培养皮层和海马神经元中不同亚单位特异性α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体贩运机制对氧和葡萄糖剥夺的反应^*♦

摘要

介绍

AMPA受体²介导大脑中大多数快速突触兴奋，AMPAR运输的精确调节对于兴奋性神经传递、突触可塑性以及随后在学习和记忆过程中形成适当的神经回路至关重要(1,2). AMPAR是亚基GluA1–4的四聚体组合，绝大多数含有GluA2，它使AMPARs Ca²⁺-不透水的(三,4). 这是维持适当低细胞质钙的关键因素²⁺基础突触传递过程中的浓度。然而，少量GluA2标记的Ca²⁺-可渗透性（CP-）AMPAR存在，在静息状态下大多数突触不表达。精确调节它们的突触表达可使有益的钙²⁺信号事件，但这些过程的失调可导致CP-AMPAR的突触结合延长，导致钙过量²⁺流入。这会导致许多疾病中的突触功能障碍和细胞死亡（兴奋毒性），包括脑缺血、创伤性脑损伤和亨廷顿病等慢性疾病(三,–5).

当大脑的血液供应中断时，例如中风后闭塞或心脏骤停，就会发生脑缺血。缺血期间发生的缺氧缺糖（OGD）会使细胞面临极端的代谢应激。在神经元中，这会导致跨膜离子梯度的破坏，导致去极化，从而导致谷氨酸的大量突触释放。此外，谷氨酸再摄取机制受到转运蛋白逆转的影响(6). 大脑兴奋性突触处谷氨酸受体的过度激活会导致脆弱神经元的兴奋毒性，导致细胞延迟死亡(7). 延迟性神经元死亡的一个重要方面是再灌注造成的损伤（损伤后神经元恢复氧气和葡萄糖）。因此，缺血事件期间和之后的凋亡事件可能会影响神经元群体(8).

全脑缺血后，大脑的特定区域显示出比其他区域更大的神经元损伤，这表明导致细胞死亡的不同机制是对侮辱的反应。海马CA1亚区的锥体神经元最脆弱，而CA3锥体神经元具有抵抗力(9). 虽然皮质锥体神经元受到缺血的影响，但它们比海马CA1中的神经元更容易受到损伤(10).

以前的研究表明，细胞内钙的差异²⁺加载可能是这种选择性漏洞的一部分，但导致这种差异的机制尚不清楚(11). 定义这些过程可能会导致新的治疗策略，其基础是操纵易受伤害的神经元群体，以抵抗缺血细胞死亡。

引起兴奋性毒性的主要途径是钙²⁺通过NMDAR流入，从而触发许多信号通路(11,12). 在海马CA1神经元中，这些包括突触AMPAR亚单位组成的变化，导致GluA2标记的CP-AMPAR的表达(13,14). 这导致钙²⁺导致细胞死亡延迟数小时到数天的涌入(15). 这是一个两阶段的过程，初始快速转运阶段涉及NMDAR刺激的、依赖PICK1的GluA2亚单位从质膜内化(16,17)以及GluA2亚单位mRNA表达降低的后期(18,19).

因为GluA2依赖性AMPAR转运是导致OGD诱导海马神经元神经元死亡的重要事件(17)，我们调查了不那么脆弱的神经元群体是否表现出不同的贩运模式，这可能会导致不同程度的易受侮辱性。我们在这里显示，GluA1在皮层和海马神经元对OGD的反应中迅速插入质膜。然而，与海马神经元相比，培养的皮层神经元中GluA2的运输不受OGD的影响。

实验程序

结果

以前有人认为，在整体缺血模型中，皮层神经元比海马CA1神经元更容易受到损伤体内(10). 为了比较OGD激活的细胞生物学机制，我们使用分离的海马或皮层培养物。作为CA1神经元的模型，分离海马培养物中的突触可塑性机制被广泛研究，因为海马培养物显示出与切片中的CA1神经元惊人的相似细胞生物学特性(21). PI染色显示海马神经元比皮层神经元更容易受到OGD暴露20分钟的影响(图1). 损伤后恢复正常培养基后24、48或72小时，皮层培养物中PI染色无明显增加。相反，海马培养物在48小时和72小时的时间点显示PI染色显著增加，表明神经元死亡延迟。此外，使用LDH释放试验作为分析细胞死亡的替代方法也获得了类似的结果(图2). 这些结果与全脑缺血后海马CA1和皮层神经元细胞死亡模式的报道一致体内(10)，并表明这些培养系统是研究不同缺血易损性机制的合适模型。

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图1。

碘化丙啶染色显示，培养的海马神经元比皮质神经元更容易受到OGD的影响。将培养的神经元暴露在OGD中20分钟，然后按规定的时间恢复到正常生长培养基。通过PI染色定量细胞死亡(红色). 培养物也进行MAP2染色(蓝色)作为神经元树突的标记物。在恢复正常培养基后的0、24、48和72小时，显示了皮层培养物和海马培养物的典型共焦图像。图表显示了与对照组相比，PI阳性细胞的合并平均计数。*，第页< 0.05, **,第页<0.01，采用Dunnett校正的单向方差分析，用于与单个对照组进行多次比较（时间点0）。n个=每种培养类型3个独立实验。数据为平均值±S.E。

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图2。

LDH释放测定显示，培养的海马神经元比皮层神经元更容易受到OGD的影响。将培养的神经元暴露于OGD 20分钟，然后在规定的时间内恢复正常生长培养基。细胞死亡通过LDH释放试验进行量化。图中显示了通过分光光度计读数在492 nm处量化的LDH释放，并将其归一化为对照。n个= 9, *,第页< 0.05. 数据为平均值±S.E。

为了分析培养神经元中AMPAR亚单位的表面表达，我们使用了表面生物素化分析。使用这项技术，我们先前表明OGD会导致海马神经元表面GluA2的减少(17). 为了比较海马和皮层神经元的等效贩运事件，我们将培养的神经元暴露于OGD，并在损伤后立即分析表面蛋白。与我们之前的结果一致，20分钟的OGD导致海马神经元表面GluA2显著降低(图3A类). 相反，同样的OGD损伤对皮层神经元表面GluA2水平没有影响(图3A类). 我们还分析了OGD后GluA1的表面水平。如前所示，在海马神经元中，GluA1表面表达没有总体变化(17). 相反，OGD导致皮层神经元中GluA1表面表达显著增加(图3B类).

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图3。

OGD导致海马和皮层神经元表面表达的AMPAR亚基发生明显变化，在恢复正常生长介质后持续存在。 A类，GluA2亚单位在海马神经元对OGD的反应中从质膜内化，但在皮层神经元中不受影响。将培养的神经元暴露在OGD中20分钟，并进行表面生物素化。OGD后，有代表性的Western blot显示表面（生物素化）和5%的总GluA2存在于裂解物中。β-肌动蛋白作为负荷控制。该图显示了表面与总GluA1比率的合并平均数据，以控制百分比表示（无OGD）。n个= 7, *,第页<0.05（学生的t吨测试）。数据表示为平均值±S.E。B类，GluA1亚单位表面表达在皮层神经元中随着OGD的反应而增加，但在海马神经元中不受影响。培养的神经元按A处理，但用斑点检测GluA1。n个= 7, *,第页<0.05（学生的t吨测试）。数据表示为平均值±S.E。C类，OGD诱导的GluA2表面表达变化在损伤后持续3 h。将培养的神经元暴露于OGD中20 min，并在返回条件生长培养基后3 h进行表面生物素化。OGD后，有代表性的Western blot显示表面（生物素化）和5%的总GluA2存在于裂解物中。β-肌动蛋白作为负荷控制。该图显示了以控制百分比表示的表面与总GluA1比率的汇总数据（无OGD）。n个= 7, *,第页<0.05（学生的t吨测试）。数据以平均值±标准误差表示。D类，OGD诱导的GluA1表面表达变化在损伤后持续3 h。培养的神经元按照A类，除了在印迹中探测GluA1。n个= 7, **,第页<0.01（学生的t吨测试）。数据表示为平均值±S.E。

在其他一些系统中，如海马LTP，突触CP-AMPAR的存在是暂时的，CP-AMPARs后来被CI-AMPAR取代(22,23). 为了研究OGD诱导的表面表达AMPAR亚单位快速变化的持续性，培养物暴露在OGD中20分钟，然后在损伤后转移到正常条件生长培养基中3小时。在正常培养基中孵育3小时后，皮层和海马培养物显示出OGD诱导的表面表达AMPAR亚基变化的相同模式(图3,C类和D类). 这些结果表明，OGD诱导的AMPAR表面表达的变化是稳定的，并且在两种神经元类型的损伤终止后仍保持良好。

在海马神经元中，OGD诱导的AMPAR转运依赖于NMDAR(17). 为了研究NMDAR依赖机制是否在皮层神经元中发挥作用，我们在NMDAR拮抗剂AP5存在的情况下进行了表面生物素化实验。图4显示AP5完全阻止OGD诱导的表面GluA1的增加，这表明尽管皮质神经元与海马神经元的亚单位特异性转运模式不同，但两者都涉及NMDAR依赖的上游机制。

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图4。

在NMDAR拮抗剂AP5的存在下，OGD诱导的皮层神经元表面GluA1的增加被消除。皮质神经元被视为图3B类，但在OGD前5分钟施用AP5除外(n个= 9). 数据表示为平均值±S.E。

为了研究海马和皮层神经元中CP-AMPAR表达的动态贩运事件，我们在实时成像实验中使用SEP标记的AMPAR亚单位(24). pHfluorin是GFP的一种对pH敏感的变体，在酸性pH下会被猝灭。因此，在质膜上表达的SEP标记的受体暴露于中性pH值下并发出明亮的荧光，而那些位于内体或运输囊泡的酸性环境中的受体则显示出显著降低的荧光(25). 表达SEP-GluA2的海马神经元对OGD的反应显示荧光显著降低，表明OGD诱导的GluA2从质膜快速内吞，这在含有葡萄糖和氧气的介质再灌注后持续(图5A类). 相反，在整个实验过程中，SEP-GluA2表达的皮层神经元的荧光没有变化，这表明GluA2的运输不受皮层神经元OGD的影响(图5B类). 有趣的是，OGD诱导的SEP-GluA1荧光变化在海马和皮层神经元中相似，两种神经元类型的荧光都显示出微小但显著的增加，这表明OGD导致GluA1在质膜上的插入(图6,A类和B类).

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图5。

SEP-GluA2在海马神经元对OGD的反应中迅速内吞，但在皮层神经元中不受影响。 A类在持续灌注下对表达SEP-GluA2的海马神经元进行实时成像，并暴露于OGD 20分钟，然后用含有正常葡萄糖和氧气的缓冲液进行再灌注。显示了时间进程的典型共焦图像。该图显示了OGD和再灌注期间海马神经元SEP-GluA2表面表达对应的荧光变化的汇总数据。将手术后20、30、40和50分钟的时间点与平均控制时间点（从0到10分钟）进行比较。n个= 7, *,第页< 0.05, **,第页< 0.01, ***,第页<0.001（学生的t吨测试）。数据表示为平均值±S.E。B类，皮质神经元按A处理。n个= 7. 数据表示为平均值±S.E。

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图6。

SEP-GluA1被插入质膜以响应皮层和海马神经元中的OGD。 A类在持续灌注下对表达SEP-GluA1的海马神经元进行实时成像，并暴露于OGD 20分钟，然后用含有正常葡萄糖和氧气的缓冲液进行再灌注。显示了时间进程的典型共焦图像。该图显示了与SEP-GluA1表面表达相对应的荧光变化的汇总数据。学生的t吨测试用于比较OGD后的时间点（20和30分钟）和平均控制时间点（0到10分钟）。n个= 11, *,第页< 0.05. 数据表示为平均值±S.E。B类，皮质神经元按A处理。n个= 10, *,第页< 0.05. 数据表示为平均值±S.E。

讨论

我们的结果表明，在海马神经元中，OGD刺激GluA2驱动的AMPAR从质膜快速内吞，并伴随GluA1从细胞内室插入质膜。由于OGD不会导致海马神经元中GluA1表面水平的整体变化，这表明在自然系统中，内吞的GluA2以GluA1/2异构体的形式存在，并且内化的GluA1通过GluA1驱动的GluA2-lacking AMPAR在质膜上的胞吐来平衡。胞吐的AMPAR可能是GluA1同源体或GluA1/3异质体(16,26). 相反，皮层神经元表达一种更简单的贩运事件模式，即GluA2依赖性贩运完全不受OGD暴露的影响。虽然海马神经元表面GluA2的丢失在恢复到正常培养基后至少持续3小时，但皮层神经元表面GluA2的稳定性在再灌注后也得到了类似的维持，这进一步证明了GluA2依赖性AMPAR转运在皮层神经元中不受影响的结论。

许多特定形式的突触可塑性涉及突触质膜上CP-AMPAR的表达(4)例如，外侧杏仁核的恐惧条件反射(27)腹侧被盖区药物成瘾(28)和海马CA1 LTP，取决于发育阶段或诱导方案(22,29,30). 在恐惧条件反射和药物成瘾中，CP-AMPAR表达的增加是逐渐增加的，需要几个小时才能建立(27,28). 相反，海马LTP涉及到GluA1在质膜上的快速插入，在刺激后可立即检测到，这与我们最初接触OGD后观察到的贩运类似(22,23). 与LTP相关的表面GluA1的增加在LTP诱导后的前10–20分钟以GluA2标记的CP-AMPAR的形式出现，随后被CI-AMPAR取代(22,23,31). 尽管我们没有观察到亚单位特异性表面表达的这种重置，但至少在受辱后3小时内，此处描述的OGD诱导的GluA1在皮层和海马神经元中的前向运输可能与LTP的机制相似。需要进一步研究以阐明所涉及的精确信号机制和蛋白质相互作用网络。

尽管皮层神经元损伤后至少3小时内内源性表面GluA1的稳态增加持续存在，但我们的实时成像实验表明，在用常氧含糖介质再灌注后，表面没有保持SEP-GluA1同源物。这种差异的一个可能解释是，内源性GluA1与GluA3处于异聚复合物中，GluA3-介导CP-AMPAR的持续表面表达。另外，SEP-GluA1的过度表达可能会使表面受体的保留机制饱和，因此一旦消除了向前交通的驱动力，表面受体数量的增加就不会保持。相反，在生物素化分析和实时成像实验中，OGD诱导的海马神经元GluA2内化在恢复到正常培养基后持续存在。这表明GluA2要么保留在再循环内体系统中，要么更有可能最终以溶酶体降解为目标。全脑缺血后海马CA1中GluA2的总表达因mRNA表达减少而降低(18,19). 然而，溶酶体靶向也可能影响OGD后GluA2的总水平。

我们的结果表明，在皮层神经元中，CP-AMPAR被添加到表面AMPAR的现有补充中，而在海马神经元中，CP-AMPAR取代了通过GluA2内吞作用内化的CI-AMPAR。我们之前证明PICK1依赖性GluA2内化是OGD诱导海马神经元细胞死亡的关键上游成分(17). 我们在此提供的新数据表明，GluA2的贩运不受皮层神经元OGD的影响。因此，皮层神经元对OGD的抵抗力更大，至少可以部分解释为OGD诱导的神经元死亡缺乏这一关键特征。由于突触处的CP-AMPAR掺入有望成为OGD诱导的神经元死亡的关键事件，因此CI-AMPAR内化的确切作用尚不清楚。一种可能的解释是，含有GluA2的CI-AMPAR必须从突触中移除，以释放CP-AMPAR的“插槽”。研究表明，OGD导致海马神经元中AMPAR兴奋性突触后电流的整流迅速增加，表明CP AMPAR的突触表达(17). 然而，据我们所知，在OGD期间或之后，皮层神经元突触上CP AMPAR的动态表达尚未报道。“缝隙假说”表明，PSD95-TARP复合体在突触上保持一定数量的AMPAR位置（缝隙），为了增加突触AMPAR的数量，缝隙的数量也必须增加(32). 虽然OGD诱导的皮层神经元AMPAR转运可能与LTP有一些共同的特征，但尚不清楚在损伤后突触AMPAR槽是否增加。LTP诱导后，GluA1被插入突触外部位的质膜中，随后在质膜平面的横向运动后并入突触(33,34). 据推测，OGD也会导致GluA1突触外插入。如果AMPAR的可用突触槽数量没有增加，那么插入质膜的CP-AMPAR可能无法有效地并入突触。在海马神经元中，CI-AMPAR的内化导致许多缝隙变得可用，从而允许CP-AMPAR在突触处并入。

总之，这项工作表明GluA2特异性AMPAR转运机制可能是控制神经元对脑缺血敏感性的合适治疗靶点。

致谢

参考文献