; #,第页与加扰NG相比<0.05。铝合金，任意灯光单位。

CnAβ^−/−细胞对HG的反应受损，Nox2和Nox4的表达减弱。确定Nox2/Nox4是否必修的对于CnAβ介导的HG下游作用，这两种蛋白都在CnAβ中重新表达^−/−细胞。图6,A类和B类，表明脂质内酰胺介导的Nox2或Nox4 cDNA转染增加了CnAβ的基础mRNA表达^−/−细胞。接下来，检测HG介导的肥大和ROS生成。图6,C类和D类，表明Nox2或Nox4的重新表达恢复了HG介导的肥大和ROS生成。

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图6。

Nox2和Nox4介导细胞肥大。Nox2的相对表达(A类)和Nox4信使核糖核酸(B类)在CnAα中测定^−/−肾成纤维细胞转染Nox2或Nox4 cDNA。所示数据为平均值±S.E(误差线)三个独立实验的结果，第页< 0.05; ***,第页与矢量相比<0.001。C类，在Nox2或Nox4转染的CnAβ中测量肥大^−/−肾成纤维细胞通过评估蛋白质/DNA比率。所示数据为归一化为WT NG矢量的三个独立实验的平均值±S.E.。*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001.D类用Amplex Red检测暴露于NG或HG 48 h的Nox2或Nox4转染WT肾成纤维细胞的ROS生成。数据显示为8个重复/组的平均±S.E.。***，第页与NG相比<0.001。铝合金，任意灯光单位。

钙激活Cn导致底物去磷酸化，包括转录因子NFAT家族。以前，NFAT被证明是对肥厚信号的反应而激活的在体外(4,6)和体内(1). 因此，研究了NFAT在CnAβ介导的Nox2和Nox4调控中的作用。首先，在WT、CnAα^−/−和CnAβ^−/−细胞。图7A类表明在WT和CnAα中可以刺激NFAT转录活性^−/−成纤维细胞但对CnAβ无反应^−/−细胞。CnAβ在CnAα中的再表达^−/−成纤维细胞（CnAβ^−/−B） 恢复了NFAT法规。接下来，研究NFAT肽抑制剂VIVIT对肥大和ROS生成的影响。图7B类显示VIVIT足以以剂量反应的方式阻止HG介导的ROS生成。与此一致，VIVIT减弱了HG对Nox2和Nox4 mRNA的诱导(图7,C类和D类). 最后，WT细胞中NFAT显性负向过度表达降低了Nox2和Nox4的表达(图7E类)而NFAT的过度表达增加了表达(图7F类). 这些发现表明，CnAβ通过NFAT调节Nox的表达。

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图7。

CnAβ调节NFAT转录活性。 A类，野生型中的NFAT活性，CnAα^−/−，CnAβ^−/−和CnAβ^−/−使用NFAT反应荧光素酶启动子构建物检测暴露于低或高血清的B肾成纤维细胞。所示数据为平均值±S.E(误差线)每组5个重复。*，第页< 0.05; **,第页与WT对照组相比，P<0.01。B类，通过Amplex Red试验检测用增加浓度的VIVIT肽处理的WT肾成纤维细胞，然后暴露于NG或HG中48 h的ROS生成。数据显示为8个重复/组的平均±S.E.。**，第页与NG.No2相比<0.01(C类)和Nox4(D类)10n对WT肾成纤维细胞mRNA表达的影响米用qRT-PCR检测VIVIT。所示数据为每组三份样品的平均值±S.E.。*，第页与对照组相比<0.05。E类通过qRT-PCR检测载体或NFAT DN转染的WT肾成纤维细胞中的基础Nox2和Nox4 mRNA表达。所示数据为每组三份样品的平均值±S.E.。**，第页与矢量相比<0.01。F类用qRT-PCR检测载体或NFAT转染的WT肾成纤维细胞中基础Nox2和Nox4 mRNA的表达。所示数据为每组三份样品的平均值±S.E.。*，第页与矢量相比<0.05。铝合金，任意灯光单位。

这些实验结果表明，CnAβ被HG选择性激活，并使转录因子NFAT去磷酸化。此外，HG介导的Nox2和Nox4表达以及ROS生成增加需要CnAβ/NFAT(图8). 综上所述，这些数据证明了CnAβ和NFAT在调节Nox介导的活性氧生成中的新作用。由于氧化应激会负面改变肾脏细胞内环境的环境，并增加高血糖诱导的肾脏损伤，因此对该途径的机制进行更多研究至关重要。

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图8。

NFAT在肾脏肥大中介导CnAβ诱导的Nox2和Nox4上调。在肾成纤维细胞中，CnAα具有组成活性，而CnAβ是一种诱导酶，可被HG和其他肥大因子选择性激活。CnAβ去磷酸化NFAT，NFAT转位到细胞核并（直接或间接）诱导Nox2和Nox4的转录。Nox蛋白表达增加导致ROS生成增加和肥大。

讨论

本研究建立在我们先前研究CnAα和CnAβ异构体特异性功能的基础上。我们的研究结果表明CnAα在肾脏发育和功能中起主要作用(25,26). 这与本研究中的数据一致，该数据表明CnAα可能是基础条件下的主要亚型。事实上，CnAα与钙调素的强烈基线关联以及CnAβ与刺激物结合的缺乏变化表明CnA a具有组成性活性。相反，尽管我们之前的数据显示CnAβ没有明显缺陷^−/−肾脏(25)，糖尿病肥大减轻(2)表明CnAβ在肾脏对刺激的反应中起作用。HG刺激下CnAβ与钙调蛋白结合增强，仅表达CnA(图1)与CnAβ是一种诱导酶相一致。

增加了CnAα/CnAβ信号的复杂性，数据表明这两种亚型之间可能存在串扰。例如，图1B类和​和55A类表明当CnAβ缺失或减少时，CnAαmRNA增加。一种可能的机制是通过改变内源性钙调神经磷酸酶抑制剂CBP1/DSCR1的表达，该抑制剂是NFAT的转录靶点。我们的数据可以支持一个模型，即NFAT的损失减轻了CBP1/DSCR1对CnAα的抑制。CBP1/DSCR1的等位基因特异性尚待探索，是未来研究的重要领域。尽管这些数据表明这两种亚型之间存在有趣的相互作用机制，但我们没有发现证据表明CnAαmRNA升高导致基础活性增加。图1,C类和E类在缺乏CnAβ的情况下，酶活性或钙调素结合没有增加。图5B类基础活性略有增加，但变化不显著。这表明，除催化亚单位的表达外，其他因素可能会驱动基础钙调神经磷酸酶活性。由于钙调神经磷酸酶全酶的激活需要催化亚基与调节亚基以及钙调素的相互作用，因此B调节亚基和/或钙调素也可能影响基础活性。

除了进一步明确CnAα和CnAβ在肾脏中的互补作用外，这些数据还表明，CnA？在调节Nox表达和功能方面发挥着以前未知的作用。我们的数据证实了Nox介导的ROS生成在HG细胞变化中的核心作用(图3). HG介导的ROS增加在CnAβ中减弱^−/−细胞，CnAβ中ROS生成减少^−/−肾脏，表明CnAβ是Nox功能的上游在体外和体内。该假设由图4表明CnAβ的丢失与基础Nox2和Nox4的减少以及这两种酶HG诱导的减弱有关。mRNA改变两种蛋白的平行表达，支持转录机制。最后，选择性敲除WT细胞中的CnAβ，再现了Nox表达和HG反应的变化。

数据表明，HG诱导Nox2和Nox4表达需要CnAβ在体外虽然在肥大背景下已经研究了CnAβ下游的许多信号通路，但据我们所知，这是第一次将Nox与Cn作用联系起来。鉴于一致发现，CnAβ在多个组织的肥厚信号中起着不可或缺的作用，因此，CnAβ可能还调节其他器官中的Nox表达和慢性氧化应激。2002年报道的钝性心肌肥大是由于缺乏Nox2/Nox4上调所致，这一推测也很有趣(27)我们小组最近在CnAβ中报告了全肾和肾小球肥大^−/−老鼠(2).

除了将CnAβ确立为Nox2和Nox4的新型上游调控因子外，本研究还将Cn底物NFAT置于该途径中。NFAT的过度表达和抑制调节Nox2，在较小程度上调节Nox4的表达。需要额外的实验来确定NFAT是否直接作用于Nox2和/或Nox4启动子，或者NFAT是否间接作为转录辅因子或通过调节另一个途径发挥作用。例如，NFAT与NFκB一起是Rel转录因子家族的成员。NFκB已被证明调节Nox4(28). 此外，Cn可以去磷酸化IκB(29)为路径之间的串扰提供了额外的途径。这些数据不允许我们得出结论，即Nox4和Nox2是否是并行调节的，或者Nox2是CnAβ/NFAT调节的目标，而Nox2反过来调节Nox4。

该途径有几个有趣的方面值得进一步讨论和调查。首先，有趣的是，CnAβ的结构性损失降低了基础Nox2和Nox4的表达。因为图1表明CnAβ在没有刺激的情况下不具有活性，CnAα可能作为Nox2/4表达的内源性抑制剂发挥作用。支持这一模型的是，CnAβ的siRNA减弱了HG介导的Nox2/4活性上调，但对基础活性氧的影响最小。该模型还可以解释钙调神经磷酸酶抑制剂的观察结果增加Nox2表达体内(30). 如果CnAα具有组成活性，那么钙调神经磷酸酶抑制剂治疗的大多数效果都是由于CnA a的下调。我们还发现CnAα^−/−细胞增加了Nox2和Nox4的基础水平。^三总之，这些数据证实了CnAα和CnAβ可能都参与了Nox表达和ROS产生的调节。最后，数据表明，CnAβ的本构损失也会导致Nox1的增加。这可能是维持细胞活性氧的代偿反应。还需要进行其他实验来确定Nox1上调的机制和意义。

最后，本研究是用自发永生的肾成纤维细胞进行的，这可能是数据的局限性。体内，近端小管上皮细胞是糖尿病肾脏中Nox4最大上调的部位(17). 在一组有限的实验中，我们证实了在CnAβ中Nox4也下调^−/−小管上皮细胞（数据未显示）。然而，由于培养的小管上皮细胞不会对HG产生肥大反应在体外，我们选择研究肾成纤维细胞的信号通路。已报道系膜细胞中Nox4的表达和调节(31)，足细胞(11,32)和致密斑(13,33)表明尽管近端小管中的表达最高，但Nox4的调节在糖尿病肾脏中广泛存在。为了证实我们的发现的相关性，我们还发现CnAβ中ROS和Nox的表达降低^−/−整个肾脏溶解。

尽管靶向Nox4是肾脏中一个有治疗价值的领域，但最近的数据显示，Nox4的构成性丢失实际上增强肾脏疾病(24)强调了对该途径进行额外研究的必要性。CnAβ和NFAT是Nox上游的新参与者，可能提供针对Nox和肥大的额外策略体内.

致谢

参考文献