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生物化学杂志。2014年2月21日；289(8): 4600–4625.
在线发布2014年1月8日。 数字对象标识：10.1074/jbc。M113.538215型
预防性维修识别码：PMC3931022型
PMID：24403063

游离结合蛋白2（Ranbp2）脯氨酸异构酶或伴侣活性的差异丢失揭示了其亲环蛋白结构域在蛋白质沉积中的独特生理作用*

Kyoung-in Cho公司,‡,1 Hemangi Patil公司,‡,1 尤金·森达,‡,2 杰西卡·王,‡,2 易海清（Haiqing Yi）,‡,三 Sunny邱,‡ 杜苏克·尹,‡ 俞敏忠,§ 安德鲁·奥里, 尼尔·S·皮奇,§‖**和保罗·费雷拉‡,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

背景：亲环素对生理底物具有不明确的伴侣和脯氨酰异构酶活性。

结果：Ran-binding protein 2（Ranbp2）亲环素结构域的伴侣蛋白或脯氨酰异构酶活性的非重叠缺失会引起不同细胞类型和泛素蛋白酶体系统中独特的蛋白质稳态损伤。

结论：Ranbp2亲环蛋白亚结构域对底物或泛素-蛋白酶体系统的调节具有鉴别生理活性。

意义：发现了Ranbp2介导的蛋白质平衡中与生理和治疗相关的机制联系。

关键词：伴侣-伴侣蛋白，酶类，蛋白酶体，蛋白质错误折叠，泛素化

摘要

免疫亲环素催化肽基顺-反式脯氨酸异构化（PPIase）是蛋白质折叠中的一个速率限制步骤，也是蛋白质功能中的一种构象转换。亲环素也是伴侣。非催化突变仅影响已知但不同生理底物的亲环素果蝇属NinaA及其哺乳动物同源物亲环素B分别损害视蛋白的生物生成并导致成骨不全。然而，大多数亲环素的生理作用和底物仍然未知。还不清楚PPIase和伴侣活性是否反映出明显的亲环蛋白特性。为了阐明潜在亲环素功能引起的生理特性，我们构建了缺乏内源性Ran-binding蛋白-2（Ranbp2）的小鼠，并用受损的C末端伴侣表达Ranbp2的细菌人工染色体(Tg-Ranbp2水处理-HA)或没有PPLase活动(Tg-Ranbp2R2944A-HA型). 转基因株系在蛋白质平衡方面表现出独特的效果。任何一条线在M-opsin生物发生中都存在选择性缺陷，其在锥体光感受器中积累和聚集，但对两个新的Ranbp2亲环素伙伴，即细胞因子反应效应器STAT3/STAT5，没有蛋白质静态损伤。应力诱导的STAT3激活在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−相反，蛋白质组学分析发现，多系统蛋白病/肌萎缩侧索硬化蛋白、异质核核糖核蛋白A2/B1仅在转录后表达下调Tg-范围2R2944A-HA型::跑步2−/−这伴随着双泛素和泛素化蛋白的年龄和组织依赖性减少，双泛素化活性增加，26 S蛋白酶体亚单位S1和S5b的积累。这些表现在另一行中是不存在的，Tg-范围2CLDm-HA公司::跑步2−/−在Ranbp2亲环素样结构域中含有SUMO-1和S1-结合突变。这些结果揭示了PPIase和Ranbp2亲环素的伴侣蛋白活性之间的独特机制和生物学联系，以促进选择性底物的蛋白质平衡，并具有新的治疗潜力。

关键词：伴侣-伴侣蛋白，酶类，蛋白酶体，蛋白质错误折叠，泛素化

介绍

肽基顺-反式-脯氨酰异构化是蛋白质折叠中的一个速率限制步骤(1,–三). 催化作用顺-反式肽基脯氨酰催化肽基脯氨酸异构体的相互转化顺-反式异构酶5(4,–6). PPI酶由三个结构无关的蛋白质家族组成，即亲环蛋白（CyP）、FK506结合蛋白（FKBP）和小病毒蛋白(7). CyPs和FKBP也被指定为免疫亲和素，因为它们介导免疫抑制(8,9). 这种作用是通过免疫抑制代谢物环孢素a（CsA）或FK506与PPIase活性位点结合并与丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、钙调神经磷酸酶、，其隔离和抑制阻止去磷酸化和激活核因子以激活T细胞(9,–12). 然而，随后的研究表明，免疫亲和素和主要细胞CsA靶点亲环素A（CyPA/PPIA）的PPIase活性也有助于CD4的免疫调节特性+通过以下途径负调控Itk激酶的T细胞顺-反式脯氨酸在其Src同源2结构域中的异构化(13,14). 脯氨酸异构体的亲免疫介导构象开关对蛋白质活性的调节(15,16)先前和随后的研究也发现，不同的免疫亲和素可以促进底物与蛋白质或DNA伴侣的结合(17,–19)低聚物复合物的形成(20)或受体和通道活动的调节(21,–23).

另一个与亲免疫素相关的关键功能，如亲环素，是伴侣的功能(17,24,–28). 伴侣促进蛋白质折叠，防止蛋白质错误折叠和聚集，从而提高正确折叠蛋白质的产量，而不影响其折叠速率(29). 蛋白质伴侣蛋白受损被认为会干扰蛋白质复合物的组装、蛋白质的分类或降解(26,–28,30,–35). 例如，影响亲环素NinaA的突变果蝇属选择性损害两种视蛋白受体亚型的生物发生(28,30,31). 最近对影响NinaA的大量突变的评估(36)发现这些都没有与关键催化残留物重叠(37). 相反，突变集中在催化囊（S2/S2e）附近或结构上明显紊乱的C末端结构域，P米，远离PPLase活动站点(37). 亲环素B（CyPB/PPIB）的伴侣作用也得到基因和生物化学证据的支持，这些证据表明，与影响I型胶原成熟的CyPB/PPIB催化域相反的突变(38)被认为是成骨不全的基础(39,40). NinaA和CyPB/PPIB的细胞表达比其生理底物的细胞表达更广泛，这有力地支持亲环蛋白的催化或伴侣活性作用于比先前从亲环蛋白的生化研究预测的更有限的生理底物库。CsA的明显和限制性肾毒性作用也支持这一观点(41)以及酵母中所有八个CyP和四个FKBP的非本质作用(42).

这些研究和其他研究提出了以下重要问题：（i）NinaA和CyPB，以及其他亲环素底物选择性效应的分子基础；（ii）亲免疫素的伴侣蛋白和PPIase活性之间的功能关系，重要的是，（iii）所有其他单域和多域亲环蛋白（～19）在健康和疾病中的生理和病理生物学作用。这些问题具有更高的重要性，因为最近有报道称病毒制剂(例如HIV-1和丙型肝炎病毒）利用亲环素定义不清的活性促进感染(43,–54)许多新型的免疫亲素结合药物具有与CsA和FK506不同的药理和治疗特性(55)CsA促进朊蛋白攻击(56)以及未定义的亲环素（CyPA）活性促进对CuZn超氧化物歧化酶家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关突变的神经保护(57). 因此，CyPA/PPIA已成为这些和其他病理生物学过程的主要靶点，但其高细胞内浓度和与亲环蛋白家族另一成员的高度同源性增加了一种可能性，即CyPA的许多作用可能完全或部分由其他特征较差的亲环蛋白成员执行。

越来越多的证据支持，大型多模和多效性Ran-binding蛋白-2（Ranbp2）通过其C末端亲环素结构域（CY）与CyPA具有最高同源性(58,–60)单独或与Ranbp2的其他模块合作促进病毒感染(46,–48,54,61). Ranbp2在核孔复合体产生的细胞质纤维处的定位支持了Ranbp2也在调节底物的核质穿梭中起着重要作用，这一过程被认为需要穿梭底物的部分展开才能通过核孔复物(48,62,–66). 然而，Ranbp2的CY首次被证明直接和选择性地与L/M-视蛋白结合，并促进L/M-视蛋白异构体的相互转化(17,18). 这种相互作用涉及L/M-opsin与Ranbp2相邻RBD4的CY依赖性关联，以及外源表达系统中功能性L/M-oppin受体（色素）的生成增强(17,18). 尽管Ranbp2对小鼠的生存能力至关重要(67,68)和锥形光感受器(69)Ranbp2的CY的生理和生物学作用及底物，以及CY对Ranbp2多效性和病理生物学作用的贡献仍不明确。在这里，我们报告了遗传、细胞、生化和电生理方法在小鼠模型中的应用跑步2PPIase或伴侣蛋白活性受损，以揭示Ranbp2的CY特异性活性、新的生理底物及其蛋白质平衡调控之间的机制和生物联系，并有望成为新的治疗干预手段。

实验程序

BAC重组

从RPCI小鼠BAC文库24和～151 kb中鉴定出细菌人工染色体（BAC）克隆RP24-347K24生物信息学通过DNA测序和限制性内切酶图谱，包含完整的结构跑步2基因（～65kb）及其上游（～45kb）和下游（～50kb）调控序列。BAC RP24-347K24克隆是从奥克兰儿童医院研究所的BACPAC资源中心获得的。如前所述，使用BAC重组从亲本BAC克隆生成BAC结构，并进行以下修改(70). 简要地，大肠杆菌用1μG纯化的BAC DNA（RP24-347K24）电穿孔SW102细胞（Neal G.Copeland的礼物），在32°C下培养至A类6000.6，在42°C下诱导15分钟，清洗并重新悬浮10%冰镇甘油。用200 ng双链DNA寡核苷酸电穿孔，该寡核苷酸含有HA标签序列，位于5′端和3′端，末端外显子和3′UTR的同源重组序列为50 bp跑步2分别是。在32°C下用1 ml含葡萄糖的超优培养液回收1 h后，用Luria培养液将细胞洗涤三次，稀释至每ml Luria发酵液（20μg/ml氯霉素）中约30–40个细胞，放入若干试管中，并在32°C下生长18–20 h，从40μl等分样品中收集细胞颗粒。为了鉴定目标克隆，在重组位点两侧使用外部引物进行PCR。经鉴定的培养克隆经过系列稀释和PCR，以获得重组BAC的单个菌落。根据制造商的说明，对使用Nucleobond-BAC 100试剂盒（德国马切里·纳格尔）纯化的重组BAC DNA进行双脱氧测序和NotI限制性映射，以确认靶向性。使用相同的程序生成重组BACs，其中包含CY（R2944A）或CLD（I2471K和V2472A）突变，该突变由Ranbp2型（GenBankTM（TM）加入编号NP_035370.2号)除此之外，每个突变的纯化500-bp扩增子用于电穿孔和重组。突变扩增子通过两步PCR产生，其中一对互补引物包含点突变，另一对位于突变引物上游和下游侧翼。在微量注射缓冲液（10 m）中稀释新鲜纯化和重组BAC DNA米三氯化氢，pH 7.5，0.1 m米乙二胺四乙酸（EDTA），30μ米精胺，70μ米精脒，100米米NaCl）直至微量注射。

转基因小鼠的产生

将重组BAC注入原核，在植入假孕母鼠体内后生成转基因小鼠。在杜克大学医学中心的转基因小鼠设施和杜克神经转基因实验室进行微注射。阳性F0通过PCR从尾部活检的基因组DNA和带有抗HA抗体的尾部匀浆的免疫印迹分析鉴定创始者和表达者。积极的创始人随后与Ranbp2配对Gt公司(pGT0pfs公司)630瓦/+老鼠(68)在纯合子上产生BAC转基因小鼠跑步2−/−背景。F1和F2后代的基因组PCR、RT-PCR和免疫印迹分析证实了BAC转基因的传播。floxed的生成跑步2之前描述过小鼠(67,69). 小鼠在无致病性转基因屏障设施中以<70 lux的亮度饲养，并给予随意获得水和饮食5LJ5（密苏里州圣路易斯普瑞纳）。动物实验方案由杜克大学和克利夫兰诊所的动物护理和使用机构委员会批准，所有程序均符合美国国家科学院和ARVO关于在视觉研究中使用动物的指南。

重组结构和蛋白质的制备与纯化

突变体CY构建体2944A兰特和CYS3036E系列（小鼠序列的等效残基），融合到GST或mRFP的框架内，由牛cDNA构建物的突变扩增子产生(58)采用两步PCR策略，一对互补引物包含点突变，另一对位于突变引物上游和下游两侧，如其他地方所述(71). GST-融合和凝血酶裂解（无GST-）重组蛋白的表达、纯化和分析与别处所述完全相同(72).

PPI酶分析

肽基丙基底物Suc-AAPF-第页NA、Suc-AGPF-第页NA、Suc-AEPF-第页NA、Suc-ALPF-第页NA和Suc AIPF-第页NA，购自Bachem Bioscience（宾夕法尼亚州普鲁士国王）。基质溶解至2.6 m的浓度米在含有0.25的四氢呋喃中米氯化锂(73). 将牛胰腺α-糜蛋白酶1-S型（Sigma）溶解在2 mg/ml Tris缓冲液（100 m）中米Tris，pH 7.8，0.1 m米氯化镁2，1米米EGTA）。所有溶液都放在冰上。50微升，共2微升米首先将野生型或突变型CY或RBD4-CY构建体和920μl糜蛋白酶在比色皿中混合。通过添加30μl的2.6 m来启动反应米肽底物的溶液。通过使用SpectraMax M5分光光度计（分子器件）在400 nm处收集5分钟的吸光度来监测肽的水解。从所有后续读数中减去时间0的读数作为基线。然后对数据进行分析，得出一级速率常数，k个，通过对方程进行非线性曲线拟合得到，A类=A类0（1−e−千吨)，使用SigmaPlot 8.0（Systat Software Inc.，加利福尼亚州圣何塞）。对每个基底进行了五次测量。催化效率k个猫/K（K）米由方程式得出，k个光突发事件= (k个猫/K（K）米)[E类] +k个服务提供商，其中[E类]是PPIase的浓度（CY）；k个光突发事件是存在PPI酶时测得的表观一级速率常数，以及k个服务提供商是PPLase缺失时测得的表观一级常数（自发异构化）(74). 在我们的分析条件下，实验测定了400 nm处的摩尔吸收系数为ϵ=0.011μ米−1厘米−1.

细胞培养和转染

HeLa细胞保存在补充有10%胎牛血清的DMEM（Invitrogen）中，37°C，5%CO存在2和100%湿度。指数生长细胞被pDest-733（mRFP）载体瞬时转染到野生型CY和突变型CY1944年2月和CYS3036E系列Ranbp2使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）。培养24小时后，收集细胞，用1×PBS洗涤，并在Nonide P-40缓冲液（50 m）中溶解米Tris，150米米氯化钠、1%诺奈德P-40、微型蛋白酶抑制剂片（罗氏应用科学公司）。在4°C下培养30分钟后，细胞裂解物通过21½号注射器，并在10000×克，4摄氏度。收集上清液并用于Western blot分析或免疫沉淀分析。

抗体

针对人类RANBP2的同源内部重复序列（IR）IR1+2结构域产生兔抗体Ab-W1W2#9和#10(59,60)，包含牛Ranbp2的W1W2结构域的Bsu36I/BamHI限制性片段(58)亚克隆到pGEX-KG载体中，表达、纯化并用凝血酶从GST部分裂解(72). 在用重组蛋白（～100μg）和Hunter’s TiterMax Gold佐剂（CytRx Corp.，Norcross，GA）进行四次增强注射后，从两只兔子中独立产生两种抗体，然后根据制造商的说明（Stereogene，Arcadia，CA）在非变性条件下对相同抗原进行亲和纯化。这两种抗体在免疫组化中产生相同的结果，转基因组织中未检测到信号Ranbp2型缺乏表达跑步2在选择性组织中。采用8μg/ml的Ab-W1W2#10进行免疫荧光。用于免疫荧光（IF）或免疫印迹（IB）的其他抗体如下：兔抗DsRed（1:1500（IB，Clontech）；大鼠抗HA（1:500（IB），罗氏应用科学）；小鼠抗HA（1:100（IF），Abcam，Cambridge，MA）；小鼠抗泛素（1:1000（IB），Santa Cruz Biotechnology）；兔抗hsc70抗体（1:3000（IB），ENZO生命科学，法明代尔，纽约州）；单克隆小鼠抗乙酰化α-微管蛋白（1:40000（IB），Sigma）；兔抗L/M视蛋白21069号（1:500（IF），1:1000（IB））(75)；兔抗S视蛋白（1:2500（IB），1:100（IF），JH455，杰里米·内森斯赠送）；山羊抗S视蛋白（1:100（IF）Millipore，Temecula，CA）；花生凝集素TRITC结合物（1:100（IF），Sigma）；兔抗3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（1:500（IB），圣克鲁斯生物技术公司）；小鼠抗核孔复合物蛋白Nup62、Nup153和Nup358的mAb414（400 ng/ml（IB），加利福尼亚州埃默里维尔市科万斯）；小鼠抗层粘连蛋白A/C（1:1000（IB），BD Biosciences）；兔抗19S蛋白酶体S1（1:1000（IB），伊利诺伊州罗克福德热电科学公司）；兔抗hnRNPA2/B1（1:1500（IB），1:100（IF），Proteintech，芝加哥，IL）；兔抗HDAC4（1:500（IB），圣克鲁斯生物技术公司）；小鼠抗RANGAP1（1:1000（IB），Invitrogen）；兔抗Nr2e3（1:1000（IB），Proteintech）；兔抗COUP-TF1（1:1000（IB），Abcam）；兔抗STAT3抗体（1:1000（IB），细胞信号转导，马萨诸塞州波士顿）；兔子-STAT5（1:1000（IB），Abcam）；兔磷酸化-STAT3（1:1000（IB），Abcam）；兔磷酸化-STAT5（1:1000（IB），Abcam）；兔抗γ-结晶（Vasanth Rao赠送，Sam Zigler博士原创）；小鼠PSR-45（抗磷丝氨酸抗体，1:1000（IB），Abcam ab6639）；Alexa荧光结合二级抗体和Hoechst 33 342来自Invitrogen。

共免疫沉淀与西方分析

将瞬时转染HeLa细胞的Nonide P-40提取物调节为每次反应500μg蛋白质，并在4°C下用非免疫性IgG和蛋白质A/g琼脂糖（圣克鲁斯生物技术）预先清除1 h。用2μg兔DsRed抗体和20μl 50%蛋白A/g-琼脂糖珠在4°C下进行免疫沉淀并过夜。用Nonidet P-40缓冲液清洗珠子三次，用Laemmli缓冲液洗脱蛋白质。免疫沉淀复合物在7.5%SDS-PAGE上溶解并在PVDF膜上印迹(72). 用脱脂干乳块溶液（Bio-Rad）封闭的膜用于检测其他地方描述的所有抗体(72)除抗磷丝氨酸抗体外，在4°C的温度下，在0.5%的BSA中，在5%的BSA（25°C/1 h）封闭的膜上过夜探测。用抗磷酸丝氨酸、抗STAT3、抗STAT5、抗磷酸-STAT3、抗磷酸-STAT5或抗DsRed抗体探测膜，然后用辣根过氧化物酶偶联的第二抗体（25ng/ml）孵育。免疫反应蛋白通过与增强化学发光试剂（Pierce）孵育显示，并暴露于X射线超薄膜（Amersham Biosciences）。对于密度分析，代表性谱带的积分密度值（idv）归一化为背景值和RFP idv。对于CY结构中磷酸化量的图形表示，磷酸丝氨酸免疫反应带被归一化为RFP。

对于小鼠组织的联合免疫沉淀分析，使用Bullet Blender BBX24（Next Advance Inc.，Averill Park，NY）将中脑和视网膜提取物溶解在Nonide P-40缓冲液中，温度为4°C，存在0.5 mm氧化锆珠（Next Progress Inc.）。分别使用3-4 mg和1.25 mg中脑和视网膜提取物，在4°C下预处理2μg非免疫性IgG和50μl 50%蛋白A/g珠浆（圣克鲁斯生物技术）后，用于免疫沉淀反应。在4℃下使用小鼠抗HA抗体（Abcam ab18181；每次反应3.5–4μg）进行免疫沉淀。共免疫沉淀复合物通过SDS-PAGE进行解析，并按照所述进行蛋白质印迹分析(72).

亚细胞分离

按照制造商的说明，使用Q蛋白质组细胞室试剂盒（Qproteome cell compartment kit）制备了5周龄转基因和非转基因小鼠的一个冷冻视网膜的核和非核亚细胞组分（Qiagen，Valencia，CA）除了以下两个例外：1）以1000 rpm离心后从视网膜总裂解液中收集细胞溶质部分，2）细胞溶质、膜和细胞骨架部分的体积分别为50μl，然后合并为一个部分；而核部分的总体积为每只视网膜100μl。样品的蛋白质浓度由微量BCA试剂盒（Pierce）测定。将所有亚细胞组分溶解在SDS采样器缓冲液中，并通过SDS-PAGE进行解析，并使用针对感兴趣蛋白的抗体和每个亚细胞组份的标记进行免疫印迹。免疫印迹条带的idv首先通过减去相应车道中相同区域的idv背景进行校正。然后将它们归一化为相同分数Nup62的idv。归一化后，转基因和非转基因小鼠中每个蛋白质的核和非核组分的idv转化为百分数（总蛋白=100%）。使用两个样本比较转换百分比数据的平均值t吨在最小显著性水平为0.05的情况下，假设方差不相等进行检验（原始值8.5）。

免疫组织化学

眼罩和视网膜组织的采集、固定、处理和显微镜成像程序完全按照前面所述进行(69). 对于hnRNPA2/B1免疫染色，眼球在室温下用1%多聚甲醛固定1h。将10μm厚的视网膜冰冻切片在室温下的封闭缓冲液中培养1小时，然后用蛋白酶K（20μg/ml，Promega，Madison，WI）处理9分钟，并采用其他地方描述的标准免疫染色方案。使用尼康C1采集图像+激光扫描共焦显微镜，与四个固态二极管激光器（407纳米/100毫瓦、488纳米/50毫瓦、561纳米/50毫瓦、640纳米/40毫瓦）的LU4A4发射基地耦合，并由尼康EZC1.3.10软件（6.4版）控制。

形态计量分析

从尼康C1拍摄的127×127μM图像场中，对免疫标记M-和S-视蛋白和花生凝集素的锥体光感受器进行了形态计量学分析+基本上如前所述的激光扫描共焦显微镜(69). 简单地说，使用免疫染色的视网膜扁平支架捕获光学切片，以在整个外节段长度（～25μm，步长0.5μm）进行三维重建。使用采集后的Nikon Elements AR（3.2版）软件从视网膜每个区域的三个图像场中统计锥体感光器。双尾等方差或不等方差t吨进行测试统计分析。第页≤0.05被定义为显著。

小鼠的光处理和TUNEL分析

Ten-12周野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−在杂合子中65卢比L450/M450背景放在一个白色的反光笼子里，里面有床上用品、食物、水，笼子顶部装有一块可调光的发光二极管灯。暗适应18小时后，将1%硫酸阿托品和10%盐酸苯肾上腺素（HUB Pharmaceuticals，LLC，Rancho Cucamonga，CA）涂抹到小鼠眼睛中，使其瞳孔扩大。将小鼠暴露在5000 lux的连续白色发光二极管下24小时，然后在黑暗中24小时。处死小鼠，立即收集眼球并进行免疫组织化学和形态计量分析。如前所述，使用终端荧光TUNEL系统（麦迪逊普罗米加）进行TUNEL分析。

Ranbp2的CY建模

Ranbp2的CY模型是使用内部坐标力学（ICM）中的随机全局能量优化程序在ICM-Pro桌面建模软件包版本3.7（MolSoft LLC，圣地亚哥）中建立的。Blast搜索发现，与Ranbp2一级序列的CY相比，蛋白质数据库中的模板亲环素结构具有最高的序列相似性和最佳覆盖率。基于此分析，带有蛋白质数据库代码的CyPA/PPIA结构1宽8米被选为建模模板。使用Needleman和Wunsch算法的自适应，在CY和模板序列之间生成对齐。通过对侧链进行全局优化并对主干进行退火，对模型进行了改进。迭代精化过程包括三个主要步骤：（i）根据有偏概率蒙特卡罗方法对二面角进行随机采样；（ii）局部最小化步骤，以及（iii）然后使用Metropolis标准接受或拒绝构象。最低能量结构被选为最终CY模型。

2D-DIGE蛋白表达谱分析

通过RIPA缓冲液中溶解的视网膜匀浆的2D-DIGE，以及在二维裂解缓冲液（7米尿素，2米硫脲，4%CHAPS，30 m米三重HCl，pH 8.8）。向Applied Biomics（加利福尼亚州海沃德）提供样品，用于CyDye标记和在分析凝胶和制备凝胶中进行拆分。用DeCyder“in gel”分析软件鉴定基因型之间表达变异的斑点，并选择感兴趣的蛋白质斑点进行质谱（MALDI-TOF/TOF）蛋白质鉴定和蛋白质ID数据库搜索。费雷拉实验室对质谱数据进行了数据分析和验证。

定量RT-PCR

对于总RNA分离，收集组织并在−80°C下储存在RNAlater®（Invitrogen）中，直到使用。从RNAlater®中恢复后，使用Bullet Blender BBX24（Next Advance Inc.，Averill Park，NY）在0.5 mm氧化锆珠（Next Progress Inc.）的存在下，使用TRIzol试剂（Invitrogen）以8000 rpm使组织均匀化3分钟。使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）、寡核苷酸（dT）引物和两个5′Ranbp2型基因特异性引物Rbp2ex19、CAGACCAGTGCTAATGTAACTCCA和Rbp2ex 20、TGGGCCCCATTTTCTGTAAGTGTATTT符合制造商的说明。用20 ng cDNA，800 n进行定量RT-PCR米正向和反向引物，10μl 2×SYBR®Green PCR Master Mix（Invitrogen），最终体积为20μl，使用ECO在48 well板中TM（TM）实时PCR系统（Illumina，圣地亚哥）。扩增通过以下方式进行：（i）聚合酶在95℃下激活10分钟，（ii）PCR在95℃循环15秒，60℃循环1分钟，40个循环。转录物的相对量通过ΔΔ计算C类T型方法使用Gapdh公司作为参考(n个= 3–4). 用于实验的引物序列如下：Gapdh公司-f、 GCAGTGGCAAAGTGGATT，以及Gapdh公司-r、 GAATTTGCCGTGGAGTGGAGT公司；hnRNPA2/B1-f、 TTTGATGACCATCATCCTGT，以及hnRNPA2/B1-r、 CTCTGAACTTCTGCATTTC；S-视蛋白-f、 GCTGGACTTACGTCTCACC，以及S-视蛋白-r、 TGTGGCGTTGTTTGCTGC；M-视蛋白-f、 GTGAACAGACACTGGACCAC，以及M-视蛋白-r、 CCACCTGGGAGAAATGTGATAA；视紫红质-f、 GCTTCCCTACGCCAGTGTG，以及视紫红质-r、 CAGTGGATTCTGCCGCAG；Ranbp2-f1GCCCCGAGAGAGAGTCAATGA，以及Ranbp2-r1级，gtagaaatgattttttagcaagatca；跑步2e27-R2、AGCTGTCCACATTCGTGATACA和跑步2e27-F2，AGGATGCATGGATACTGTGAGAA；巴格达4号-3252F、 AGACAGTCACCGCGCT，以及HDAC4-3359型R、 AGCAGCTTCGGGCTACGGT公司。

脱泛素化和蛋白酶体分析

视网膜在干冰上闪速冷冻，每个视网膜在60μl均质缓冲液（50 m）中重新悬浮米三氯化氢，pH 7.5，250 m米蔗糖，5米米氯化镁2，2米米ATP，1米米DTT，0.5米米EDTA和0.0025%洋地黄素），并在冰上孵育5分钟。然后将提取物以20000×克在4°C下放置15分钟，将上清液转移到新试管中(76). 将上清液中的1μg总蛋白与20 S蛋白酶体抑制剂（20μ米环氧霉素）或DUB抑制剂（25μ米PR-619和/或5米米1,10-菲罗啉）在37°C下保持30分钟。然后是100μ米7-氨基甲基香豆素结合底物，100 n米添加罗丹明偶联的Lys-63-或Lys-48-连接的四-鸟嘌呤底物，并在37°C下培养45分钟。使用SpectraMax M5分光光度计（分子器件）分别在激发/发射/截止=380/460/455和激发/发射-截止=485/535/530时测量游离AMC和罗丹明。20 S蛋白酶体贡献的特定蛋白水解酶活性是通过从不含环氧化合物的酶活性中减去在含环氧化合物时测得的酶活性来确定的。通过从没有PR-619、1,10-菲咯啉或两者的情况下减去在PR-619和/或菲咯啉存在的情况下测得的活性来确定特定的DUB活性。荧光强度根据通过10μg上清液免疫印迹检测到的可溶性部分中19S调节颗粒的S1亚单位数量进行标准化（PA1-973，Thermo Fisher Scientific，Rockford，in）。使用的试剂如下：环氧树脂（钙生物化学）；PR-619（西格玛）；1,10-菲罗啉（Sigma）；Suc-LLVY-AMC（马萨诸塞州剑桥市波士顿生物化学）；Ac-RLR-AMC（波士顿生物化学）；Ac-nLPnLD-AMC（ENZO生命科学，Farmingdale，NY）；Lys-63连接的四泛素罗丹明110和Lys-48连接的四泛素罗丹宁110（LifeSensors，Malvern，PA）。

视觉电生理学

使用两种记录方案对小鼠进行测试，旨在评估外视网膜或视觉通路的功能(77). 所有研究均在夜间暗适应后进行，然后用氯胺酮（80 mg/kg）和木聚嗪（16 mg/kg）麻醉小鼠，并放置在温度调节的加热垫上。用滴眼液（2.5%盐酸苯肾上腺素、1%环戊烯酸、1%托吡卡胺）扩张瞳孔；在ERG研究中，角膜表面用1%盐酸丙拉卡因滴眼液麻醉。

暗光自适应ERG

我们使用传统的频闪ERG协议来评估外视网膜的反应。使用不锈钢丝活性电极记录ERG，该电极参照放置在面颊上的针电极；并且放置在尾部中的针状电极用作接地引线。使用UTAS E-3000信号平均系统（马里兰州盖瑟斯堡LKC Technologies）对响应进行差异放大（0.3–1500 Hz）、平均并存储。白光闪光灯最初出现在Ganzfeld碗内的黑暗中。刺激按亮度增加的顺序呈现，闪光亮度范围为-3.6至2.1 log cd s/m2通过在稳定的适应场（20 cd/m）上叠加刺激来分离锥体ERG2). 闪光亮度范围为−0.8至1.9 log cd s/m2.的振幅一-在闪光开始后7毫秒，从预刺激基线开始测量波形。The amplitude of theb条-波是从一-波谷到波峰b条-挥手，如果没有一-根据预刺激基线，出现了波形。

视觉诱发电位

为了测量视觉皮层的反应，使用位于视觉皮层中线的活动电极记录VEP，并参考放置在面颊上的针电极。接地电极置于尾部，放大器带通滤波器设置为1–100 Hz。最初在暗适应条件下记录VEP，闪光灯刺激的亮度范围为-2.4至2.1 log cd s/m2然后，使用叠加在稳定的20 cd/m上的刺激物，运行一系列光适应刺激2适应领域。小鼠VEP主要由一种称为N1的负成分控制。在负峰值处测量N1分量的隐式时间。从N1负峰到随后的正峰（P2）测量VEP的振幅。

统计分析

采用双向重复测量方差分析来分析暗适应ERG或VEP和VEP时间测量的亮度响应函数。双尾等方差或不等方差t吨对qRT-PCR或免疫印迹定量进行测试统计分析。第页≤0.05被定义为显著。非参数Kruskal–Wallis检验用于组分析和Mann–WhitneyU型对光照小鼠的TUNEL分析进行了两组比较试验。

结果

导致Ranbp2细胞色素PPlase活性丧失的突变

研究Ranbp2的CY的PPLase活性的生理和生物学作用(图1A类)，我们生成并检查了用于PPIase活性损失的CY结构。Ranbp2、CyPA和CyPB的CY之间的一级结构的比对表明，CY与CyPA的同源性高于CyPB（66与44%同一性），尽管这三种亲环素之间的催化PPLase残基高度保守（数据未显示）(37,58). 选择CyPA作为模型模板，因此预测的Ranbp2的CY结构与已知的CyPA结构比CyPB更相似，并且与后者的差异主要局限于它们的环区，例如α2和β8结构之间的环(图1B类，数据未显示）。分子模型使我们研究了CY高度保守残基的两种变化对其PPIase活性的影响(图1C类) (58). 首先是高度保守的催化残渣CY的变化2944A兰特，因为人类CyPA中的R55A突变导致其PPIase活性丧失(78). 第二种是共有Ca中磷酸化的翻译后修饰2+/CY的钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ位点第036页，因为最近对细胞磷酸蛋白质组的分析支持Ranbp2的CY可能经历磷酸化，并且其中一个翻译后修饰位点与其活性位点非常接近（～7Å）(图1C类) (79). 如所示图1D类mRFP融合的CY、CY免疫沉淀物的Ser（P）抗体的免疫印迹2944A兰特和CYS3036E系列在HeLa细胞中表达，表明磷酸化CY的水平不受CY的影响1944年2月突变，而CYS3036E系列取代导致磷酸化CY量减少约60%(图1D类). 然后我们研究了CY的影响2944A兰特和CYS3036E系列CY的PPLase活性的突变和邻近RBD4顺-反式-肽基脯氨酸底物(图1E类和表1). CY未检测到PPLase活性2944A兰特在存在任何底物的情况下，而磷模拟取代，CYS3036E系列导致不同脯氨酰底物中CY的PPLase活性普遍显著降低60-100%(图1E类和表1). 此外，上游和相邻的RBD4对五种测试底物中的两种底物造成了CY PPIase活性的轻微下降(图1E类和表1). 因此，这些数据支持CY2944A兰特不影响CY的磷酸化，但CY2944A兰特和CYS3036E系列突变分别导致CY的催化功能完全丧失和部分丧失。此外，与先前的研究一致(58)，RBD4对CY对选择性脯氨酰底物的PPIase活性有较小但显著的影响，表明RBD4可能影响选择性底物进入/释放相邻CY结构域。

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损伤Ranbp2 CY结构域PPIase活性的突变。 A、，Ranbp2的主要结构和域。域不是按比例绘制的。Ranbp2的CY为用红色圈出。LD，富含亮氨酸的结构域；RBD公司n个 = 1–4，运行GTPase-binding域，n个= 1–4; 氟化锌n个 = 7，富锌指状结构域；KBD时，驱动蛋白-1结合域；CLD、，亲环素样结构域；红外，内重复；塞浦路斯，亲环素结构域。B、，Ranbp2模型CY的结构叠加(绿丝带)、CyPA/PPIA(红丝带)和CyPB/PPIB(灰色缎带). PPLase活性位点的残留物如所示粘贴代表。描述了循环中的预测变化。C、 色带根据CyPA/PPIA的模板结构建模的Ranbp2的CY表示。残基Ser-3036是磷酸化的底物，而Arg-2944是肽基催化的关键残基顺-反式-脯氨酰异构化。残留物Ser-3036和Arg-2944如所示橙色棍子CY催化PPIase位点的其他残基如所示绿色棍子。D、，免疫沉淀的野生型mRFP-CY和突变型mRFP-CY的抗Ser（P）抗体对丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化的免疫定量2944A兰特和mRFP-CYS3036E系列在HeLa细胞中异位表达时构建。拟磷酸取代，mRFP-CYS3036E系列，导致磷酸化免疫检测显著降低，而mRFP-CY2944A兰特突变对CY的磷酸化状态没有影响(n个=4). 定量分析根据mRFP标准化。显示了免疫定量分析的代表性免疫印迹在下面图表。美国。，任意单位。E、，PPl酶催化活性(k个猫/K（K）米)野生型CY，突变型CY2944A兰特和CYS3036E系列和RBD4-CY在存在各种肽基-丙基底物的情况下。请注意，CYS3036E系列降低了所有肽基-脯氨酸底物的PPLase活性，而CY2944A兰特完全消除了PPLase对所有脯氨酰底物的活性。RBD4-CY结构体对选择性脯氨酸底物的活性降低，例如顺式-Suc-Ala-Ile-Pro-Phe公司-第页-硝基苯胺（AIPF）。Ranbp2的CY对肽基-丙基底物也表现出明显的催化效率，其中对顺式-Suc-Ala-Gly-Pro-Phe公司-第页-硝基苯胺（AGPF）。所示数据代表平均值±S.D。，n个= 3–4.

表1

P酶催化效率(k个猫/K（K）米)Ranbp2的野生型和突变型CY和RBD4-CY构建物对肽基-丙基底物（m米−1秒−1)

AAPF公司AGPF公司AEPF公司阿尔卑斯山脉AIPF公司
塞浦路斯83.09 ± 0.9319.77 ± 3.8855.26 ± 9.8193.19 ± 18.18123.07 ± 9.72
RBD4-CY型77.63 ± 16.394.42 ± 5.4454.58 ± 22.0373.07 ± 2.7789.20 ± 8.10
塞浦路斯S3036E公司31.42 ± 2.020 ± 4.1418.46 ± 4.3728.38 ± 6.9052.09 ± 4.49
塞浦路斯2944A兰特00000

无PPIase和无PPIse及C末端伴侣活性受损的Ranbp2转基因小鼠的建立

我们雇佣了CY2944A兰特突变，完全消除了Ranbp2 CY的PPIase活性，以产生在空Ranbp2背景(图2,A类和B类). 一种细菌人工染色体（BAC）构建，包含跑步2基因(80)用于介绍CY2944A兰特BAC重组突变（Tg-跑步2R2944A-HA型) (81). 这个跑步2构建和另一个在CY中没有R2944A突变的基因，也用CY中的C末端HA标签（Tg-Ranbp公司水处理-HA;图2B类). 除了用作分子工具外，C末端HA标记还可以独立于其PPIase活性来检测CY C末端区域的伴侣功能，因为最近对CY亲环素的突变研究分析果蝇属，尼娜(30,31,36)，支持存在一个不同的C末端表面补丁，P米，在生理上对伴侣视蛋白的生物发生至关重要，并且位于PPIase催化结构域之外(37). 因此，我们推断标签序列的插入(例如尽管NinaA的C-末端伴侣结构域和Ranbp2的CY的C-端伴侣结构域在拓扑上似乎是不同的，但Ranbp2 CY的对应C-末端末端序列中的HA标记可能会在空间上阻碍CY的假定C-末端陪伴结构域与其底物之间的相互作用。两个独立的转基因(Tg（千克）)在空Ranbp2背景通过交叉转基因株系，Tg-Ranbp2水处理-HA和Tg-Ranbp2944兰特/公顷用这条线跑步2+/Gt（pGT0pfs）630Wcs（以下表示为跑步2+/−) (68,69)，它含有一个组成性破坏的等位基因跑步2(图2,A类和B类). 全部Tg（千克）上的行空Ranbp2−/−背景(Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−)挽救了胚胎的致命性跑步2−/−并且在24周龄之前没有表现出明显的解剖或行为表型。The transcriptional and protein expressions of theTg-Ranbp2944兰特/公顷在里面Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠与野生型小鼠相当，而Tg-范围2水处理-HA在里面Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−小鼠比野生型高4-6倍跑步2(图2,C类和D类). 转基因和天然Ranbp2蛋白在视网膜神经元中的亚细胞定位比较表明，Tg-Ranbp2之间没有显著差异R2944A-HA型和本地Ranbp2(图3). 这两种蛋白质都定位于神经元的核孔，如视网膜神经节细胞，在那里这种结构和Ranbp2非常丰富(图3,A类和B类) (75)并且它们也清晰地定位于感光神经元的连接纤毛(图3A类). 与非转基因和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠，Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−Tg-Ranbp2显著积累水处理-HA尽管所有其他视网膜神经元在Ranbp2的定位和表达上没有显著差异，但在感光细胞的连接纤毛中(图3A类).

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的表达式Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−和Tg-范围2R2944A-HA型::跑步2−/−. A、，宪法被破坏者的代表跑步2等位基因(跑步2+/Gt（pGT0pfs）630瓦)通过无启动子双顺反子插入（融合新/lacZ和胎盘碱性磷酸酶(PLAP公司))带有剪接接受器的暗盒(沙特阿拉伯)的外显子1和2之间的位点跑步2(顶部). 插入盒与外显子1的剪接导致外显子1与新/lacZ磁带。B、，转基因BAC重组结构图，Tg-Ranbp2水处理-HA和Tg-Ranbp2944兰特/公顷，用于本研究。Tg-Ranbp2水处理-HA包含野生类型跑步2在编码CY的末端外显子末端插入C末端血凝素（HA）标签跑步2，而Tg-Ranbp2R2944A-HA型包含HA标签修改和功能丧失PPIase突变，跑步22944A兰特，以Ranbp2的CY表示。注意图纸未按比例绘制。C、，4-6周龄非转基因野生型的转录表达跑步2和转基因Tg-Ranbp2水处理-HA和Tg-Ranbp2R2944A-HA型通过qRT-PCR。非转基因野生型跑步2和Tg-Ranbp2R2944A-HA型以可比较的水平表示，而Tg-范围2水处理-HA肝脏和视网膜的含量分别比野生型高约10倍和4倍跑步2和Tg-Ranbp2R2944A-HA型.引物朝向5′端和3′端跑步2用于qRT-PCR。D、，Ranbp2和Tg-Ranbp2蛋白表达水平的定量944兰特/公顷在4周龄和6周龄的野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠(顶部图形)，而Tg-Ranbp2水处理-HA中的级别跑步2水处理-HA::跑步2−/−在野生型小鼠中比Ranbp2高约4.5倍(下部图形). 显示了Ranbp2和负载控制的代表性免疫印迹图表下方Nup153和Hsc70分别是核孔蛋白153和细胞溶质热休克蛋白70，用作负荷控制。所示数据代表平均值±S.D。，n个= 4;不另说明。，不显著；−/−，跑步2−/−;Tg-R2944A-HA、Tg-Ranbp2R2944A-HA型;Tg-WT-HA、Tg-Ranbp2水处理-HA.

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天然Ranbp2、Tg-Ranbp2的免疫定位R2944A-HA型和Tg-Ranbp2水处理-HA放射状视网膜切片中的蛋白质(A类)和神经节神经元胞体的视网膜扁平支架(B类).分别用Ranbp2和HA标签的IR域抗体检测4-6周龄小鼠的内源性和转基因Ranbp2蛋白。Ranbp2的本地本地化(A、 第一排面板)分布于视网膜神经元的细胞体中，在感光细胞的睫状区和神经节神经元的胞体中有显著表达。用Tg-Ranbp2观察到转基因Ranbp2的类似亚细胞分布R2944A-HA型和Tg-Ranbp2水处理-HA，但存在Tg-Ranbp2的积累水处理-HA感光细胞的睫状区(A、 第二排面板).插图是放大倍数较高的装箱的睫状体区域。B、，视网膜平架上捕获的神经节神经元的高倍放大图，描绘了天然和转基因Ranbp2在核边缘的核孔中的定位。在非转基因和转基因基因型之间未观察到明显差异，跑步2−/−;Tg-R2944A-HA,Tg-Ranbp2R2944A-HA型;Tg-WT-HA,Tg-Ranbp2水处理-HA;操作系统，感光器外节；是，光感受器内段；ONL、，外核层（感光细胞胞体）；印度卢比，内核层（二级神经元胞体）；GC、，神经节细胞。比例尺，50微米(A类)，20微米(A、 插入)和10μm(B类).

Tg-范围2R2944A-HA型：：Ranbp2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA：：Ranbp2−/−选择性促进M视蛋白在锥体光受体中的聚集和积累

我们开始研究Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−和Tg-Ranbp公司水处理-HA::跑步2−/−在M-和S-锥体光感受器中，由于以下原因：（i）之前发现Ranbp2的CY和RBD4的协同作用直接介导M-opsin亚型的PPIase依赖性相互转化，并增强异源表达系统中M-opins的生物发生(17,18)（ii）Ranbp2的表达对所有锥体光感受器类型的存活至关重要(69). 此外，检查跑步2flox/flox公司老鼠支持这一观点跑步2控制M锥光感受器的发展，因为跑步2flox/flox公司小鼠视网膜最腹侧（下方）区域缺乏M-锥体光感受器，在野生型小鼠中M-和S-锥体通常分别较少和较多（数据未显示）。然而Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−,Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−、和跑步2+/+小鼠表明，在视网膜的任何区域，没有任何基因型在M型和S型视锥感光细胞的数量和明显发育上表现出差异(图4; 数据未显示）。然而，我们发现，与跑步2+/+在小鼠中，M-opsin（而非S-opsin）出现了明显的聚集和定位错误，通常位于M-和M/S-锥体光感受器外段的底部和边缘Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::Ranbp2型−/−老鼠(图5,A类和B类). M视蛋白的聚集伴随着M视蛋白水平几乎增加了3倍，但S视蛋白水平没有增加Tg-Ranbp2944兰特/公顷::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::Ranbp2型−/−小鼠与非转基因野生型小鼠的比较(图5C类)尽管M-视蛋白(操作1毫瓦)英寸Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和S-视蛋白(操作1sw)在两种转基因基因型中(图5D类). 综上所述，这些数据支持在Ranbp2的CY中插入C末端HA标签会破坏其伴侣活性，而伴侣活性对M-opsin的生物生成是必不可少的，而CY的PPIase活性在M-opsin-生物生成中起着非必要的生理作用。

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野生型M锥和S锥感光体的地形分布，Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−、和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−.M锥分布无变化(左边)和S锥感光器(正确的)在10-12周龄小鼠视网膜所有区域的所有基因型之间观察到。代表性共焦Z轴-背部堆叠图像(D类)，背部中央(直流)，腹部中央(风险资本)，和腹侧(V（V）)显示了视网膜扁平支架的区域(顶部面板). M锥的定量分布(左边)和S锥(正确的)显示了基因型之间的感光细胞在下面图像面板。基因型之间无显著差异(第页> 0.05). 所示数据代表平均值±S.D。，n个= 3–4;不另说明。，不显著；−/−，跑步2−/−;Tg-R2944A-HA,Tg-Ranbp2R2944A-HA型;Tg-WT-HA,Tg-Ranbp2水处理-HA.比例尺，25微米。

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M-opsin的生物生成障碍Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−. A、，M-和S-视蛋白和PNA在锥体光感受器外段的三维亚细胞定位。10-12周龄时可见M-opsin的积聚和聚集灶Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-范围2水处理-HA::跑步2−/−在锥体光感受器的底部和整个外段，单独表达M-opsin和共同表达M/S opsin。S-opsin在非转基因和转基因小鼠之间的分布正常。B、，的放大图像插入的区域交流，视网膜匀浆的免疫印迹显示10-12周龄时M-opsin选择性积累（～3倍）Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−在非转基因和转基因小鼠之间，S-视蛋白的表达水平保持不变。下图blots代表免疫印迹的定量分析。Hsc70是细胞溶质热休克蛋白70，用作负荷控制。D、，转录水平M-视蛋白(操作1毫瓦)和S-视蛋白(操作1sw)和视紫红质(罗)通过qRT-PCR。减少了约20%M-视蛋白选择性地Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−，而S-视蛋白减少了约50%Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2重量:Ranbp2型−/−.视紫红质(罗)所有基因型的水平保持不变。所示数据代表平均值±S.D。，n个= 4;不另说明。，不显著；−/−，Ranbp2型−/−;Tg（千克）-R2944A-HA，Tg-Ranbp2R2944A-HA型;Tg（千克）-WT-HA、，Tg-Ranbp2水处理-HA.比例尺，25微米(A类)和5微米(B类).

STAT3和STAT5与Ranbp2的CY相关，不依赖于其PPIase和C-末端伴侣活性

在培养细胞中，CyPB/PPIB与STAT3和STAT5相关(82,83). CyPB/PPIB与STAT3的关联可能是暂时的，CsA可以减少但不能消除(83). CyPB/PPIB与STAT3/STAT5的相互作用调节细胞因子介导信号中STAT3和STAT5的核转录活性，这一过程似乎需要CyPB的PPIase活性(83). 然而，高度相关的CyPA/PPIA似乎并不与STAT3和STAT5相关，而是调节STAT3的酪氨酸磷酸化所必需的，这一事件对其核移位至关重要(83). 鉴于Ranbp2的CY与CyPB/PPIB和CyPA/PPIA的高度同源性(58)，我们探讨了Ranbp2的CY与STAT3/STAT5及其活化磷酸化亚型的关联，以及CY突变亚型在正常和疾病状态下对这些关联或STAT3蛋白稳态的影响。我们首先通过CY野生型和突变亚型（CY）的表达来检测STAT3和STAT5是否是CY的底物2944A兰特和CYS3036E系列)在细胞培养中。定性和定量联合免疫沉淀试验表明，CY与STAT3和STAT5相关。PPIase缺失突变体CY2944A兰特，显著减少了此类关联，而CYS3036E系列没有重大影响(图6A类). 然后我们检测了转基因株系的生理效应，Tg-范围2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2重量-重量::跑步2−/−关于STAT3和STAT5的蛋白质平衡。然而，我们发现转基因和野生型品系之间的视网膜STAT3和STAT5水平没有变化(图6B类). 确定STAT3、STAT5或其酪氨酸磷酸化亚型是否与体内与转基因构建体Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−，我们对中脑提取物进行了定性和定量联合免疫沉淀分析，其中STAT3和STAT5的基础表达水平远高于视网膜(图6C类). 如所示图6D类、STAT3、STAT5及其与转基因蛋白Tg-Ranbp2相关的活化酪氨酸磷酸化亚型R2944A-HA型和Tg-Ranbp2水处理-HA属于Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp公司水处理-HA::跑步2−/−小鼠。此外，我们发现STAT3和STAT5与Tg-Ranbp2R2944A-HA型和Tg-Ranbp公司水处理-HA蛋白质的可比水平(图6D类). 最后，我们检测了Ranbp2的PPI酶活性损失在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−在慢性光照下激活的STAT3和感光细胞死亡的体内平衡中，一种强大的疾病应激刺激可促进感光细胞的退化和细胞因子信号的上调(84,–86). 我们发现光毒性是光感受器细胞体中STAT3激活的强大诱导剂，但野生型和野生型之间的这种激活水平没有变化Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−(图6E类). 尽管光毒性导致光感受器的细胞死亡显著增加，但野生型和野生型神经元的死亡数量也没有差异Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠(图6F类). 总之，这些数据支持Ranbp2的CY介导STAT3、STAT5及其活化的亚型的生理关联，但Ranbp2的CY的PPIase和C末端伴侣活性在STAT3结合、活化和保护光感受器免受光介导的损伤中不起作用。

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STAT3和STAT5是Ranbp2的CY的合作伙伴，在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−. A、，Ranbp2体外表达的CY与培养细胞中的天然STAT3/STAT5相关。转染野生型mRFP-CY和突变型mRFP-CY的HeLa细胞提取物的共免疫沉淀的免疫印迹2944A兰特和mRFP-CYS3036E系列结构。图表示上显示的免疫印迹的定量左侧。STAT3协会(STAT3（状态3）β） mRFP-CY中STAT5选择性显著降低2944A兰特共免疫沉淀STAT3和STAT5的免疫沉淀mRFP融合构建物的数量标准化。B、，STAT3水平（状态3β） 和STAT5的表达在视网膜匀浆中不受影响Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−.C、，STAT3的相对水平(STAT3（状态3）β） 视网膜和中脑匀浆之间。与视网膜相比，10–12周龄小鼠中脑中STAT3的基础表达水平高出约25倍。定量分析(正确的)代表性免疫印迹(左边)如图所示。D、，静止和活化（磷酸化）STAT3(STAT3（状态3）β和STAT3（状态3）α） 和STAT5助理体内使用Tg-Ranbp2R2944A-HA型和Tg-Ranbp2水处理-HA中脑提取物中Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−老鼠。免疫印迹是转基因Ranbp2蛋白与抗HA抗体免疫沉淀的共免疫沉淀。定量分析(左边)代表性免疫印迹(正确的)如图所示。Tg-Ranbp2共免疫沉淀的STAT3β和STAT5数量无显著差异R2944A-HA型和Tg-Ranbp2水处理-HA.E、，STAT3激活的免疫定量(P-STAT3型β） 经过轻度处理(书信电报)10至12周龄非转基因野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。光照后，视网膜中P-STAT3的活化程度为30倍，但在非转基因野生型和Tg-Ranbp2944兰特/公顷::跑步2−/−老鼠。图像面板上正确的显示了P-STAT3在光感受器的细胞体和纤维中的免疫定位。F、，隧道+非转基因野生型和Tg-Ranbp2944兰特/公顷::跑步2−/−循环下的小鼠(NT、，非治疗）和慢性光治疗(书信电报，光处理）。循环组和光照组之间和内部没有观察到显著差异(n个=9，页>0.05). 代表性图片(左边)TUNEL的定量+基于点盒图分析的光感受器(正确的)视网膜的中央和外围区域显示(n个=9). 使用Mann-Whitney进行统计分析U型显著性水平为0.05。所示数据代表平均值±S.D。，n个=4（除非另有说明）；不另说明。，不显著；−/−，跑步2−/−;Tg-R2944A-HA、Tg-Ranbp2R2944A-HA型;Tg-WT-HA,Tg-Ranbp2水处理-HA.比例尺，10微米(E类)和25微米(F类).美国。，任意单位。

利用Ranbp2的CY-PPLase活性选择性控制hnRNPA2/B1蛋白沉积

虽然M-opsin的生物生成选择性依赖于CY的C末端伴侣活性，但转基因小鼠的M-opsins和STAT3/STAT5蛋白平衡都不需要Ranbp2的CY的PPIase生理活性。因此，我们采用了一种无偏见的蛋白质组学方法来筛选和鉴定野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。该调查还包括另一个Ranbp2亲环素样结构域（CLD）突变的转基因株系(58),Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−这将在本研究后面进行描述。Ranbp2的CLD被认为通过26S蛋白酶体调节适当折叠蛋白质的降解(87,88). 这个Tg-范围2CLDm-HA公司::跑步2−/−还用作筛选和识别受Ranbp2的CY的PPIase活性损失唯一影响的底物的另一个控制线。为此，SDS溶解了野生型视网膜匀浆，Tg-范围2R2944A-HA型::跑步2−/−、和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−制备小鼠，用不同的CyDye荧光染料标记，混合，并用2D-DIGE分解。野生型视网膜匀浆蛋白表达变化的配对比较（>3倍），Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−、和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−小鼠鉴定出23种蛋白质，其水平在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−; 但在这23种蛋白质中，只有两种候选蛋白质在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。这些是异质核核糖核蛋白A2/B1（hnRNPA2/B1）和胞浆苹果酸脱氢酶。验证这些蛋白质在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−对小鼠进行视网膜匀浆的免疫印迹分析。这些分析表明，只有hnRNPA2/B1在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−与野生型和Tg-范围2水处理-HA::跑步2−/−老鼠(图7A类，数据未显示）。hnRNPA2/B1的下调Tg-范围2R2944A-HA型::跑步2−/−发生在转录后水平，因为野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠表现出可比的转录水平hnRNPA2/B1(图7A类). hnRNPA2/B1转录后的变化Tg-范围2R2944A-HA型::跑步2−/−具有高度选择性，因为在Ranbp2的其他伙伴的水平中未观察到任何变化，例如SUMO-1-RanGAP、Nr2e3和COUP-TFI（数据未显示）(89).

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hnRNPA2/B1的转录后下调和HDAC4的亚细胞选择性分配受损Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−. A、，4-6周龄野生型（+/+）和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。插图光斑强度的体积分析标记在黄色的; 野生型（+/+）和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−点识别（标记在黄色的)质谱分析表明其为hnRNPA2/B1。基因型之间hnRNPA2/B1表达变化的验证和比较表明，在4周龄和6周龄之间，hnRNPA2-B1表达有选择性地减少约60%Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−和其他年龄匹配的基因型(中间图形). 显示了典型的免疫印迹和负载控制在图表下方。转录水平的qRT-PCRhnRNPA2/B1显示野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−，虽然减少了hnRNPA2/B1在里面Tg-Ranbp2水处理-HA::Ranbp2型−/−与…相比Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠(右图形).B、，10-12周龄小鼠视网膜和中脑匀浆中hnRNPA2/B1的相对表达表明，视网膜中hnRNPA 2/B1的丰度相对较高。C、，hnRNPA2/B1在10–12周龄野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。hnRNPA2/B1在视网膜内神经元的胞体中定位显著(印度卢比)和神经节细胞(GC公司). 野生型和野生型之间的hnRNPA2/B1定位没有明显差异Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。D、，HDAC4（而非hnRNPA2/B1）在核和非核视网膜部分的亚细胞分配中的选择性转移Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。显示了hnRNPA2/B1、HDAC4、γ-晶体蛋白和Nup62的核和非核视网膜部分的免疫印迹。γ-结晶蛋白和Nup62分别具有胞质分布和泛分布。拉明A/C和GAPDH是对核和非核馏分的额外控制。图以下免疫印迹是对每个基因型的核和非核组分之间hnRNPA2/B1、HDAC4和γ-晶体蛋白水平的成对比较。数据如所示A、 B、，和D类表示平均值±S.D。，n个= 4.ONL、，外核层（感光细胞胞体）；印度卢比，内核层（二级神经元胞体）；GC、，神经节细胞；不另说明。，不显著；hnRNPA2/B1，异质核糖核蛋白A2/B1；HDAC4、，组蛋白去乙酰化酶-4；编号62，核穿孔蛋白62；N、，核；无，非核；−/−，跑步2−/−;Tg-R2944A-HA,Tg-Ranbp2R2944A-HA型;Tg-WT-HA,Tg-Ranbp2水处理-HA.比例尺，25微米。

之前，我们已经证明，Ranbp2的CY增强了Ranbp2 RBD4和M-opsin之间的直接关联，这一效应与CY在opsin生物发生中的伴侣作用一致(17,18). 为了探讨hnRNPA2/B1是否与Ranbp2稳定相关，我们采用与前面描述的STAT3/STAT5类似的分析方法，对Ranbp2与视网膜提取物进行了联合免疫沉淀分析。然而，与STAT3/STAT5相比(图6D类)，我们没有发现稳定关联的证据体内在hnRNPA2/B1和转基因Ranbp2构建物之间Tg-Ranbp2944兰特/公顷::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−（未显示数据）。为了确定hnRNPA2/B1下调的组织和细胞起源，我们发现hnRNPA2/B1在视网膜中的表达水平远高于大脑其他区域，如中脑(图7B类). hnRNPA2/B1在视网膜内侧和神经节神经元的胞体中定位显著(图7C类). RNA-结合蛋白hnRNPA2/B1与mRNA加工有关，其失调影响细胞溶质RNA颗粒组装（应激颗粒），并在容易聚集的朊蛋白样结构域突变时导致ALS和多系统蛋白病(90). 因此，我们评估了hnRNPA2/B1和Ranbp2的其他分子伴侣在基因型之间的核质分配。细胞核和野生型视网膜的所有其他亚细胞隔室之间的hnRNPA2/B1水平没有选择性差异，Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−、和Tg-Ranbp2水处理-HA::Ranbp2型−/−老鼠(图7D类). 该分析还扩展到组蛋白脱乙酰化酶-4（HDAC4），这是一种蛋白质，其自聚集被证明是其Ranbp2依赖性sumoylation、降解和细胞核导入细胞培养的先决条件(91,92). 尽管HDAC4在视网膜变性中的生理作用尚不清楚(93,94)，其核质分配和水平的失调分别与共济失调-毛细血管扩张-突变型和短趾型精神发育迟滞综合征有关(95,96). 与其他基因型相比，我们发现HDAC4水平在非核组分和核组分中分别显著降低和增加Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠(图7D类)我们没有发现HDAC4琥珀酰化的生理证据。因此，Ranbp2及其PPIase和/或伴侣活性调节HDAC4的核质穿梭。

Tg-Ranbp2中泛素蛋白沉积的组织和年龄依赖性失调R2944A-HA型：：Ranbp2−/−

由于与伴侣蛋白和折叠酶（如免疫亲和素）相关的生物活性的丧失，导致蛋白质错误折叠，被认为会导致或增加对各种损害神经元存活的病理的敏感性(31,37,57,97,98). 蛋白质错误折叠引起的蛋白质聚集通常与泛素化体的形成有关，这是许多神经退行性疾病的特征(99). 此外，先前的研究表明，Ranbp2在26 S蛋白酶体降解适当折叠的蛋白质中发挥作用，这反映在培养细胞中泛素化底物的积累和泛素蛋白酶体系统在CLD单独异位表达Ranbp2时的报告(88). 因此，我们测试了Ranbp2的CY的PPLase活性丧失对不同组织和不同年龄的泛素稳态的影响。通过量化4周龄和24周龄野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。在4周大时，我们发现视网膜、视网膜色素上皮或肝脏中的游离泛素和泛素化蛋白种类的水平没有差异(图8). 然而，到24周龄时，双泛素水平被完全抑制，视网膜中泛素化蛋白的水平显著降低，但单泛素没有选择性降低，而视网膜色素上皮细胞中泛素蛋白的水平降低(图8,A类和B类). 肝脏的泛素稳态没有变化(图8C类).

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泛素稳态的年龄和组织依赖性缺陷Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−.与野生型小鼠相比，双泛素水平(Ub（英国）2)或共轭多泛素(P-Ub型n个)视网膜明显减少(A类)和RPE(B类)，但不是肝脏(C类)，第页，共页Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−24周龄，但不是4周龄。GADPH或hsc70用作装载控制。定量分析显示在免疫印迹旁边。所示数据代表平均值±S.D。，n个= 4.不另说明。，不显著；−/−，跑步2−/−;Tg-R2944A-HA型,Tg-Ranbp2R2944A-HA型;Tg-WT-HA、Tg-Ranbp2水处理-HA.

Tg-Ranbp2CLDm-HA公司：：Ranbp2−/−导致SUMO-1-RanGAP和HDAC4选择性减少而不影响泛素平衡

如前所述，我们产生了另一个转基因株系，Tg-Ranbp2CLDm-HA公司：：Ranbp2−/−Ranbp2的CLD中有两个点突变I2471K和V2472A(图9A类). 先前的研究表明，对应的人类残基（I2634K和V2635A）对sumoylated RanGAP的结合至关重要(100). 然而，我们对视网膜组织提取物和培养细胞的研究发现，CLD与蛋白酶体19S帽的S1成分有关，突变CLD（CLDm）的异位表达逆转了蛋白酶体对正确折叠底物降解的抑制(87,88). 因此，我们采用了Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−以检测Ranbp2的CLD对所描述的分子过程的生理作用，并扩展了我们对其在泛素稳态中的作用的分析。此外Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−在泛素稳态中，该线还可以作为一个额外的对照，以识别PPIase缺失和CY的伴侣活性之间的潜在影响，这些活性分别与CY的催化和C末端伴侣结构域有关，因为Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−该线包含完整的催化PPI酶结构域。

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选择性蛋白水解缺陷Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−以及解除对选择性泛素蛋白酶体系统活动的调控Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−老鼠。 A、，转基因BAC重组结构图，Tg-Ranbp2CLDm公司带有C末端血凝素(哈)在编码CY的末端外显子末端插入标签跑步2以及Ranbp2的CLD中的突变I2471K和V2472A。注意图纸未按比例绘制。B、，非转基因的转录表达跑步2和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司在4-6周龄的野生型和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−分别通过qRT-PCR检测小鼠。肝脏和视网膜增加了Tg-Ranbp2CLDm-HA公司与非转基因相比跑步2，但无论是基因还是组织都没有显著差异的5′-转录表达Ranbp2.C、，Ranbp2和Tg-Ranbp2蛋白表达水平的定量CLDm-HA公司在4周龄和6周龄的野生型和Tg-范围2CLDm-HA公司::跑步2−/−分别是。显示了典型的免疫印迹和负载控制在下面图表。细胞溶质热休克蛋白70被用作负荷控制。D、，Tg-Ranbp2的免疫定位CLDm-HA公司视网膜放射状切片中的蛋白质(上部面板)和神经节神经元胞体的视网膜扁平支架(下部面板)抗HA抗体。Tg-Ranbp2CLDm-HA公司分布于视网膜神经元的细胞体中，在感光细胞的睫状区和神经节神经元的胞体中有显著表达。Tg-Ranbp2的积累增加CLDm-HA公司与天然Ranbp2相比，感光细胞的睫状体区域图3).插入是更高倍的装箱的睫状体区域。比例尺，25微米。E、，sumoylated RanGAP蛋白表达水平的定量(RanGAP公司*)、HDAC4和26S蛋白酶体19S帽的S1亚基，以及HDAC4型与野生型小鼠相比，在10-12周龄时，sumoylated RanGAP和HDAC4（而非S1亚单位）的水平降低Tg-范围2CLDm公司:跑步2−/−并且没有伴随的转录水平的变化HDAC4型显示了典型的免疫印迹和负载控制在下面图表。Hsc70或GADPH用作加载控制。F、，24周龄野生型和Tg-Ranbp2CLDm公顷::跑步2−/−小鼠单泛素水平(Ub（英国）)，双泛素(Ub（英国）2)，和共轭多泛素(P-Ub型n个)在视网膜和肝脏中。定量分析显示在免疫印迹旁边。G中，DUB活性在视网膜可溶性蛋白酶体部分选择性增加Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。与年龄匹配的野生型和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−小鼠对Lys-63连接的氘化酶活性(K63-Ub公司4,左边)和Lys-48联(K48-Ub型4,中间的)在24周龄时，DUB抑制剂PR-619和1,10-菲咯啉分别增加了四泛素Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−.H、，与年龄匹配的野生型和Tg-Ranbp2R2944A-HA型::Ranbp2型−/−小鼠，24周龄时20S蛋白酶体的糜蛋白酶样活性选择性降低Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−小鼠，尽管任何基因型之间的胰蛋白酶和胱天蛋白酶样活性都没有变化(正确的).我，与年龄匹配的野生型和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−小鼠，在24周龄的洋地黄素通透性视网膜颗粒中，26 S蛋白酶体19 S帽的S1和S5b亚单位大量积累Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠，而任何基因型之间的可溶性蛋白酶体部分均无变化。显示了定量分析在下面免疫印迹。乙酰化α-微管蛋白(交流电-α浴缸)是加载控件。数据如所示B、 C、，和E–I公司表示平均值±S.D。；n个= 4.ONL、，外核层（感光细胞胞体）；印度卢比，内核层（二级神经元胞体）；GC、，神经节细胞；不另说明。，不显著；HDAC4、，组蛋白去乙酰化酶-4；−/−，跑步2−/−;Tg-R2944A-HA,Tg-Ranbp2R2944A-HA型.比例尺，10微米。

就像Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠Tg-Ranbp2CLDm-HA公司挽救了胚胎的致命性跑步2−/−在小鼠中没有明显的显性表型Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−24周大。然而，149个杂交后代的基因分型跑步2+/−和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−小鼠产生25只，而不是预期的50只Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−老鼠(第页= 0.000015). 与预期孟德尔比率的显著偏差支持约50%的Tg-范围2CLDm公顷::跑步2−/−小鼠胚胎性死亡。的测量跑步2具有存活的3′端引物的转录物Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−老鼠发现了Tg-Ranbp2CLDm-HA公司在视网膜和肝脏中的表达水平比野生型转录物高约4倍，但在针对5′端的引物中没有观察到这种变化跑步2任一组织的转录本(图9B类)可能是因为选择性剪接转录本之间的转录差异。然而，野生型和Tg-Ranbp2的表达水平CLDm公顷蛋白质在野生型和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−分别是小鼠(图9C类). 亚细胞表达和分布Tg-Ranbp2CLDm-HA公司在里面Tg-Ranbp2CLDm公顷::跑步2−/−小鼠也与观察到的小鼠相似Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−(图9D类，另请参见图3). Tg-Ranbp2CLDm-HA公司与非转基因野生型小鼠相比，在感光细胞的连接纤毛中表现出显著的积聚，而在其他神经元中的定位和表达，如视网膜神经节细胞中则不明显(图9D类，另请参见图3).

然后我们检查了Tg-Ranbp2的作用CLDm-HA公司26S蛋白酶体19S帽的SUMO-1-RanGAP、HDAC4、S1亚单位（酵母命名法中的Rpn2）水平和泛素稳态(图9,E类和F类). 与野生型相比，Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−小鼠的SUMO-1-RanGAP和HDAC4水平显著降低，但S1水平没有显著降低，并且在HDAC4型，在视网膜中(图9E类). 与之相反Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−24周龄小鼠的视网膜和肝脏匀浆中的游离泛素和结合多泛素水平没有变化Tg-范围2CLDm-HA公司::跑步2−/−老鼠(图9F类，另请参见图8,A类和C类).

Ranbp2之间泛素-蛋白酶体系统的去调节R2944A-HA型：Ranbp2−/−和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司：：Ranbp2−/−

鉴于Ranbp2的结构域CY和CLD在蛋白质平衡和泛素体内平衡中的作用，我们比较了24周龄野生型和野生型之间洋地黄渗透性视网膜可溶性部分的26S蛋白酶体活性Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::Ranbp2型−/−老鼠。我们首先比较了S13（酵母命名法中的Rpn11）以及26 S蛋白酶体19S帽的可能其他松散相关的异肽酶的去泛素活性。DUB酶的异肽酶活性对氘基化底物至关重要，随后在26S蛋白酶体中展开和降解(101). Jab1/Mov34/Mpr1 Pad1 N末端（JAMM）型异肽酶（如S13亚基的异肽酶）和半胱氨酸型异肽酶类的活性分别通过对抑制剂1,10-菲咯啉和PR-619的敏感性进行区分(102,103). 我们还使用两种类型的多泛素链，Lys-48和Lys-63连接的泛素链来测量DUB活性。与前者结合的蛋白质底物是蛋白酶体降解的靶点(104)而后者被认为与非蛋白水解功能有关，如细胞内信号传导(105). 与其他基因型相比，在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠受到半胱氨酸型异肽酶的抑制，而任何基因型之间的JAMM-型异肽酶类活性均无差异(图9克). 相比之下，对Lys-48连接泛素链的氘化酶活性在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−JAMM-型异肽酶活性受到抑制的小鼠，而任何基因型的半胱氨酸型异肽蛋白酶活性没有变化(图9克). 接下来，我们比较了三种基因型之间20S蛋白酶体的三种蛋白水解活性。如所示图9H（H），糜蛋白酶样活性在Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−老鼠。最后，我们检测了19S调节帽的成分亚细胞分配的变化，如与Ranbp2的CLD相互作用的S1亚基，以及与S1相互作用的泛素受体S5b亚基(106)，因为它们可能有助于与26S蛋白酶体相关的活性变化(88). 尤其是，Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−与所有其他基因型相比，蛋白酶体19S调节颗粒的S1和S5b亚单位在洋地黄素固体化视网膜提取物颗粒中有显著积累，尽管在所有三种基因型的用于去泛素化和20S蛋白酶体测定的胞质/可溶性部分中没有观察到S1水平的变化(图9我).

Tg-Ranbp2中视觉诱发电位的干扰R2944A-HA型：：Ranbp2−/−

M-opsin在视锥细胞中的选择性聚集和下调以及视网膜内神经元hnRNPA2/B1水平的降低Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠促使我们检查这些以及其他分子和亚细胞表现是否伴随着视网膜或视觉通路的电生理变化。神经退行性疾病，如ALS、多发性硬化、视神经萎缩和几种视网膜病变，都表现出通过该途径传播的障碍(107,–110). 我们通过适应光和暗的ERG以及通过视觉通路（包括视网膜神经节细胞）在VEP中的传输来检测视锥和视杆感光器的功能。图10,A类和B、，展示了分别在暗适应和光适应条件下对8周龄小鼠获得的频闪ERG结果。没有显著差异（全部第页>0.05）之间(图10A类)或光适应ERG振幅(图10B类)第页，共页Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠与跑步2R2944A-HA型::Ranbp2型+/−或跑步2+/−室友。从24周龄的动物中也获得了类似的结果（数据未显示）。与其他基因型的同胞相比，24周龄的VEP振幅Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−暗适应条件下的小鼠没有显著差异(图10C类)或适应光线(图10D类)条件。然而，在暗适应条件下，VEP内隐时间在Tg-Ranbp2944兰特/公顷::跑步2−/−小鼠与跑步2R2944A-HA型::Ranbp2型+/−(第页<0.05）或跑步2+/−(第页<0.01）基因型(图10E类). 光适应VEP内隐时间无显著差异跑步2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠与其他基因型小鼠的比较(图10F类).

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视网膜视杆和视锥光感受器及视网膜内侧神经元的电生理反应Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。暗适应的亮度响应功能(A类)和光适应(B类)从8周龄小鼠获得的ERG。VEP振幅的亮度响应函数(C类和D类)和隐含时间(E类和F类)在暗适应条件下从24周龄小鼠中获得(C类和E类)和光适应(D类和F类)刺激条件。在暗视野中未发现基因型之间的显著差异(A类)和明视(B类)一-和b条-波和VEP振幅(C类和D类). 暗适应下的VEP隐式时间(E类)，但不适应光照(F类)刺激条件，在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠与跑步2944兰特/公顷::跑步2+/−(第页<0.05）或跑步2+/−(第页<0.01）基因型。数据点表示平均值±S.E。；n个= 9–10. −/−,跑步2−/−; +/−,跑步2+/−;Tg-R2944A-HA,Tg-Ranbp2R2944A-HA型.

讨论

这些研究揭示了Ranbp2亲环素结构域的新颖且独特的功能、生理和多形性特征，这对我们理解其他亲环素和Ranbp2的多效性作用具有重要意义。如所示图11这些特性表现为：（i）Ranbp2的CY在M-opsin中的PPIase非依赖性和选择性C-末端伴侣活性，而不是S-opsin生物生成；（ii）潜在和激活的STAT3和STAT5与Ranbp2的CY的均匀结合，而不管其PPIase和C末端伴侣活性的损失；（iii）hnRNPA2/B1的选择性PPIase依赖性转录后下调，同时核和非核小室间HDAC4亚细胞分配失调；（iv）双泛素和泛素化底物以组织和年龄依赖方式选择性PPIase依赖性下调；和（v）磷酸化后CY的PPIase活性下调，选择性细胞外刺激可能促进这种修饰(79,111). 此外，这些研究表明，Ranbp2的CLD在生理上选择性地调节SUMO-1-RanGAP和非氨酰化HDAC4的蛋白沉积以及20S蛋白酶体的类糜蛋白酶活性，而不损害26S蛋白酶体S1亚基的蛋白沉积。相反，Ranbp2的CY的PPIase活性的丧失促进了S1和泛素受体S5b的积累，后者是26S蛋白酶体19S帽的亚单位，这种效应可能导致泛素蛋白酶体系统相关活性的变化。

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描述Ranbp2的CY对不同底物蛋白质平衡的特异性和生理活性的模型。Ranbp2的CY对生理底物具有三种不同的生物活性。首先，Ranbp2的CY的C末端结构域对M-opsin具有选择性的伴侣活性。Ranbp2 CY的C末端伴侣活性受损可促进M-opsin在锥体光感受器中的聚集和积累。其次，Ranbp2的CY的PPIase活性是hnRNPA2/B1蛋白质平衡所必需的。抑制CY的PPLase活性导致hnRNPA2/B1转录后下调。这还伴随着双泛素的下调，这一效应促进选择性氘化酶的激活和泛素化底物水平的降低。第三，Ranbp2的CY呈现另一个子域，它介导潜在和激活STAT3/STAT5的结合。CY中的STAT3/STAT5结合域与其PPIase和C末端伴侣结构域不同，目前尚未从分子上进行定义。最后，这项工作支持了CY的PPIase活性是由其活性PPLase位点附近至少一个残基（Ser-3036）的磷酸化调节的。CY的磷酸化可能受到细胞外刺激的调节(例如细胞因子），以及CY翻译后修饰的生理意义尚未确定。Ranbp2的CY用丝带代表。残留物Ser-3036和Arg-2944如下所示橙色棍子并且CY的催化PPIase位点的其他残基显示为绿色木棍.

Ranbp2细胞色素的PPIase非依赖性伴侣活性对M-opsin的生物发生至关重要

本研究揭示的Ranbp2的CY结构域的第一个生理作用是其在M-opsin生物发生中的选择性作用，其特征是M-oppin的转录后积累及其在M-和M/S-锥体光感受器中的聚集。与在锥体中缺乏Ranbp2表达的小鼠相反(69)，这些表现没有触发视网膜上锥体感光器的退化，也没有引起光适应ERG的明显缺陷，一种以双极性细胞活动为主的电生理测量方法，这一特征可能是其灵敏度相对较低的原因。值得注意的是，M-和M/S-锥体光感受器形成的细胞和分子表现在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−这支持了CY的PPIase活性对M-opsin的生物生成不是必需的。相反，CY的C末端结构域在M-视蛋白的蛋白稳定中起着重要的伴侣作用。这些观察结果令人惊讶，因为它们揭示了CY的生理特性，并揭示了CY与CY之间的重要机制差异体内功能研究和使用异源表达系统的先前研究，其中发现Ranbp2的CY的PPIase活性可促进M-opsin亚型与Ranbp2 RBD4的相互转化和关联(17,18). 在这方面，我们的工作支持，Ranbp2的CY中缺少一个自由的C末端结构域，无论CY的PPLase活性如何，都会促进M-opsin的积累，因为在CY的C末端添加HA标签会导致其对M-oppin的伴侣活性丧失或干扰。此外，这种伴侣活性可能在Ranbp2和NinaA的CY同源结构域之间保守(37). 因此，Ranbp2的CY伴侣活性代表了CY对异源表达系统观察到的M色素生成增加的决定活性(17).

亲环素的伴侣活性对视蛋白的生物发生至关重要，这一观点也得到了对以下基因的详尽饱和突变筛选突变分析的支持：尼娜属于果蝇属(36,37). NinaA中所有影响视蛋白生物发生的突变残基的结构图谱表明，许多突变残基聚集在结构紊乱的C末端区域（P米)远离PPIase位点(37). 尽管Ranbp2的NinaA和CY在拓扑上是不同的(27,30,31,58,–60)这些研究表明，它们可能在C末端区域的亚结构域中具有相似的活性，以伴随视蛋白的生物发生。尽管NinaA伴侣活性可能在视蛋白共翻译插入内质网和分选途径时需要，但Ranbp2的伴侣活性可能需要在M-opsin翻译开始后的初始内质网预锁步骤中，其中mRNA的稳定和翻译可能在M-opsin分选或两者兼而有之期间发挥重要作用。观察到M-视蛋白(操作1兆瓦)mRNA水平在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−，但不是Tg-Ranbp2水处理-HA::Ranbp2型−/−，提示CY的PPLase活性可能对辅助因子发挥独立作用M-视蛋白mRNA稳定。相比之下，调制的稳定性S-视蛋白(操作1sw)mRNA似乎需要Ranbp2的CY的伴侣活性，因为这两个转基因系都表现出转录水平降低S-视蛋白由于M-和S-视蛋白在M/S-锥体中共同表达，因此M-视蛋白的选择性翻译后积累可能触发了细胞的代偿性下调S-视蛋白在这方面，值得注意的是，已知亲环素结合免疫抑制剂CsA和RNA聚合酶II的脯氨酸异构化可促进RNA的不稳定，例如白细胞介素-3 mRNA的不稳定性(112,113).

我们的数据还表明，M-opsin的选择性积累和聚集可能是由于在所有转基因株系的连接纤毛处观察到Ranbp2的积累，从而导致其细胞内运输受损所致，这一定位也由先前对人类视网膜的研究所暗示(75). Ranbp2的睫状体定位表明其CY伴侣活性在M-opsin向外节的睫状运输中起作用。有趣的是，新出现的证据支持，尽管Ranbp2通常被描述为核孔蛋白（核孔复合体的组成部分），但通过睫状结构和核孔进行货物运输的某些特征具有相似的成分和机制(114). 在这方面，核孔复合体和纤毛分别构成了选择核质和纤毛运输货物的扩散屏障。这些贩运过程的调节机制由小GTPase Ran驱动的核-细胞质和纤毛-细胞质梯度共享，其Ran-GTP在核和纤毛隔室中浓度高，在细胞质中浓度低(115,116). 两个高亲和力的Ran GTPase-binding合作伙伴，Ranbp1和Ranbp2，是有助于建立Ran GTPase梯度以及在与Ranbp2对接时从受体或伴侣装载和释放货物的关键组件(117,–120). 此外，Ranbp2与Rpgrip1相互作用，Rpgrip2是一种重要的睫状体成分，用于修饰感光细胞的纤毛（外段）(121,122). 因此，如本研究所观察到的，Ranbp2的CY伴侣活性受损可能会解除对M-opsin贩运的调控，并导致其聚集在感光细胞的外段。Ranbp2在睫状体贩运中的关键作用也得到了之前对缺乏跑步2在锥体光感受器中，因为在锥体变性之前，这些小鼠在连接纤毛处出现大量电致密度物质积聚(69). 另一种可能是Ranbp2的CY导致M-opsin聚集后转录后下调，因为核质输出、翻译或转运M-视蛋白抄本。为此，Ranbp2参与增强编码分泌蛋白mRNA的翻译或elF4E介导的核输出和选择性转录物的翻译(123,124). 所描述的两种情况都不是相互排斥的，需要进行后续研究以更深入地研究这些机制。

Ranbp2的CY向STAT3/STAT5呈现独特的交互子域

CyPB与STAT3和STAT5相互作用。CyPB和NinaA一样，是一种内质网驻留的亲环素(125)但CyPB与STAT3的相互作用发生在分泌和细胞对细胞因子（如IL-6）的再摄取时的细胞核中(83). 有趣的是，STAT3反激活电位依赖于培养细胞中CyPB的PPLaase活性(83). 然而，CsA抑制CyPA（和CyPB(83). 因此，STAT3信号似乎依赖于CyPA和CyPB介导的互补信号通路。然而，尚不清楚CyPA和CyPB的PPIase和伴侣活性在IL-3信号传导中是否起到互补作用。此外，缺乏对其在IL-3信号传导中作用的生理学验证。这具有高度相关性，因为CyPA和CyPB与Ranbp2的CY具有高度同源性，并且通过Ranbp2与核进出口受体的直接相互作用在核质转运底物中发挥作用(62,63). 因此，Ranbp2的CY可能具有与STAT3/STAT5信令中的CyPB和/或CyPA类似的功能特性。事实上，我们的研究表明，在培养的细胞中，STAT3/STAT5与Ranbp2的CY单独相关，并且在生理上与转基因Ranbp2相关，而不管其PPIase和C末端伴侣活性的损失如何。此外，这些活性的受损并不影响STAT3的强大应激依赖性激活，也不影响野生型和野生型之间应激诱导的凋亡感光细胞体的发育Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−老鼠。这些数据揭示了Ranbp2的CY的另一个特殊特征，即STAT3/STAT5与CY的结合独立于其PPIase和C-末端伴侣活性。因此，这些结果强烈支持CY中存在另一个亚结构域，该亚结构域对STAT3/STAT5相互作用至关重要，并与CY C末端亚结构域不同，后者是M-opsin生物发生的核心。其他研究将探讨CY中STAT3/STAT5结合子域的身份，以及CyPA和/或CyPB在生理上补偿其功能丧失的程度。

Ranbp2 CY的PPLase活性对hnRNPA2/B1蛋白平衡至关重要

在本研究中，我们寻找的底物的蛋白质平衡依赖于Ranbp2的CY的PPIase活性，因为在M-opsin的生物发生和STAT3/STAT5的蛋白质平衡方面Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−和Tg-Ranbp2水处理-HA::Ranbp2型−/−线。我们发现，hnRNPA2/B1在视网膜内神经元中高度表达，其转录后水平（而非转录水平）在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−与Tg-Ranbp2水处理-HA::跑步2−/−和非转基因系。与M-opsin和STAT3/STAT5相比，我们发现hnRNPA2/B1不能形成稳定的复合物体内对于Ranbp2，支持hnRNPA2/B1和Ranbp2之间的相互作用可能是暂时的，这与CY在底物上的催化活性一致。这一结果显然与一项研究不一致，该研究发现CyPA与HeLa细胞中的hnRNPA2相关，而趋化因子CXCL12的刺激会强烈增强这种效应(111). 然而，我们的研究不能排除Ranbp2的CY对hnRNPA2/B1蛋白稳态的间接影响，也不能排除hnRNPA2/B1与Ranbp2 CY的关联依赖于控制CY的PPIase活性的生理刺激，这由磷酸化突变体CY的PPIase活度降低所支持S3036E系列值得注意的是，任何线之间的外视网膜（光感受器）的电生理反应都不显著，尽管内视网膜神经元诱发的暗适应但非光适应的VEP在Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−这表明杆通路受到选择性影响，但损伤该神经通路的确切潜在机制需要进一步研究。然而，较短的暗适应VEP潜伏期令人惊讶，因为它表明hnRNPA2/B1中的PPIase依赖性缺陷促进了通过视网膜的神经传递减少和/或神经节细胞轴突的传导速度增加，这可能是由于髓鞘化增加所致。因为我们没有发现外视网膜中有任何ERG和hnRNPA2/B1变化，最可能的情况是，Ranbp2 PPIase活性丧失后，内视网膜中hnRNPA2/B1水平的降低选择性地增强了hnRNPA3/B1的活性，导致暗适应VEP潜伏期缩短。此外，以下观察也支持hnRNPA2/B1蛋白质组的变化是暗适应VEP潜伏期减少的主要原因：（i）Ranbp2是核输出受体CRM1/exportin-1的对接位点(63)；（ii）Ranbp2选择性地影响RNA结合蛋白hnRNPA2/B1的水平，如本文所示；（iii）Ranbp2结合单链RNA(126)；和（iv）Ranbp2刺激细胞培养中内质网靶向和可能的线粒体靶向蛋白质的mRNA输出和翻译(123,124). 最后，尽管没有持续检测到PPLase活性在体外与CY1944年2月，可以说Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−小鼠的CY-PPLase活性可能仍处于极低水平。例如，具有对应R55A替换的突变CyPA呈现在体外0.1%的野生型蛋白质PPIase活性，其对肽基丙基底物的催化效率高于Ranbp2的CY(78). 此外，基本酵母细小蛋白Ess1的PPLase活性水平极低，人们仍然认为这是Ess1生物功能所必需的(127)尽管其哺乳动物同源基因Pin1的表达缺失并不影响小鼠的生存能力(97,128,129). 未来对缺乏Ranbp2 CY表达的小鼠的研究将有助于识别与跑步2R2944A-HA型表达和本研究确定的CY底物。

如前所述，在易于聚集的朊蛋白样结构域中影响hnRNPA2/B1的突变会导致多系统蛋白病和ALS，并促进hnRNPA2-B1的核质分配变化和应激颗粒的稳态(90). 值得注意的是，CyPA还与hnRNPA2合作，并促进其核出口(111)而CsA在细胞培养中诱导朊蛋白聚集物的形成(56). 在这项研究中，我们发现hnRNPA2/B1的相对亚细胞分配在所有基因型中都没有发生生理变化。因此，尽管Ranbp2的CY的PPIase活性调节hnRNPA2/B1的蛋白质平衡而不影响其核质穿梭，但Ranbp2其他结构域和伙伴很可能调节这一穿梭过程(63). 最后，ALS患者在出现运动症状之前，VEP也发生了深刻变化(107). 因此，重要的是要找出神经节视网膜和运动神经元之间是否存在类似或类似的Ranbp2依赖性病理机制，以及Ranbp2调节的其他因素（如HDAC4）对疾病表达的贡献。

Ranbp2下调泛素平衡的PPLase活性

免疫亲素失去催化活性被认为会降低蛋白质的折叠速度，并增加其错误折叠、错误组装和聚集的倾向。这些错误折叠的副产物的形成被认为会削弱蛋白酶体的活性，并导致泛素化体的形成，这是许多神经退行性疾病的主要特征(99). 然而，单泛素和双泛素似乎分别选择性地控制泛素C末端水解酶L1（UCH-L1）和-L3（UCH-L3）的去氢活性(130). UCH-L1和UCH-L3与家族性帕金森病有关(131)纤细轴索营养不良(132)和视网膜变性(133)分别为。总之，这些强调了泛素稳态在神经元功能中的重要性。这项研究发现，PPLase活性的丧失会导致泛素稳态的年龄和组织依赖性放松调节，这反映在体内观察到的游离双泛素和泛素化蛋白种类的减少Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−，但不是Tg-范围2CLDm-HA公司::跑步2−/−和野生型小鼠。泛素稳态中这种选择性和显著的PPIase依赖性变化出乎意料，因为在细胞培养中，只有Ranbp2的CLD被认为能促进泛素化底物的积累，而这种效应被Tg-范围2CLDm-HA公司::跑步2−/−老鼠(88). 再次，我们的数据支持当Ranbp2的结构域单独在细胞培养中表达和作为完整生理系统中整个蛋白质的一部分表达时，其生物学行为之间的差异，其中Ranbp2结构域和伙伴之间的串扰发生在其原生性生理环境中。该研究和其他研究支持Ranbp2中确实存在域间串扰(17,18,134). 例如，本研究表明，Ranbp2的CY和CLD模块分别在HDAC4的亚细胞分配和蛋白质平衡中发挥互补作用。此外，Ranbp2结构域（如CLD）的选择性活性丧失也会触发补偿机制，如Tg-Ranbp2CLDm-HA公司::跑步2−/−在发育过程中，但不是出生后。

先前的调查结果在体外在细胞培养的支持下，双泛素抑制半胱氨酸蛋白酶UCH-L3的去氢奎宁活性(130). 与这些数据一致，我们的结果表明Tg-Ranbp2R2944A-HA型::跑步2−/−低水平的双泛素在生理上表现出半胱氨酸蛋白酶家族DUB对Lys-63连接的泛素链的DUB活性增加。我们的研究结果也支持Ranbp2的PPIase功能缺失通过半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶（MPN）的DUB促进Lys-63和Lys-48连接泛素链的选择性和差异性氘化+/JAMM）家族(例如Rpn11）。这些数据表明，Ranbp2的CY的PPIase活性在通过蛋白酶体和非蛋白水解功能（如细胞内信号传递）调节蛋白质降解的靶向性方面发挥着不同的作用。Ranbp2、DUB和底物及其特性之间的相互作用需要在未来的研究中解决。无论如何，本研究支持过量S1（Rpn2）和S5b（Rpn13）的保留提取可溶性蛋白酶体后，非胞质组分中蛋白酶体19S帽的亚单位促进泛素化底物的分子和亚细胞分配以及DUB活性在选择性组织（如视网膜）中偏离26S蛋白酶体。CLD损伤对类糜蛋白酶而非20S蛋白酶体的胰蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶活性的影响也支持Ranbp2和蛋白酶体核心蛋白酶活性之间的选择性相互作用。总的来说，我们的研究表明，Ranbp2的CY的PPIase活性丧失导致泛素稳态失调，从而促进蛋白质稳态和泛素稳态的累积性（年龄依赖性）和选择性损伤。在这方面，还必须确定Ranbp2对HDAC4失调在控制泛素蛋白体系统稳态的基因的年龄依赖性重编程中的作用(95).

总之，这些研究揭示了Ranbp2亲环蛋白结构域的高度复杂性和功能特性，可能与其他亲环蛋白共享。Ranbp2的CY所具有的鉴别生理活性反映了Ranbp2 CY不同亚域在生理底物上的新的细胞上下文依赖性作用，其功能依赖于Ranbp2中CY的伴侣或PPIase活性。Ranbp2的CY的不同构象亚状态也可能有助于其可识别的特异性活动(135,136). 无论如何，这些活性对支持多种疾病和致病过程的底物的影响将为开发新的药理策略铺平道路，以利用和揭示亲环素的新治疗潜力。

致谢

我们感谢J.M.van Deursen（梅奥诊所）用鞭子抽吸Ranbp2；Neal Copeland（卫理公会医院研究所，前NCI），负责BAC重组载体和方案；Cheryl Bock（转基因小鼠设施）和Ute Hochgeschwender（杜克大学医学中心杜克神经转基因实验室）将BAC构建物微量注射到单细胞受精小鼠胚胎中；Jeremy Nathans和Vasanth Rao/Samuel Zigler分别检测JH455和γ-晶体抗体。

*这项工作得到了美国国立卫生研究院EY019492、GM083165和GM083165-03S1（致P.A.F.）、2P30-EY005722（致杜克大学眼科中心）和5P30NS061789（致杜克神经转基因实验室）的全部或部分支持。这项工作还得到了抗击失明基金会、退伍军人事务部以及克利夫兰诊所预防失明研究无限制奖项的支持。

5使用的缩写如下：

PPI酶
肽基脯氨酸顺-反式异构酶
跑步2
Ran-binding蛋白2
4号皇家银行
运行绑定域4
美国银行
细菌人工染色体
斯达
信号转导子和转录激活子
塞浦路斯
Ranbp2亲环蛋白结构域
环孢素A
环孢菌素A
FKBP公司
FK506结合蛋白
CyP公司
亲环蛋白
CLD公司
亲环素样结构域
HDAC4型
组蛋白去乙酰化酶-4
RanGAP公司
Ran GTPase激活蛋白
UCH-L公司
泛素C末端水解酶
授予称号
氘基化酶
mRFP公司
单体红色荧光蛋白
二维图
双向差异凝胶电泳
肌萎缩性脊髓侧索硬化症
肌萎缩侧索硬化
ERG公司
视网膜电图
VEP公司
视觉诱发电位
冠状病毒
综合密度值
qRT（定量放射治疗）
定量RT
国际单项体育联合会
免疫荧光
IB公司
免疫印迹
TRITC公司
异硫氰酸四甲基罗丹明
第页不适用
第页-硝基苯胺
成功
琥珀酰
光盘
坎德拉
Tg（千克）
转基因
hnRNPA2/B1
异质核核糖核蛋白A2/B1。

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来自的文章生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会