VII型胶原富含半胱氨酸的区域是一个具有新拓扑结构的胱氨酸结^*

摘要

介绍

胶原蛋白是一类丰富的蛋白质，在生物体内发挥重要功能。因为胶原蛋白是细胞外基质蛋白，它们对组织完整性等功能至关重要(1). 胶原蛋白的一个共同特征是重复的氨基酸基序甘氨酸-X-Y轴，使用X（X）通常脯氨酸和Y（Y）翻译后生成羟脯氨酸。这种独特的氨基酸模式形成了一个左手螺旋，其中三个螺旋形成了右手胶原三螺旋。螺旋可以进一步组装成纤维和/或发生交联事件。原纤维形成后，不同胶原链之间或不同胶原三螺旋之间可能发生分子内交联。交联通过二硫键或赖氨酰氧化酶依赖性方式形成，从而稳定胶原蛋白结构(1).

VII型胶原蛋白（Col7）^三是锚定纤维的主要成分。它将不同的皮肤层、基底层和下面的结缔组织连接在一起，从而提供机械强度(2). 由于Col7基因突变或产生针对Col7的自身抗体，描述了几种相关的皮肤起泡疾病。获得性自身免疫性皮肤起泡病大疱性表皮松解症是自身免疫性炎症的模型系统。获得性大疱性表皮松解症的特征是具有遗传易感性的数据(三,4)和实验小鼠模型(5,6)新陈代谢的变化(7). Col7的遗传缺陷导致皮肤起泡病营养不良大疱性表皮松解症（DEB）。Col7内的大多数突变与肽链过早终止或由于甘氨酸残基的取代而干扰三螺旋结构有关(8).

Col7在原子级的结构信息方面存在基本知识差距。序列比较允许确定域体系结构(9). 大的中央胶原结构域两侧有两个非胶原结构域（NC）。NC1结构域的亚结构域与血管性血友病因子A（vWFA）或纤维连接蛋白III具有同源性，并介导与其他细胞外蛋白如层粘连蛋白332的相互作用(10,–12)以及I型和IV型胶原(10,12,–14)，但也观察到相邻Col7结构域之间的相互作用(15). Col7的重要功能是形成锚定纤维。前胶原VII形成反平行二聚体，通过在三螺旋C末端的两个三螺旋单体之间形成二硫键来稳定二聚体(16). 有趣的是，一个功能未知的富含半胱氨酸的区域位于NC1最后一个亚结构域、vWFA2结构域和三螺旋胶原结构域的过渡处(图1). 这个Col7区域还包含一个罕见的错义突变，位于与DEB相关的Col7三螺旋区域之外。我们推测，这些半胱氨酸通过阻止三螺旋从N末端展开来稳定胶原三螺旋。为了深入了解富含半胱氨酸区域的功能，我们研究了包含该区域的合成肽。CD波谱证实了胶原蛋白三螺旋的形成，根据核磁共振波谱判断，半胱氨酸位于二硫键内。采用分子建模来表征二硫键的不同取向，即不同的胱氨酸结拓扑。富含半胱氨酸的区域代表一种新的胱氨酸结基序，不仅限于Col7。一项基序搜索发现，在软骨、角膜和玻璃体中发现的第九型胶原蛋白（FACIT胶原蛋白家族的一员，即具有间断三螺旋的纤维相关胶原蛋白）具有高度相似的序列(17). 这种新型胱氨酸结位于胶原蛋白的N末端到三螺旋区域，因此可能阻碍胶原蛋白三螺旋的展开。

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图1。

Col7的结构域和研究的肽/结构体。 一，Col7单体有一个中央胶原结构域，其两侧有两个非胶原结构域（NC1和NC2）。b条NC1结构域和胶原结构域之间的过渡区域包含两个半胱氨酸，因此被称为富含半胱氨酸区域。c（c），合成的Col7 THC肽和CysvWFA2 THC肽构建体（小鼠形式）的氨基酸序列包括富含半胱氨酸的过渡区和胶原结构域的N-末端部分。在重组产生的CysvWFA2-THC肽中，该肽与NC1的最后一个亚结构域vWFA2和C末端His标签融合。O（运行）在氨基酸序列中代表羟脯氨酸。人类Col7中已知的隐性错义突变之一是Y1250S（参考文献。37)，人类基因突变数据库中的变异ID：CM014331），对应于小鼠蛋白质中的His-1251。此残留物标记有星号.

材料和方法

结果

为了更好地理解Col7的三螺旋结构和Col7富含半胱氨酸区域的功能，我们结合了CD光谱、分子模型和NMR光谱。

Col7-THC肽形成胶原蛋白三螺旋

通过CD光谱的温度和浓度依赖性验证了Col7-THC肽胶原三螺旋的形成(图2). Col7-THC肽的CD光谱是胶原蛋白三螺旋的典型光谱，在230 nm处具有正带。温度依赖性测量显示出一条S形曲线，拐点为12.6°C，等于Col7-THC肽的熔化温度。熔点与9.7°C的预测值吻合良好(18).¹核磁共振波谱也显示出温度依赖性变化，可以解释为三螺旋的形成(图2d日).

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图2。

一，36μ米样品制备后不同时间点测得的Col7-THC肽溶液。肽溶解后，立即获得CD光谱，在～200 nm处显示负带。通过将温度升高到80°C来展开肽，得到随机线圈结构的典型CD光谱。在4°C孵育1天后，已形成三螺旋。θ_{物料回收仓库}是平均剩余椭圆度。b条230 nm处CD信号的温度依赖性变化允许测定胶原蛋白三螺旋的熔化温度。已确定熔化温度为12.6°C。c（c）胶原三螺旋的形成也是浓度依赖性的。在高肽浓度下，可以在约230 nm处观察到一条正带，这是胶原蛋白三螺旋形成肽的特征。d日，0.72 m的500-MHz一维质子核磁共振谱的详细信息米不同温度下的肽溶液。一些共振显示了温度相关的变化，这些变化代表了三螺旋的展开(例如亮氨酸-28）。这些变化是完全可逆的(黄色曲线).e（电子）位于两个半胱氨酸残基之间的Val-13和Ala-12显示出两组共振。增加5m后米TCEP公司-d日₁₆，有效地减少了二硫键桥，一组信号消失。因此，这些共振对二硫键的形成很敏感。

Col7-THC肽的共振分配

核磁共振实验在8°C（281.2K）下进行，以确保胶原三螺旋的形成。在这个温度下，大约90%的肽是三螺旋形式的。肽必须经过化学合成才能掺入羟脯氨酸残基；因此，¹³C处于自然丰度。采用标准二维实验进行共振分配。由于特殊的氨基酸组成，即～30%的氨基酸是甘氨酸，20%是脯氨酸残基，严重的共振重叠妨碍了完全的共振分配。大约20%的残留物可以被明确识别(表1). 识别出的信号属于三螺旋区内外的残基。这些残基可以用作均匀分布的探针，从而确认CD光谱数据。

表1

Col7-THC肽的明确指定核磁共振共振

数量/氨基酸		化学位移（ppm）
		H（H）N个	α	β	其他
	交流电				中国三组2.025（27.40）
1	阿拉	8.368	4.302 (52.55)	1.354 (19.32)
4	伊利		4.196 (60.78)	1.841 (38.77)	γCH2：1.177和1.470（27.19）
4	伊利				δCH三0.858 (12.76)
4	伊利				γCH三: 0.895 (17.49)
5	谷氨酸				γCH2: 2.291 (35.83)
12	阿拉	（A） 8.557个	（A） 4.316（52.54）	（A） 1.448（20.20）
12	阿拉			（B）一1.357
13	瓦尔		4.042 (62.37)	1.952 (32.26)	（A）一γCH三：0.739（20.86）和0.812（20.47）
13	瓦尔				（B） γCH三：0.758（20.87）和0.837（20.46）
14	伊斯		4.658 (56.01)	3.084 (30.80)	δH:7.30（119.97）
14	伊斯				ϵ高：7.922（138.21）
27	格莱		3.979 (44.40)
28	卢	8.286	4.351 (55.67)	1.604 (42.35)	γCH:1.602（26.96）
28	卢				δCH三：0.868（23.34）和0.920（24.98）
43	提尔		4.402 (59.23)	2.867和3.101（39.48）	δCH:7.108（133.38）
43	提尔				ϵ信道：6.809（118.05）

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^一残留物显示出两组共振。

Col7四氢大麻酚肽的核磁共振波谱

通过CD光谱测定，Col7四氢大麻酚肽形成的三螺旋的熔点为12.6°C。与温度相关的核磁共振实验显示了与该值相符的转变(图2d日). 例如，随着温度的升高，Leu-28侧链的共振信号强度增加。这些光谱变化是可逆的。

细胞外基质以氧化环境为特征，观察到二硫键，例如III型胶原蛋白由胱氨酸结稳定(27). 该肽由游离巯基合成。半胱氨酸残基Cβ的共振特征随着时间的推移而消失，很可能形成二硫键。Val-13的两组共振观察支持了这一假设。Val-13接近肽的半胱氨酸残基，位于三螺旋区之外。由于温度依赖性实验表明Val-13没有差异，因此可以排除三螺旋形成的原因(图2d日). 相反，添加TCEP后，Val-13的特征共振消失，表明半胱氨酸确实正在形成二硫键。对于Ala-12的甲基，观察到了相同的变化。由于Val-13观察到两组共振，但游离半胱氨酸的Cβ没有峰值，我们假设一组共振属于链间二硫键，另一组属于链内氧化分子，这得到了III型胶原蛋白胱氨酸结模型肽研究的支持，报告了空气氧化后同源三聚体的70%产率(27).

在非还原条件下对核磁共振样品中的肽进行SDS-PAGE分析，发现在还原条件下没有主带(图3一). 肽是还原条件下的单体，在染色过程中可能会从凝胶中扩散出来。在氧化条件下，存在链间二硫键，可以检测到分子量较高的低聚物。由于已知肽在SDS-PAGE分析中可能具有非常不寻常的行为，因此不能根据表观分子量来描述齐聚状态。

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图3。

一，1.4米的SDS-PAGE（4–20%）分析米Col7-THC肽溶液。氧化条件下存在主带，但还原条件下不存在主带。表观分子量不能用来得出低聚状态的结论，因为肽在SDS-PAGE中可能具有不寻常的行为。b条SDS-PAGE（4–20%）分析显示CysvWFA2-THC肽的三聚体形成。在添加谷胱甘肽后，在更高的分子质量上观察到了几个额外的谱带。第3天和第6天的样本显示存在三聚体(T型)，二聚体(D类)、和单体(M（M）). 在0小时和第6天采集的样品也在还原条件下在SDS-PAGE中进行了分析。CysvWFA2-THC肽浓度为10μ米，每孔样品装载量为7.5μg CysvWFA2-THC肽。c（c），CysvWFA2样品的SDS-PAGE显示在添加氧化谷胱甘肽后形成低聚物(D类*,T型*)，但在孵育3天后，只出现与单体对应的条带。表观分子质量为15kDa的CysvWFA2带代表分子内二硫键(M（M）_我). 由于较高分子质量的带与还原蛋白的高度相同，因此该带归因于与谷胱甘肽两个分子相连的CysvWFA2(M（M）_第二组). 用20μ米CysvWFA2溶液。每个孔加载8μg CysvWFA2。

CysvWFA2和CysvFFA2-THC肽的纯化

表达结构的N末端半胱氨酸会导致大肠杆菌因此，通过几丁质结合域进行亲和纯化是不可能的。必须制定新的净化方案。

CysvWFA2通过初始硫酸铵沉淀、阳离子交换色谱和最终尺寸排除色谱成功纯化。通过多组氨酸标签亲和层析纯化CysvWFA2-THC肽；然而，SDS-PAGE中还存在其他几个蛋白带。随后在pH 6下通过阳离子交换色谱进行纯化（CysvWFA2-THC肽的理论pI为7.36）。在pH值为6时，标签的组氨酸侧链有一半被质子化。由于三螺旋的形成（蛋白质在4°C下纯化），三个组氨酸标签在空间上很接近，并形成一个带正电荷的区域，从而导致洗脱蛋白质所需的意外高盐浓度（参见补充图1).

CysvWFA2-THC肽形成链间二硫键

CysvWFA2-THC肽中链间二硫键的形成和随后的SDS-PAGE应提供准确的齐聚状态。此构造的SDS-PAGE行为主要取决于vWFA2域。在37°C下还原CysvWFA2-THC肽的半胱氨酸。在这个温度下，胶原蛋白三螺旋被分解。将温度降至4°C可形成三螺旋。向样品中添加氧化的谷胱甘肽会去除剩余的还原剂TCEP，CysvWFA2-THC肽的半胱氨酸被氧化，从而形成链间二硫键(图3b条). 在开始时，也观察到了较高分子量的物种；然而，最终在SDS-PAGE中出现了一条具有三聚体分子量的带，证明了半胱氨酸形成链间二硫键。空气氧化形成二硫桥的效率很低，4天后只能观察到极少数三聚体（参见补充图2).

vWFA2结构域包含两个半胱氨酸，它们分别位于N和C末端，并已被证明形成二硫键(15). 为了排除这些半胱氨酸导致的低聚物的非特异性形成，CysvWFA2被纯化，半胱氨酸被还原和氧化。SDS-PAGE分析显示，在氧化反应开始时，分子量对应于二聚体和三聚体，但也存在一个分子量为四聚体的非常弱的带。这些带消失，因此代表低聚物的非特定形成。3天后，保留了两条带，分别与谷胱甘肽和带有分子内二硫键的CysvWFA2分子相连。具有分子内二硫键的CysvWFA2的表观分子质量为15 kDa(图3c（c）).

胱氨酸结的分子模型

采用分子模型研究是否优选某些胱氨酸拓扑结构。在构建八个理论上可能的胱氨酸结之前，将Col7-THC肽三螺旋部分的模型能量最小化。分子模型表明，所有拓扑结构基本上都是允许的，但它们的最小能量不同(图4). 五个模型显示胶原蛋白三螺旋内的曲率。对于一半的模型，胶原蛋白三螺旋保持不变。在模型VII中，胶原三股螺旋的一股被移出，形成一个短的β折叠片。在能量最高的模型VI中，两个二硫键桥的二面角非常大，与通常发现的大约90°的值有很大偏差(28). 在能量第二高的模型II中，胱氨酸结中的链相互交错。与其他模型相比，两个模型，即模型I和II，具有相当低的能量。模型如下所示补充文件2（所有型号概述）。

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图4。

一，在引入所有八种可能的二硫键桥模式之前，生成了Col7-THC肽的三螺旋区模型。模型中的三条胶原链被称为前链、中链和后链（比较参考文献。42).b条八种模型的二硫模式和二硫桥的二面角。示意图见补充信息.A类,B类、和C类是不同的股，以及1和2分别参见Cys-1248和Cys-1252。c（c）图中显示了符合模型I、II和III的胱氨酸结。三螺旋肽概述见左侧，胱氨酸结的放大图显示在右侧。二硫模式的示意图如所示底部从八个可想象的拓扑结构中，五个模型显示了模型I到模型III所描述的曲率。

胱氨酸结被保留，IX型胶原中也存在一致序列

数据库搜索显示，IX型胶原蛋白（Col9）也有这个胱氨酸结共识序列，该序列是胶原蛋白三螺旋的N末端(图5). 不同物种的Col7以及Col7和Col9的序列比较显示了一个保守的CX（X）_三CP图案。

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图5。

Col7富含半胱氨酸区域的多序列比对(一)和具有不同Col9亚型的小鼠/人类Col7(b条)相对于CX（X）_三CP图案。 下划线的序列属于三螺旋结构域。O（运行）代表羟脯氨酸，但为了清楚起见，在Col9序列中省略。

讨论

Col7是真皮-表皮结合处发现的锚定纤维的主要成分。锚定纤维连接表皮和真皮，功能受损会导致皮肤起泡。一个功能未知的富含半胱氨酸的区域位于N末端NC1结构域和中央胶原三螺旋的过渡处。通过CD光谱、核磁共振光谱和分子模拟相结合的方法研究了从富含半胱氨酸区域衍生的模型肽。CD光谱证明模型肽能够形成胶原三螺旋。核磁共振数据表明，位于三螺旋外的残基在半胱氨酸还原后发生化学位移变化，从而假设半胱氨酸参与了胱氨酸结的形成。在富含半胱氨酸区域、之前的vWFA2结构域和之后的Col7三螺旋结构域的肽的融合构建中，半胱氨酸的完全还原和二硫键的重组显示出三聚体的形成，证明该富含半胱蛋白的区域代表了一个新的胱氨酸结。胱氨酸结的一致序列可在第9列中找到。对于分离的Col9，推测这些半胱氨酸由于对胃蛋白酶切割的抗性而形成链间二硫桥(29)表明胱氨酸结的相关性体内理论上可能的胱氨酸结拓扑的分子模型表明，所有八种连接性都是允许的。不同的模型在能量上是不同的，有两种模型受到青睐。未来的研究将致力于获得胱氨酸结的高分辨率结构信息，并且将非常有兴趣了解这两种拓扑结构是否真的出现在Col7中。

胶原三聚体的形成发生在细胞内。研究表明，I型胶原蛋白在低于体温时也会发生三股螺旋的融化(30)伴侣是胶原蛋白成熟所必需的(31). 三体化域确保形成三螺旋。这些结构域通常位于胶原蛋白的C末端(32). 如III型胶原（Col3）或XIX型胶原（Col19）所示，形成的三股螺旋由C末端胱氨酸结稳定(27,33,34). 最近对Col3胱氨酸结进行了结构表征(35)也是启动三螺旋形成所必需的(36). 然而，只有当胱氨酸结位于胶原蛋白三螺旋的C末端时，它才能正确形成(27). 如果半胱氨酸位于胶原蛋白螺旋的N末端，则实际上不会形成胱氨酸结(27). 有趣的是，在Col7中发现的胱氨酸结是胶原螺旋的N末端。三种氨基酸位于半胱氨酸之间，似乎为胱氨酸结的形成提供了必要的立体要求。在Col7中，vWFA2亚结构域位于胶原结构域之前，vWPA2与其他胶原相互作用。我们假设Col7胱氨酸结阻止胶原蛋白三螺旋从N末端区域展开，并且该结与Col3的胱氨酸结一样不参与三螺旋形成。Col7的胶原蛋白三螺旋显示出多重中断，13G后第一个中断XY公司三胞胎。这些中断指向锚定纤维所需的灵活性。因为去折叠会损害Col7对皮肤稳定性的重要功能，所以胱氨酸结会阻止去折叠。C类X（X）_三CP胱氨酸结仅位于胶原三螺旋的N-末端，如Col9和Col7所示。

DEB是由Col7基因突变引起的。大多数突变是翻译过程中过早终止导致Col7分子截短的原因(8). Col7中只存在少数错义突变；它们大多位于三螺旋区内，是甘氨酸取代基。这些突变可能影响三螺旋的折叠和/或位于相互作用蛋白质的结合位点内。有趣的是，在从非胶原结构域1到三螺旋胶原结构域的过渡处存在隐性错义突变。再加上胶原蛋白域的突变，导致指甲营养不良、萎缩性瘢痕和一些大水疱(37). 由于胶原蛋白的三聚体形成发生在细胞内，这种突变可能影响胱氨酸结的形成。为了了解突变的结构影响，重要的是要知道Col7基因的表达是否具有等位基因特异性。这些知识对于DEB未来的治疗和更好地了解疾病表现也非常有价值。大多数真核基因表达不具有等位基因特异性(例如参考文献。38和39). 如果细胞中Col7的表达不是等位基因特异性的，那么细胞中就会形成胶原三聚体的混合物，其中含有不同数量的突变链。不同的三聚体可能表现出不同的稳定性和/或分泌特性。因此，与患者皮肤中的野生型分子相比，观察到的突变型Col7分子分泌的差异可能仅由Col7三聚体的亚群引起。这使得基于突变Col7 mRNA等位基因特异性抑制的某些类型DEB的治疗策略非常有趣(40). 如果Col7的表达是等位基因特异性的，那么细胞中只有一个等位基因会被转录。在这种情况下，我们可以预期两类Col7分子，即正常的Col7三聚体和突变的Col7基因的同源三聚体。一例DEB患者的病例报告支持Col7的等位基因特异性表达，因为所有mRNA转录物都来自一个等位基因(41). 因此，取决于Col7基因在生物体中的表达情况，胱氨酸结中的错义突变可能不仅影响胱氨酸结的形成，还可能导致不同的胱氨酰结拓扑。

Col7富含半胱氨酸的区域形成了一个新颖拓扑的胱氨酸结。胱氨酸结具有一致的C序列X（X）_三CP也可在第9列中找到。胱氨酸结的鉴定不仅为更好地理解Col7中的胶原三螺旋稳定提供了基础，还为在不需要C末端胱氨酸结的胶原模型肽中引入N末端胱氨酸结开辟了可能性。

补充材料

鸣谢

参考文献