生物化学杂志。2014年2月21日;289(8): 4546–4552.
快速逆转分子陷阱拮抗剂的可光解二聚体*
,1 ,1 ,和2
舒比尔·艾哈迈德
加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所分子医学系,邮编:91010
谢军(Jun Xie)
加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所分子医学系,邮编:91010
大卫·霍恩
加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所分子医学系,邮编:91010
约翰·威廉姆斯
加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所分子医学系,邮编:91010
加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城贝克曼研究所分子医学系,邮编:91010
1两位作者对这项工作的贡献相等。
2013年8月24日收到;2013年12月19日修订
背景:快速打开和关闭急性拮抗剂的能力有助于理解细胞程序的启动。
结果:制作了一种可光解的模拟物并进行了功能演示。
结论:获得了内体分散和修复的精细时间控制。
意义:陷阱和可光解类似物的结合为研究生物体内单个细胞内的信号提供了新途径。
关键词:Dynein、内分体、显微镜、微管、信号传导、分子陷阱、器官、可光解拮抗剂
摘要
在此,我们报道了AP20187的可光解类似物的开发,AP20187是一种细胞渗透性分子,用于二聚FK506结合蛋白(FKBP)融合蛋白,并启动生物信号级联和基因表达或破坏蛋白-蛋白质相互作用。我们证明,这种试剂具有快速、特异地对抗分子相互作用的独特能力体外由于这种强烈的对抗,遵循生物过程(例如内体分散),并在光分裂时释放陷阱,以跟随细胞恢复内环境稳定。此外,这种可光裂解的AP20187类似物可用于其他系统,其中FKBP的二聚化已被用于启动信号通路,提供了将信号事件的持续时间与细胞反应相关联的能力。
关键词:Dynein、内分体、显微镜、微管、信号传导、分子陷阱、器官、可光解拮抗剂
介绍
快速特异性调节所选蛋白质和大分子复合物活性的能力对于解析复杂大分子系统中的关键功能至关重要(例如信号转导、蛋白质运输、细胞分裂)(1,2). 结合功能分析,如成像、免疫沉淀、Western blot分析、RT-PCR等,干扰特定蛋白的功能可以揭示新的关联、关键的翻译后修饰以及上游和下游效应器。尽管存在有助于此类分析的小分子抑制剂(例如蛋白激酶、组蛋白去乙酰化酶、蛋白酶和G蛋白偶联受体抑制剂),这些抑制剂的作用主要集中在一小部分酶上,这些酶通常是治疗靶点。事实上,只有2%的预测人类基因产物(主要是激酶)被小分子成功靶向,估计只有10-15%的人类基因组是“可用药的”(三). 因此,存在一个巨大的差距,即只有少数基因产物可以使用小分子抑制剂进行研究,而剩余的85-90%的基因产物却缺乏有用的抑制剂。
新型小分子抑制剂数量有限,其来源多种多样,部分原因是大量基因产物充当大分子复合物的成分,并通过扩展的表面接触与各自的靶点结合。这些相互作用的结合亲和力和特异性是通过多重弱相互作用产生的,蛋白质靶点通常缺乏酶中常见的深的、溶剂封闭的缝隙(4,5). 此外,许多蛋白质具有共同的结构域,因此潜在的抑制剂可能以共同结构域为靶点,因此可能缺乏所需的特异性并产生非靶点效应。
为了解决这个问题,利用蛋白质相互作用固有的特异性和亲和力,同时保持小分子拮抗剂的优势,我们最近开发了化学诱导的分子陷阱,使用细胞可渗透的小分子AP20187(以下简称AP)三二聚FKBP-肽融合以产生高亲和力的二价“配体”,快速折磨特定靶点(6)(请参见A类). 我们证明了动力蛋白轻链LC8或TcTex1分子陷阱的表达和随后的二聚化会立即影响动力蛋白相关过程(例如内体、溶酶体和高尔基体分散体)(6). 逆转这种扰动的能力将为分子过程提供当前技术无法提供的额外、强大的见解(例如siRNA或显性阴性结构的表达)。然而,我们无法“洗掉”化学二聚体AP,因此无法逆转对系统的扰动并跟随其恢复稳态。为了解决这一缺点,我们创造了一种可光解的AP(以下称为PhAP),它在切割后降低陷阱的价态,释放靶向内源性配体,并允许人们破坏生化过程并遵循其恢复平衡。
分子诱捕利用FKBP的化学诱导二聚作用来创建二价、高亲和力配体,以隔离内源性蛋白质或直接对抗界面。
A类,捕获机制的示意图。以低亲和力作为单体与LC8结合的动力蛋白中间链(IC)肽与FKBP融合(绿色). 添加可光降解的AP类似物PhAP,可创建与LC8结合的高亲和力陷阱(红色),与内源性配体(IC,蓝色线条),并诱导与动力蛋白拮抗相关的表型(例如内体分散)。多价络合物高度稳定。B类,带有硝基苄基部分的PhAP(如椭圆形). 光可分解二聚体(PhAP)的产生将促进解离,并在暴露于紫外光后逆转拮抗作用。C类内体分散度是AP/PhAP浓度的函数。EGFP-FKBP-LC8型捕集器用不同浓度的AP处理转染COS1细胞(红色)或使用PhAP(蓝色)AP和PhAP对内体分散度的影响与浓度的作用相同。最大分散度为500 n米并且随着药物浓度的进一步增加而保持不变。D类,内体分散度随时间的变化。EGFP-FKBP-LC8型捕集器用500 n米AP公司(红色)或使用PhAP(蓝色)用于不同的时间。AP和PhAP对内体分散度的时间依赖性相同。药物治疗2小时后达到最大分散度,并随着时间的进一步增加保持不变。在每个病例中,细胞被固定并染色以获得早期内体标记(EEA1),100个细胞被计数以获得内体分散。每个实验重复三次(n个= 3).误差线表示平均值±S.E。
实验程序
PhAP的合成
至二醇(9.5 mg,0.045 mmol,1 eq)在CH中的搅拌溶液2氯2添加酸(70 mg,0.1 mmol,2.2当量)和催化剂4-二甲氨基吡啶和N个,N个-室温下二环己基碳二亚胺(24 mg,0.12 mmol,2.6 eq)。20小时后,通过过滤去除固体,并在真空中浓缩滤液。通过硅胶柱色谱(40–60%EtOAc/己烷)纯化残余物,得到产物(70 mg,70%)。高分辨率质谱C86H(H)103N个三O(运行)24[男+女]+计算出1584.6824,得出1584.6830。
表达质粒的构建
LC8和FKBP-LC8捕集器在细菌表达载体(pET21D)中克隆、表达并纯化(6). 对于EGFP标签的FKBP-LC8捕集器,如前所述,该结构被克隆为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)哺乳动物表达载体(pEGFPC1;Clontech)的C末端融合物(6).
本机PAGE
LC8和FKBP-LC8捕集器以50μ的摩尔浓度混合米和1.2摩尔过量(60μ米)AP或2.4摩尔过量(120μ米)PhAP的。将混合物在4°C下培养5分钟。在16°C下使用8–25%梯度凝胶在Phast系统(GE Healthcare)上进行本地PAGE分析。
抗体和试剂
抗-EEA1单克隆抗体购自BD Biosciences,罗丹明结合驴抗鼠二级抗体购自Millipore,贴装培养基Permount购自Fisher Scientific,37%甲醛购自Sigma,Lipofectamine 2000购自Invitrogen,Opti-MEM培养基购自Gibco(Life Technologies),DMEM培养基和10×PBS来自Cellgro。
细胞培养
COS1细胞在补充有10%胎牛/小牛血清(Omega Scientific)的DMEM(Cellgro)中培养。根据制造商的建议,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)和Opti-MEM培养基(Gibco;Life Technologies)在80–90%融合的COS1细胞24小时培养物中进行转染。各种浓度(0–1000 n米)在转染后24小时将AP(Ariad Pharmaceuticals Inc.)和PhAP(由我们合成)加入每个实验孔中,并在分析细胞之前孵育不同的时间段。对于内体分散研究的可逆性,500 n米使用AP/PhAP。在每种情况下,在用紫外光(10分钟,365nm,4瓦)诱导之前,用PBS充分洗涤细胞,补充新鲜培养基,并在分析之前在37°C下恢复不同的时间段。
免疫染色和显微镜检查
为了进行免疫染色,将瞬时转染的COS1细胞在室温下用3.7%甲醛固定10分钟,然后按照前面所述进行后续免疫染色(6). 简单地说,用PBS将生长在25 mm盖玻片上的COS 1细胞清洗三次,用3.7%甲醛(Sigma)在PBS中处理以固定,并在室温下在PBS的0.5%Triton X-100(Sigma-)中渗透10分钟。然后用含有4%脱脂奶(无脂)和0.5%Triton X-100的封闭缓冲液培养细胞。加入抗-EEA1单克隆抗体,在同一缓冲液中以1:100的稀释度在室温下标记早期内体标记蛋白30分钟,将盖玻片清洗并与罗丹明结合的驴抗鼠二级抗体(1:100)孵育。清洗后,将盖玻片安装在载玻片上,以观察诱捕效果。使用配备有浸水×60物镜的奥林巴斯IX81自动倒置显微镜观察样品。通过计数每份盖玻片100个细胞来量化分散水平。我们认为位于核周区域的一簇EEA1染色的内体是“致密的”(参见B类),而遍布整个细胞的内体被认为是“分散的”(参见B类). 每项实验一式三份。使用配备IX81显微镜和Image-Pro软件的Spot RT Slider高分辨率冷却CCD相机获取图像。除非另有说明,否则使用Adobe Photoshop 7.0(Adobe Systems)对图像进行裁剪和处理。
基于细胞的内体分散物分析和量化。
A类,将EGFP-LC8瞬时转染Cos1细胞捕集器并接受AP治疗(红色)或PhAP(蓝色)预先确定的时间段(0.5、1和2小时),暴露于紫外线下,然后固定并用荧光标记的抗EEA1抗体染色。荧光显微镜用于定量AP或PhAP在内体分散体上的活性。每个数据点反映100个单元格(n个= 3).误差线表示平均值±S.E。B类,用PhAP处理时的内体分散(正确的)或AP(左边)用荧光显微镜观察。携带陷阱的转基因细胞绿色(GFP荧光)。内体(红色)转染细胞经PhAP或AP处理后分散。经紫外线处理后,经PhAP处理的细胞中的内胚体恢复到核周位置,而经AP处理细胞中的内胚体保持分散。请注意,未转染细胞(无GFP)的内体在任何处理下都保持致密,并作为阴性对照。
紫外线感应
对于内体研究的紫外线诱导和回收,用PBS洗涤细胞,并加入新鲜培养基。然后用手持式紫外线灯(365 nm/4瓦)处理清洗过的细胞10分钟,将紫外线灯保持在含有细胞的盖玻片上方2厘米处。然后在染色和分析之前,将细胞在37°C下恢复不同的时间。
ImageJ(NIH)量化
为了定量分析复合物的形成,我们使用了NIH的ImageJ软件。在每种情况下,都使用软件对扫描的PAGE上的条带进行量化。
结果
PhAP的合成
首先,我们用可光解的AP取代AP的胺连接剂,合成了一种UV诱导的可光解APo个-硝基苄基部分生成PhAP。这种合成依赖于中间体的使用5,按照前面的描述准备(7). 酸之间的最终耦合5和二醇6(8)生产了光可分解调制器PhAP(B类).
PhAP的体外表征
我们测试了是否用o个-硝基苄基部分会影响FKBP的二聚反应体外我们使用天然PAGE跟踪LC8和FKBP-LC8分子陷阱(LC8)的形成捕集器)PhAP的添加诱导的络合物(6). 向LC8和LC8的等摩尔混合物中添加PhAP后捕集器,我们观察到一个新的PhAP-LC8-LC8带捕集器迁移距离与添加AP(AP-LC8-LC8)产生的频带相同捕集器) (A类). 对这条新谱带的量化表明,需要高2倍浓度(2×)的PhAP才能产生与经AP处理的样品产生的谱带强度相同的谱带(B类).
LC8-LC8的原生PAGE分析捕集器络合物的形成及其在紫外线诱导下的分解。
A类PhAP活性的天然PAGE分析。LC8在凝胶前部附近迁移。LC8捕集器单体(即FKBP-IC肽)带正电荷,不进入凝胶。当LC8和LC8的等摩尔浓度混合时,形成络合物捕集器用不同摩尔浓度的AP或PhAP(1×、2×等)处理。B类,量化来自交流,LC8-LC8的本地PAGE分析捕集器使用AP或PhAP形成的络合物,暴露于紫外线(365 nm)达指定时间(min)。D类,复数带的强度比与LC8波段作为紫外线照射的函数。
接下来,我们描述了紫外线对PhAP-LC8-LC8的破坏程度捕集器复杂的体外我们生成了PhAP-LC8-LC8捕集器和AP-LC8-LC8捕集器复合物,并将每个复合物暴露于紫外线(365 nm/4瓦)下。本机PAGE显示PhAP-LC8-LC8对应的频带丢失捕集器复合物和UV诱导后对应于单个组分的带的强度的增加。PhAP-LC8-LC8对应的频带捕集器在紫外线照射5分钟的样品中,复合物的强度较低,照射10分钟后无法检测到。另一方面,LC8-LC8捕集器非光解AP(AP-LC8-LC8)诱导的复合物捕集器)持续,即使在紫外线照射30分钟后(C类). 络合物与LC8比值的带强度量化表明,在AP-LC8-LC8的情况下,比值保持不变捕集器而PhAP-LC8-LC8在紫外线照射10分钟后也无法检测到捕集器(D类).
紫外线诱导内皮细胞弥散逆转的体内研究
为了确定这些生化结果在细胞中是否具有相关性,我们研究了PhAP的光裂解是否可以逆转LC8诱导的内体分散表型捕集器和PhAP。最初,我们确定PhAP在细胞中的行为与AP类似。为此,我们使用绿色荧光蛋白(GFP)陷阱类似物EGFP-FKBP-LC8捕集器,以识别表达陷阱的细胞。用EGFP-FKBP-LC8瞬时转染COS1细胞捕集器24小时后,用PhAP或AP(0 n米-1000牛顿米)然后固定细胞并用早期内体标记物1(EEA1)染色。用PhAP或AP处理后,具有分散内体的细胞数量无法区分。在二聚体浓度大于500 n时,获得了具有分散内体的最大细胞数(PhAP为67.5±7.0%,非光解AP为64.1±7.6%)米(C类,,第一行)。在同一时间段内,使用任何一种二聚物,具有分散内体的细胞数量也相似,并且在过去2小时内未观察到任何变化(D类,,第二排)。AP和PhAP的值也与我们之前的研究一致(6).
表1
| 应付账款(%) | PhAP(%) |
---|
药物浓度(n米)一 | | |
0 | 26.9 ± 3.1 | 27.2 ± 2.5 |
10 | 44.4 ± 2.4 | 47.9 ± 8.1 |
20 | 53.0 ± 3.5 | 48.0 ± 5.0 |
50 | 55.5 ± 0.7 | 55.5 ± 1.3 |
100 | 56.2 ± 1.6 | 57.5 ± 2.4 |
500 | 64.1 ± 7.6 | 67.5 ± 7.0 |
1000 | 66.4 ± 2.5 | 67.7 ± 4.9 |
|
时间(h)b条 | | |
0 | 30.2 ± 2.8 | 29.0 ± 8 |
0.167(10分钟) | 45.0 ± 2.6 | 47.2 ± 2.5 |
0.5 | 53.6 ± 6.5 | 49.1 ± 3.3 |
1 | 53.8 ± 2.9 | 57.2 ± 5.2 |
2 | 69.8 ± 4.3 | 71.2 ± 2.0 |
4 | 70.9 ± 2.1 | 69.0 ± 4.9 |
|
药物治疗2小时后恢复c(c) | | |
0 | 69.1 ± 3.2 | 69.5 ± 2.4 |
1 | 68.9 ± 3.2 | 66.3 ± 3.2 |
2 | 70.7 ± 4.0 | 57.6 ± 2.6 |
4 | 69.5 ± 1.9 | 44.1 ± 2.3 |
8 | 70.3 ± 3.3 | 48.9 ± 3.9 |
|
药物治疗1小时后恢复d日 | | |
0 | 58.0 ± 4.3 | 57.8 ± 8.0 |
1 | 71.2 ± 2.5 | 56.4 ± 1.7 |
2 | 69.7 ± 3.6 | 55.7 ± 8.8 |
4 | 70.4 ± 3.1 | 46.7 ± 0.6 |
8 | 70.8 ± 1.9 | 48.1 ± 2.0 |
|
药物治疗30分钟后恢复e(电子) | | |
0 | 51.8 ± 4.4 | 53.2 ± 2.4 |
1 | 64.7 ± 2.0 | 53.7 ± 4.0 |
2 | 68.3 ± 3.7 | 50.8 ± 2.3 |
4 | 69.8 ± 4.3 | 48.0 ± 0.5 |
8 | 67.9 ± 1.9 | 49.3 ± 6.7 |
接下来,我们描述了紫外线诱导PhAP裂解后COS1细胞内体分散的可逆性。在这些实验中,瞬时转染细胞与PhAP或AP(500 n米)时间从0到2小时不等,然后快速清洗细胞,用新鲜培养基补充,然后暴露于紫外线(10分钟,365 nm,4瓦)。然后在紫外线辐射后0、1、2、4和8 h将细胞固定,并使用荧光显微镜在×60倍放大下成像。我们观察到,经PhAP处理的细胞,在紫外线照射后的前4小时内,内胚体逐渐恢复到核周区域(44.1±2.3%),8小时后弥散度略有增加(48.9±3.9%)(A类). 另一方面,当细胞用AP处理时,无论是否接受紫外线照射,在评估的所有时间点,内体都保持分散。作为内部对照,未转染的细胞(即不表达GFP)以相同的方式处理。紫外线照射后8小时内,这些细胞的内体分散度略有增加。值得注意的是,紫外线处理4小时后具有致密内体的细胞没有恢复到添加PhAP之前的百分比。然而,这并不完全出乎意料,因为我们通常观察到20-25%的细胞内体分散,包括添加PhAP或AP之前的trap承载细胞,以及未转染陷阱的细胞。我们还观察到,用PhAP或AP处理2小时后,转染陷阱的细胞中,最多有70-75%的细胞内体分散。我们怀疑,不完全恢复是由多种来源引起的,包括细胞异质性(9)瞬时转染的影响,以及细胞在整个实验过程中不同步的事实。然而,在使用不同方法干扰强啡肽介导的过程(包括RNAi)的基于细胞的分析中,也报告了这些值的类似扩散(10,11),显性阴性蛋白的表达(12)和/或微量注射单克隆抗体(13),所有这些都是不可逆转的。与这些结果一致,在以LC8为靶点的RNAi实验中,我们观察到只有65%的细胞在治疗4天后表现出高尔基体的分散,而与之相比,暴露在混乱对照中的细胞只有12%。
在确定PhAP的光裂解可逆转表型后,我们询问恢复内体核周聚集所需的时间是否取决于陷阱作用的时间。如上所述,我们发现最大的内体分散发生在2小时内,而恢复发生在4小时内。因此,我们用PhAP或AP处理细胞30分钟和1小时,然后进行紫外线照射。正如预期的那样,这导致细胞内体分散的百分比降低(0.5小时,53.2±2.4%;1小时,57.8±8.0%;,第五排)。然而,对于所有处理时间(0.5、1和2 h),暴露于紫外线后4 h内,具有分散内体的细胞百分比相似(A类,). 相反,细胞以完全相同的方式处理,但用AP代替PhAP,显示出持续的内体弥散,直到弥散达到饱和点(~70%),进一步证实用AP诱导陷阱产生高度稳定的复合物。B类显示了在AP/PhAP治疗中致密内体及其分散的代表性图像。请注意,只有转染细胞(绿色)显示内体分散(B类,分散的)而作为内部阴性对照的未转染细胞没有显示出内体分散(B类,未改造紧凑型). 然而,在PhAP的病例中,内体恢复到核周位置(B类,契约)紫外线照射后。AP处理的细胞并非如此,二聚体陷阱仍然存在,内体继续分散。
讨论
在此,我们开发了AP的可光降解类似物,证明PhAP可以诱导LC8-LC8的形成捕集器复合物,并表明该分子陷阱中PhAP的光裂解导致内体分散的解离和快速逆转。我们还观察到,尽管治疗时间不同,但内体返回核周间隙所需的时间相似。我们注意到,这些值反映了大量细胞的平均变化,而对这一过程的详细机械洞察需要活细胞成像(例如在PhAP裂解之前、期间和之后,单个细胞中的内体分散)。既然我们已经确定了PhAP介导的陷阱的可逆性,我们已经开始了这样的机制研究,不仅关注内体,也关注具有LC8陷阱的其他细胞器,以及使用实验室最近开发的其他分子陷阱。
最后,尽管我们在分子捕捉的背景下应用了这种新试剂(6)FKBP的二聚化也被用于许多其他系统,通常用于诱导信号级联(14,–18)还可以寡聚淀粉样前体蛋白(18,–20)作为细胞治疗的“死亡开关”(21). PhAP很可能对这些研究也有价值。值得注意的是,最近发明了一种可光解的雷帕霉素类似物,用于二聚FKBP和FKBP12-雷帕霉素相关蛋白(FRAP)。在这种情况下,光裂解被用来激活雷帕霉素类似物,以在空间和时间上激活信号事件(22,23). 我们认为,本文提出的PhAP与组织特异性启动子表达的分子陷阱相结合,不仅能够在动物模型中提供生物过程的时空激活(例如秀丽隐杆线虫),但也有能力逆转表型并解决诸如信号周期和对决定细胞命运的程序的承诺等问题。
鸣谢
我们感谢威廉姆斯和霍恩实验室现任和前任成员的有益讨论。我们也感谢托马斯杰斐逊大学的Jim Keen教授进行了富有洞察力的讨论。
*这项工作得到了国立卫生研究院拨款R21NS071166(发给J.C.W.)和国立卫生研究所拨款P30 CA033572(发给Michael A.Friedman)的全部或部分支持。
三使用的缩写如下:
- AP公司
- 2017年4月
- PhAP公司
- 光敏AP模拟
- FKBP公司
- FK506结合蛋白
- EGFP公司
- 增强型绿色荧光蛋白
- 集成电路
- 中间链。
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