简介
复合物I（CI）或NADH-泛醌氧化还原酶是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统的第一个复合物，催化NADH氧化到泛醌的电子转移(1)。该反应释放的能量与穿过线粒体内膜的质子泵送相结合，以帮助产生合成ATP所需的电化学梯度(2)。真核生物CI分子量接近1 MDa，由45个不同的亚基组成，其中7个亚基由线粒体DNA（mtDNA）编码，其余亚基由核DNA（nDNA）编码(三，4)。在38个nDNA编码亚单位中，有31个被认为是“多余的”，因为它们是最近进化的产物，被认为具有调节功能。CI具有“L”形结构，线粒体内膜中嵌入疏水臂，线粒体基质中含有亲水外周臂(5，6).
CI缺陷可导致多种疾病，包括致命的婴儿线粒体疾病（即.Leigh综合征）到较轻的疾病，如成人发病的神经退行性疾病（即.Leber遗传性视神经病变（LHON）(7，8)。在核心亚单位中描述了致病性突变，包括7 mtDNA编码和7 nDNA编码(7，9)以及编码装配因子的基因(10——12).
除了遗传疾病外，在几种神经退行性疾病中也观察到CI缺陷，如亨廷顿病和帕金森病（PD）(13) (14——16)。MPTP和鱼藤酮的CI抑制作用加强了PD中的这种联系，因为人类和动物接触这些药物会发展为帕金森综合征(17——21)。然而，尽管CI缺陷与人类疾病有关，但对CI缺乏的病理机制仍知之甚少。在过去几年里，人们一直在努力建立小鼠CI缺陷模型(22)。到目前为止，已有关于单独CI缺乏小鼠模型的报告恩杜夫斯4(23——27),恩杜夫斯6(28)和凋亡诱导因子（AIF）基因(29，30)。此外，最近发表了LHON的小鼠mtDNA突变模型(31)。这些模型成功地再现了严重的早期人类疾病的一些症状。然而，需要不太严重的模型来更好地理解部分CI缺陷的后果，尤其是在CNS中。
在本研究中，通过有条件地删除恩杜法5基因，编码31个额外nDNA编码的亚基中的1个。NADH-泛醌氧化还原酶1α亚复合物亚单位5（NDUFA5）的分子量为13 kDa，在哺乳动物中广泛表达。对牛CI进行的研究已确定NDUFA5位于外周臂(32); 然而，其在CI中的具体功能尚不清楚。
结果
的生成Ndufa5 CNS公司-KO小鼠
无处不在的恩杜法5KO小鼠是使用桑格研究所基因陷阱资源（SIGTR）的基因陷阱ES细胞系按照标准程序生成的(33)。基因陷阱的插入位点被定位在恩杜法5基因（图A） ●●●●。获得了种系传递系，随后的育种表明Ndufa5圈闭胚胎致死，在E9天以后没有发育（图B） ●●●●。为了建立CI缺乏的条件性KO小鼠模型，我们创建了一个普遍表达NDUFA5蛋白的转基因小鼠（在ROSA26启动子下）。转基因包含NDUFA5蛋白的cDNA编码，其两侧有两个loxP位点（如图所示）C作为Ndufa5-Flx公司)。破坏的等位基因纯合子小鼠和携带漂浮转基因的小鼠提供了条件转基因等位基因，该等位基因首先回交给C57/Bl6小鼠，最后再回交给CaMKIIa-Cre公司鼠标（图D） ●●●●。正如预期的那样，转基因ROSA26的表达-Ndufa5-Flx公司拯救了纯合子的致命性恩杜法5-诱捕老鼠。以预期的孟德尔比率获得动物（数据未显示）。图E显示了小鼠不同等位基因的PCR分析。
创建神经元特异性恩杜法5在基因捕捉等位基因上使用Cre-loxP系统的KO小鼠。(A类)的示意图恩杜法5基因（NCBI基因ID:68202）并将基因陷阱载体插入恩杜法5基因。外显子用编号框表示，内含子用线条表示。翻译后的序列显示为灰色，未翻译的序列显示为白色。βGEO，β-半乳糖苷酶-新霉素耐药盒。(B类)E9胚胎杂合（左）和纯合（右）的代表性光学显微镜照片恩杜法5-捕获的等位基因。(C类)用于生成表达条件基因的转基因小鼠的构建方案恩杜法5等位基因。(D类)用于生成神经元特异性的交叉方案恩杜法5KO小鼠模型，命名为中枢神经系统Ndufa5基因敲除小鼠(恩杜法5CNS-KO）。恩杜法5KO小鼠是纯合子恩杜法5-捕获的基因，对拯救floxed阳性恩杜法5对于CaMKIIα-Cre转基因。CaMKIIa公司：钙2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ型α. (E类)基因陷阱插入的分子确认。用引物扩增的小鼠尾部基因组DNA的PCR产物如A和C所示（箭头所示）。上面板：野生型基因。中间面板：恩杜法5-捕获的基因。底部面板：救援结构。(F类)量化恩杜法5-实时PCR检测转基因。对皮层基因组DNA的外显子5进行定量。在野生型小鼠中观察到的两个基因拷贝的值为“1”。开放圆表示野生型值。开平方表示转基因对照值。填充的方块表示恩杜法5CNS-KO。通过ΔΔ计算值C类吨方法。(G公司)来自4个月龄和11个月龄对照组和恩杜法5用NDUFA5和VDAC-1抗体探测CNS-KO小鼠。(H（H）)NDUFA5水平的量化显示皮质匀浆减少恩杜法5CNS-KO小鼠。
这个CaMKIIα启动子在出生时开始在主要影响皮层和海马的前脑神经元中表达(34)。控制动物，携带恩杜法5-无论是杂合子陷阱还是纯合子陷阱，对挽救转基因均为阳性，对CaMKIIa公司-创建。我们估计了恩杜法5-通过实时聚合酶链反应（RT-PCR）在大脑皮层中对转基因进行消融，发现在4个月大的时候，转基因消融已经显著减少，在随后的几个月内没有显著变化（图F） ●●●●。同样，在中枢神经系统NDUFA5基因敲除的4个月龄和11个月龄小鼠的皮层匀浆中，通过western blot检测到的NDUFA5蛋白水平显著降低(恩杜法5CNS-KO）（图G和H）。
CNS条件Ndufa5小鼠的表型
恩杜法5CNS-KO小鼠在10–11个月龄之前看起来很健康，各组之间的体重没有差异（图A） ●●●●。然而，在这个年龄段，他们变得昏昏欲睡（图B） 并未能通过降杆测试（图C） ●●●●。平均而言，恩杜法5CNS-KO动物下降电极的潜伏期较长，表明运动失控（图C） ●●●●。此外，当尾巴悬吊时，它们会抱住后腿。为了进一步确定这种运动协调障碍的表现型，这些动物接受了网格和波束行走测试。在这两个任务中恩杜法5与相同年龄的对照组小鼠相比，CNS-KO小鼠的运动协调能力显著降低（图D和E）。当允许在网格上行走5分钟时，与对照组相比，这些KO小鼠表现出“脚错误”的百分比增加（图D） ●●●●。此外恩杜法5CNS-KO小鼠在1厘米宽、1米长的横梁上难以保持平衡和行走（图E） ●●●●。这个恩杜法5CNS-KO小鼠完成这项任务的时间几乎是对照小鼠的四倍。在本研究中，除非另有说明，所有小鼠均在11个月大时进行分析。
的表型恩杜法5CNS-KO小鼠。(A类)对照组和11个月龄婴儿体重的比较恩杜法5CNS-KO小鼠；n个= 6/7; 值表示平均值±SEM(B类)11个月大的对照组和恩杜法5中枢神经系统-KO小鼠。打开圆圈，控制动物(n个=7）和闭合正方形，CNS-KO动物(n个= 8). (C类)极点下降测试表示为极点上的潜伏期（动物下降极点的时间，以秒为单位）。KO组动物下降极点的时间为76.97±17.91秒，而同龄对照组动物平均下降时间为17.93±2.701秒；t吨-测试*P（P）= 0.0197,n个=每组7人。(D类)网格测试显示了在网格中无扰动行走5分钟期间所产生的步数误差百分比。恩杜法5KO动物失败的步骤数占总步骤数的6.50±0.97%，而对照动物出现错误的百分比为2.583±0.6%(n个＝7，t吨-测试，**P（P）= 0.0056). (E类)高架梁行走试验。他们花在1米长、1厘米宽光束上的时间被测量。对照组20.9±3.9 s与恩杜法5CNS-KO 73.6±23.4 s。数值为平均值±SEM。使用Student的双尾分析数据吨-测试*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
Ndufa5 CNS-KO小鼠皮层CI缺乏
研究恩杜法5删除方式CaMKIIa-Cre公司，匀浆是由恩杜法5CNS-KO和对照小鼠。首先，为了表征完全组装的OXPHOS复合物的稳态水平，使用针对呼吸复合物亚单位的不同单克隆抗体和抗NDUFA5的多克隆抗体（图A） ●●●●。我们发现，大脑皮层中完全组装的CI水平显著降低恩杜法5CNS-KO小鼠。用抗NDUFA9抗体探测的印迹密度分析表明恩杜法5与对照值相比，CNS-KO小鼠集合CI水平降低了约70%（图B） ●●●●。含抗NDUFA5的BN凝胶定量表明，还原率更高（～85%，图B） ●●●●。这种差异可能是由于不同抗体的西方检测的非线性，或者是由于缺乏NDUFA5的CI的存在。控制和恩杜法5CNS-KO小鼠表现出完全组装的CII、CIII和CIV的可比稳态水平（图A） ●●●●。用二维BN（2D-BN）凝胶电泳分析呼吸复合物。在大脑皮层中未检测到CI亚组的积聚恩杜法5CNS-KO小鼠（数据未显示）。接下来，确定恩杜法5在超复合物中缺失，用温和的洗涤剂处理皮层匀浆（洋地黄蛋白与洗涤剂的蛋白比为1:8），并在适当的BN凝胶中进行分析。除了降低组合CI级别外，恩杜法5CNS-KO小鼠没有其他异常，CI主要存在于超复合物中（用NDUFA9抗体分析，图E） ●●●●。用抗UQCRC2抗体检测CIII。在对照动物中，CIII主要存在于超复合体中，就像CI一样（图E） ●●●●。然而，在恩杜法5CNS-KO小鼠。大多数CIII在与隔离的CIII相对应的带中检测到（图E） ●●●●。这一结果可以用中CI水平的降低来解释恩杜法5CNS-KO（图A和E）。
恩杜法5CNS-KO小鼠大脑皮层出现孤立的CI缺陷。(A类)11个月龄对照组和恩杜法5中枢神经系统-KO小鼠。用BN-PAGE（4–16%凝胶，n个=每组4人）。(B类)定量（A）中的BN-PAGE，显示复合物水平归一化为电压依赖性阴离子通道1和对照动物。恩杜法5中枢神经系统-KO显示组装CI减少(t检验PNDUFA9和NDUFA5=0.0029t检验P= 0.0056). (C类和D类)Western blots显示11个月大的对照组和对照组大脑皮层匀浆中NDUFA5和线粒体蛋白的水平恩杜法5中枢神经系统-KO小鼠(n个=每组4人）。与对照组相比，KO中的NDUFA5水平降低至20%(t检验，**P= 0.003). (E类)皮层呼吸超复合体的稳定水平。(F类)（C和D）中SDS-PAGE的定量。数值代表平均值±SEM。数据使用Student的双尾模型进行分析吨-测试*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01和***P（P）< 0.001.
用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析NDUFA5蛋白和CI的几个亚基的稳态水平。图C显示大脑皮层匀浆中NDUFA5蛋白水平显著降低恩杜法5CNS-KO小鼠。NDUFA9、NDUFS3、NDUWS4和NDUFB8 CI亚基在恩杜法5CNS-KO小鼠（图C和F）。然而，SDHB（琥珀酸脱氢酶亚基B，复合物II）、UQCRC2（CIII的核心2亚基）、细胞色素c、COXI（CIV亚基）以及ATP酶α和ATP酶β（复合物V亚基恩杜法5CNS-KO小鼠（图D和F）。
为了确定恩杜法5在呼吸复合物功能缺失的情况下，用分光光度法测定皮层匀浆中的酶活性。图显示了线粒体CI、CII、CIII和CIV在恩杜法5CNS-KO小鼠。KO皮层匀浆中NADH-辅酶Q（CoQ）氧化还原酶（CI）活性降低了约40%。另一方面，琥珀酸癸基辅醌2,6-二氯苯酚-吲哚酚还原酶（CII）、辅酶喹啉-细胞色素c还原酶和细胞色素c氧化酶（CIV）活性在恩杜法5CNS-KO小鼠（图A） ●●●●。这些结果与BN凝胶中获得的结果一致（图A） ，表示独立的CI缺陷。对照组和恩杜法5CNS-KO小鼠皮层柠檬酸合成酶活性（图B） ●●●●。
11个月龄婴儿大脑皮层的生化特征恩杜法5CNS-KO小鼠.(A类)和(B类)对照组和对照组皮层线粒体酶和柠檬酸合成酶活性恩杜法5采用分光光度法测定CNS-KO小鼠，并以从对照动物获得的平均值百分比表示。CI：NADH-辅酶Q氧化还原酶活性；CII：琥珀酸癸基辅醌2,6-二氯苯酚靛酚还原酶；CIII：泛喹啉细胞色素c还原酶和CIV：细胞色素c氧化酶。n个=7/控制和n个= 8/恩杜法5CNS-KO小鼠。CI活动t检验, **P（P）< 0.01. (C类)在对照组和恩杜法5中枢神经系统-KO小鼠。n个=5/控制和n个=7/KO。(D类)L-3-羟酰基-CoA脱氢酶和棕榈酰-CoA磷酸脱氢酶的酶活性恩杜法5中枢神经系统-KO小鼠。表示平均值±SEM值(n个=每组4人）；FAO，脂肪酸氧化。(E类)对照和对照皮层匀浆中MCAD（FAO相关酶）和电子转移黄素蛋白亚单位A（ETFA）线粒体蛋白的蛋白质印迹和定量恩杜法5CNS-KO公司。KO的ETFA水平为156.4±15.9%，而对照组为100.0±16.5(t检验, *P（P）= 0.05). (F类)用western blot测定SCOT和ACAT-1，并用密度计定量。数值代表平均值±SEM。
线粒体氧磷缺乏损害线粒体中丙酮酸的氧化，然后丙酮酸被转化为乳酸。这种乳酸会在组织和血液中积聚(35)。分析是否在大脑皮层观察到部分CI缺陷恩杜法5CNS-KO小鼠导致乳酸性酸中毒，我们测量了血清中的乳酸浓度。虽然恩杜法5CNS-KO，未达到统计显著性（图C） 。
Ndufa5 CNS-KO小鼠的潜在代偿机制
线粒体中脂肪酸的分解代谢有一些代谢途径，可以独立于OXPHOS生成ATP。虽然这些途径在正常的中枢神经系统生理条件下可能不是非常活跃，但在能量短缺时可能会上调。因此，我们确定了脂肪酸代谢是否受到部分CI缺乏的影响。
在皮层匀浆中测量了参与脂肪酸β-氧化的线粒体酶的活性（图D） ●●●●。恩杜法5CNS-KO皮层没有显示3-L-羟酰基辅酶A脱氢酶和棕榈酰辅酶A酶活性的差异（图D） ●●●●。此外，当用RT-PCR测量时，KO皮层中编码脂肪酸质膜转运蛋白（CD36/FAT）、过氧化物酶体酶（酰基辅酶A氧化酶）和几种酰基辅酸脱氢酶的转录物水平没有改变(补充材料，图S1)。中链酰基辅酶a脱氢酶（MCAD）是参与线粒体脂肪酸β氧化的酶之一，其蛋白质印迹显示出一种趋势，但无显著差异恩杜法5CNS-KO（图E） ●●●●。
因为脂肪酸代谢产生的还原当量可以通过CoQ10通过电子转移黄素蛋白脱氢酶复合物（ETF-A-B和ETFdh）氧化(36)，测定亚单位A（ETFA）的蛋白水平。大脑皮层匀浆中ETFA的稳态水平显著增加恩杜法5CNS-KO（图E、 50%以上），提示潜在的代偿机制，这可能有助于解释轻度表型。
在药物诱导（MPTP）CI缺乏小鼠模型中，酮体通过依赖线粒体CII的机制改善氧化磷酸化(37)。因此，为了进一步表征脑代谢途径中部分CI缺乏的影响，通过western blot检测了与酮体代谢相关的两种酶的水平（图F） ●●●●。将乙酰醋酸盐转化为乙酰乙酰辅酶A的琥珀酰辅酶A-3-酮酸辅酶A转移酶（SCOT）的水平在KO和对照组之间没有显著差异（图F） ●●●●。然而，线粒体乙酰辅酶A乙酰转移酶1（ACAT-1）的水平在恩杜法5CNS-KO皮层（图F） ●●●●。这种增加可能会增强体内的酮体代谢恩杜法5CNS-KO将抵消CI缺陷。
Ndufa5 CNS-KO小鼠皮层的组织学分析未显示形态学变化
对大脑和小脑切片的光学和共焦显微镜研究没有发现11个月大的婴儿之间的主要差异恩杜法5CNS-KO和控制（图)老鼠。图A显示了苏木精和伊红（H&E）染色的对照组和KO组动物运动皮层的矢状截面。各组之间的皮质厚度或皮质的一般结构没有发现差异。同样，海马和小脑之间的组织学比较表明恩杜法5CNS-KO（图A和补充材料，图S2)。为了解决神经细胞的CI缺乏恩杜法5用抗NDUFA9抗体和抗COXI（CIV亚单位）抗体作为线粒体对照，对CNS-KO小鼠的脑切片进行免疫染色（图B） ●●●●。图中共焦显微镜面板上的白色箭头B表示CI缺乏神经元。
对照组和对照组大脑皮层和海马的组织学比较恩杜法511个月龄小鼠的CNS-KO无病理特征。(A类)对照组和对照组大脑皮层和海马的H&E分析恩杜法5CNS-KO小鼠。棒材=200µm。(B类)大脑皮层NDUFA9和COX1的免疫染色。白色箭头表示COX1阳性且NDUFA9缺陷的神经元。棒材=20µm。(C类)用神经元特异性抗体NeuN免疫染色的运动皮层和海马区CA1的代表性切片，n个=每组3人。棒材=100µm，并在面板中量化(D类)。(E类)用胶质特异性抗体GFAP免疫染色的皮质和海马切片的共焦显微镜。棒材=50µm。(F类)对照组和对照组大脑皮层匀浆的西方分析恩杜法5CNS-KO小鼠用神经元特异性抗体Tuj1和胶质细胞标志物GFAP进行探测。肌动蛋白被用作内标。F的下半部分显示了归一化为肌动蛋白的western blots的量化，以及归一化到对照组比率的平均值(n个=每组4人）。NeuN：抗神经元核标记物NeuN；Tuj1：抗神经元特异性III类β-微管蛋白；GFAP：抗胶质纤维酸性蛋白抗体。
为了研究潜在的神经元丢失，用神经元标记物NeuN免疫组织化学方法对大鼠脑脊髓矢状面进行了研究恩杜法5CNS-KO和对照小鼠。运动皮层和海马区CA1的代表性区域如图所示C.对这些区域的NeuN-阳性细胞数量的量化显示，各组之间没有差异（图D） ●●●●。共聚焦显微镜显示，各组大脑皮层、海马和小脑中的NeuN阳性细胞没有差异(补充材料，图S2和S3)。此外，由于胶质反应性是伴随神经元丢失的一个常见特征，主要在早期阶段，我们对脑切片进行了星形胶质标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和小胶质特异性蛋白Iba1的染色。KO和对照标本之间的GFAP和Iba1信号没有差异（图E和补充材料，图S3)。因此，在大脑皮层和海马区均未观察到神经元丢失或神经胶质增生恩杜法5CNS-KO小鼠。我们通过western blot定量了其中一些标记物的水平恩杜法5CNS-KO小鼠皮层匀浆（图F） ●●●●。western blots对神经元III类β-管蛋白（Tuj1）和GFAP的定量显示，各组之间的水平没有差异（图F） ●●●●。
Ndufa5 CNS-KO皮质未显示氧化损伤
CI缺乏与患者成纤维细胞活性氧（ROS）增加有关(38)以及在丑角和雀巢-Cre-Ndufs4鼠标模型(26，29，30)。为了检测在我们的模型中，NDUFA5蛋白减少导致的部分CI缺乏是否导致氧化损伤，我们检测了脑切片中核酸的氧化水平以及皮层匀浆中脂质和蛋白质的氧化（图)。为了研究核酸氧化，在脑切片中进行8-羟基脱氧鸟苷/8-羟基鸟苷（8-OHdG/8-OHG）免疫染色（图A） ●●●●。8-OHdG和8-OHG分别是DNA和RNA氧化的产物(39)。各组之间的染色没有发现差异（图A） ●●●●。为了检测脂质过氧化，用western blot检测4-羟基-2-壬醛（4-HNE）蛋白加合物。4-HNE是内源性脂质过氧化的主要产物，其存在被认为是细胞氧化应激增加的可靠标志。此外，未检测到4-HNE加合物含量的显著变化（图B和C）。
氧化应激标记物的特征恩杜法5CNS-KO。(A类)核酸氧化损伤的测定。11个月大的对照组（上部）和恩杜法5CNS-KO（下部）用抗OHG抗体染色。对于阴性对照，大脑切片用Dnase/Rnase进行预处理。对于阳性对照，脑切片用30%的H进行预处理2O（运行）2代表性章节如下所示n个=每组5人。棒材=100µm。(B类)对11个月龄对照组和恩杜法5用4-HNE加合物抗体孵育CNS-KO小鼠。(C类)量化条带并归一化为肌动蛋白和对照组。控制0.800±0.1079(n个=3）和KO 1.062±0.1374(n个= 5). ns，不显著。(D类)Oxyblot：免疫印迹检测皮层匀浆中蛋白质（20µg）上的羰基残基。对照组和KO组之间没有发现差异。(E类)来自对照组和恩杜法5CNS-KO对SOD1和SOD2进行了吸光度测定。SOD1和SOD2的总量分别用肌动蛋白和VDAC1的量进行量化和归一化，并归一化为对照组比率的平均值(n个=每组4人）。斑点的量化如所示(F类)。数值以平均值±SEM表示。使用Student的双尾模型分析数据吨-检验，当P（P）< 0.05.
氧化反应导致羰基引入蛋白质。对照组和对照组之间蛋白质羰基的总体水平相似恩杜法5CNS-KO（图D） ●●●●。此外，还测定了负责解毒超氧化物自由基的酶的水平：铜/锌-超氧化物歧化酶或SOD1和SOD2。与之前的结果一致，在恩杜法5CNS-KO（图E和F）。总之，这些结果表明恩杜法5CNS-KO大脑不会导致显著的氧化应激。
讨论
CaMKIIa阳性神经元中Ndufa5基因的消融导致轻度脑病
CI缺陷与遗传疾病和神经退行性疾病有关，尤其是PD。然而，迄今为止，很少有哺乳动物研究CI缺陷模型，几乎所有模型都与早期死亡有关。我们使用了CaMKIIa-Cre公司推动出生后KO基因的删除恩杜法5-在前脑神经元中漂浮转基因，产生温和的表型。
尽管NDUFA5亚基在CI中的具体功能尚不清楚，但我们的数据表明，它是哺乳动物CI组装/稳定性所必需的。在我们的中枢神经系统模型中，我们发现11个月时CI水平和活动部分下降。BN凝胶的定量表明，含有NDUFA9亚单位的组装CI减少了70%，而含有NDUFA5的组装CI则减少了85%。该结果表明，在该模型中存在不含NDUFA5亚单位的组装CI百分比（15%）。虽然这表明NDUFA5亚单位对组装过程不是必需的，但这种差异可以通过使用不同抗体的western blot定量的非线性来解释。因此，在这一点上，我们没有强有力的证据表明没有NDUFA5就可以存在稳定的CI子组件。
有趣的是，尽管组装CI的稳态水平显著降低（降低70-85%），但CI的酶活性在CNS-KO中降低了40%。这种差异可能是由于BN-PAGE分析中不存在NDUFA5亚单位时CI稳定性降低所致。此外，酶分析是在电子供体和受体的最佳条件下进行的，反映了最大活性。虽然KO大脑中含有CI的超复合体的水平有所下降，但基本上所有剩余CI都存在于被认为可以优化电子转移的超复合物中(40，41)。CI缺乏与轻度运动表型相关，包括运动技能下降和同年龄段的活动减少。
迄今为止，CI缺乏最受研究的模型是普遍存在的KO恩杜夫斯4与我们的模型相反，该基因在出生后50天内发展为严重的共济失调性脑病，死亡(24)。删除大脑中的基因，由雀巢Cre导致了类似的严重表型(26)。在该模型中，脑干的嗅球和前庭核以及小脑蚓部的后叶受到了特别的影响。这些区域显示神经元丢失以及严重的胶质细胞激活。模型之间存在差异，可以解释我们模型中较温和的表型，包括我们使用了CaMKIIa克里特岛(CaMKIIa公司神经元特异性，33)而金塔纳和同事使用内斯汀-Cre（在神经元和胶质细胞中表达）。另一个可能导致严重表型的原因恩杜夫斯4-KO模型在发育过程中缺失，因为Nestin驱动的表达在神经元前体的早期胚胎中。相反，CaMKIIa公司-驱动表达是后天的(34)。因此，这些结果表明，中枢神经系统发育过程中的功能性CI是神经元存活所必需的。另一方面，出生后的神经元会耐受更好的CI缺乏。因此，当恩杜夫斯4该基因通过三苯氧胺诱导系统在成年小鼠中广泛失活(26).
此外，最近的研究表明，删除恩杜夫斯4前庭核导致呼吸衰竭并导致死亡恩杜夫斯4-KO小鼠(27).
然而，使用相同的CaMKIIa-Cre公司我们发现，删除CIV组装（COX10）所需的基因后，可以观察到更严重的缺陷，在3-4个月时明显发病(42，43)。类似地，使用CaMKIIa公司启动子，在小鼠中诱导了更严重的表型，动物在3.5个月大时死亡(42)。分子或细胞代偿机制可能会减少恩杜法5神经元消融。我们的数据表明，观察到的较温和的表型可能与通过电子转移黄素蛋白（ETF）系统的电子转移增加有关。ETF参与脂肪酸的氧化，直接给CoQ10提供电子，绕过CI和CII，这将有助于CIII和CIV维持膜电位(36，44)。事实上，我们确实检测到异三聚体酶的ETFA亚基水平增加。
此外，我们发现酮体代谢也可能是这种代偿机制的一部分。在能源短缺期间，大脑积极代谢酮体以产生能量和进行生物合成过程(45，46)。ACAT1酶是一种线粒体ACAT，参与酮生成的调节(47)。它催化一个乙酰基辅酶A分子转化为两个乙酰基辅酶A分子。因此，在我们的模型中，CI缺乏可能导致ACAT1增加，增加可进入三羧酸（TCA）循环的乙酰-CoA分子的可用性，生成可通过CII供给OXPHOS系统的琥珀酸。研究表明，在帕金森小鼠模型中输注β-羟基丁酸通过依赖于CII的机制拯救OXPHOS功能(37)。此外，生酮饮食已被证明可以诱导参与能量代谢的线粒体基因的协调上调，并刺激线粒体的生物发生(48)。事实上，生酮饮食减缓了“缺失”小鼠线粒体起源肌病的进展(49)并通过持续的线粒体能量功能降低阿尔茨海默病小鼠模型的病理学(50)。然而，在我们的模型中，酮体增加氧化磷酸化的能力，在这个意义上有助于轻度的恩杜法5CNS-KO尚待阐明。NAD的减少可能会减缓TCA循环+然而，在肝脏中，ACAT1已被证明会发生反向反应，这是构建新酮体的第一步(51)。此外，星形胶质细胞产生大量酮体(52，53)。对观察到的ACAT1水平增加的另一个可能的解释是，由于不能进入克雷布斯循环的过量乙酰辅酶A必须通过生成酮来消除，酮可用于生物合成过程(54).
TCA循环不仅为OXPHOS系统提供还原当量，还生成高能磷酸盐（ATP/GTP）(55)。α-酮戊二酸脱氢酶（KGDHC）的产物琥珀酰辅酶A是琥珀酰辅酶A合成酶（SCS）对ADP进行“底物水平磷酸化”的底物。SCS是唯一一种能够在线粒体内膜缺乏质子原动力的情况下产生ATP的酶，在能量不足的条件下，如短暂缺氧，可能在维持基质ATP水平方面发挥作用(56)。因此，该机制也有助于抵消我们模型中的CI赤字。
因此，我们认为，我们观察到的相对温和的表型和迟发是至少两种主要代偿机制的结果：（i）通过黄蛋白脱氢酶电子转移到辅酶Q10的电子转移增加，以及（ii）对生酮环境的生理适应。轻度CI缺陷可能会给这种适应留出时间。
中枢神经系统部分CI缺陷与氧化损伤增加无关
大量工作体外已经表明，药物抑制CI会导致氧化损伤增加，主要是因为CI水平形成的超氧物(57——59)。然而，我们没有发现11个月大的婴儿大脑中存在氧化损伤恩杜法5CNS-KO公司。因为在我们的模型中CI水平高度降低，ROS的形成也可能减少。我们一致认为，基因缺陷会降低氧磷组分的水平，但不会增加氧化损伤。这不仅在目前的CI缺陷模型中发现，而且在CNS CIV缺陷的小鼠模型中也发现(42，43)和线粒体DNA缺失(60)。同样，积累线粒体DNA突变的突变小鼠也没有表现出ROS损伤的增加(61，62)在一些组织中，例如骨骼肌，氧化损伤实际上减少了(63)。同样在患者中，NDUFS4的缺失和集合CI的完全缺失与ROS生成的增加并不平行(64)。此外，通过敲除NDUFS3亚单位或CI组装因子NDUFAF1抑制CI组装，降低ROS的生成体外(65，66)。相比之下，金塔纳及其同事发现恩杜夫斯4-KO小鼠，但该模型在分析的时间点显示出严重的星形胶质细胞增生、小胶质细胞增多和炎症(26).
在中枢神经系统CIII缺陷小鼠模型中，我们确实发现梨状皮层和体感皮层的氧化损伤增加(CaMKIIa-Cre公司CIII的Rieske铁硫蛋白缺失）(42)。很明显，ROS的潜在增加取决于OXPHOS缺陷的位置和类型。然而，在大多数遗传病例中，复合物的稳态水平降低，ROS生成或氧化损伤似乎没有增加(67).
总之，我们开发了一种新的中枢神经系统CI缺乏模型，该模型表现为迟发表型，在某些方面可能模拟在几种神经退行性疾病中观察到的与年龄相关的CI降低(13，14).
与其他呼吸复合物中的缺陷相比，这种轻微的表现可能是由于通过ETF系统的电子转移增加以及对更生酮环境的生理适应所致。在受影响的大脑区域未观察到氧化应激，这证明影响呼吸链CI的遗传缺陷不会导致ROS损伤增加。该模型将非常有助于分析部分CI缺乏在迟发性神经退行性疾病中的作用。
材料和方法
Ndufa5 KO小鼠的产生
A类恩杜法5将来自SIGTR的基因陷阱ES细胞系（SIGTR-clone RRK279）与C57/B6囊胚融合，生成五个嵌合体。生殖系传播后，携带等位基因的动物恩杜法5PCR检测KO基因。纯合子恩杜法5KO小鼠在第E9天表现出胚胎致死性。为了挽救致命性恩杜法5cDNA序列（351 bp）位于LoxP位点的两侧，在TOPO-TA载体（Invitrogen）中亚克隆Bgl公司二/Xba公司I位点，然后转移到pBROAD3-mcs v02质粒（Invitrogen）年龄我/Hind公司III位点，在无处不在的小鼠ROSA26启动子下。迈阿密大学的转基因核心设施将该构建物微量注射到B6/SJLF1受精卵母细胞中。这些转基因小鼠随后与杂合子小鼠杂交，以获得恩杜法5基因陷阱。特别是KO恩杜法5将中枢神经系统中的基因、双陷阱和转基因小鼠与CaMKIIa公司-由Scott Zeitlin博士（弗吉尼亚大学）善意提供的Cre转基因小鼠。根据图中描述的方案获得本研究的动物E.对照组和恩杜法5CNS-KO小鼠大多来自129株，但也包含来自SJL和C57/BL6背景的较小百分比的基因。对照组和有条件的KO小鼠取自同一窝。使用以下引物通过PCR检测转基因和陷阱的存在。对于恩杜法5基因陷阱，正向引物为5′-TTATCGAGCGTGGTGTTATGC-3′，反向引物为5'-GCGGTACATCGGCAAAATATATC-3′。对于恩杜法5野生型基因，正向引物为5′-GATGCATTCGGTCTCATCCT-3′，反向引物为5′-AAGATCCCACCTTGCCTCTT。对于恩杜法5-通过转基因，正向引物为5′-CCTGAGAGTGAAACAGGA-3′，反向引物为5'-AGAAATTGGAGCAAAAG-3′。对于CaMKIIa-Cre公司所用的转基因正向引物为5′-GCGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3′，反向引物为5'-GTGAACAGCATTGGTCACTT-3′。的基因ID恩杜法5是68202。
所有小鼠程序均按照迈阿密大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。小鼠被安置在无病毒抗原设施中，在室温下进行12小时的光/暗循环，并喂食随意标准的啮齿动物饮食。
基因组DNA的定量PCR
使用标准苯酚/氯仿提取法从皮层提取基因组DNA。量化删除恩杜法5-在KO动物中，使用特异性引物扩增50 ng基因组DNA恩杜法5按照制造商在CFX96实时PCR系统（Bio-Rad）中规定的PCR条件，使用Sso Advanced SYBR Green（Bio-Rad）在20µl反应混合物中检测基因（外显子3和外显子5）。使用来自对照N的基因组DNA获得标准曲线杜法5CNS-KO和野生型小鼠恩杜法5基因。恩杜法5-使用ΔΔ量化floxed转基因量C类吨方法并规范化为恩杜法5野生型小鼠（该基因的两个拷贝）。值被归一化为肌动蛋白。
（i）恩杜法5-外显子5（正向）：5′GCTGAAAAAGAAACTAAAGTCTGGC 3′
（ii）恩杜法5-外显子5（反向）：5′CATATTGGCACTTCCACATG 3′
（iii）β-肌动蛋白（正向）：5′GCGCAAGTACTCTGTGGA 3′
（iv）β-肌动蛋白（反向）：5′CATCGTACTCCTTGCTG 3′
行为测试
活动笼测试
在运动室（Columbus Instruments）的黑暗周期中的12小时期间，运动机能活动被测量为发生在运动室（Columbus Instruments）中的激光束断裂。动物在黑暗周期前30分钟被单独安置在一个新颖的笼子环境中，并在不受干扰的情况下进行监测(n个=7，用于控制和n个=8（适用于）恩杜法5CNS-KO集团）。测试运动协调恩杜法5CNS-KO小鼠(n个=7）及其对照(n个=10-11个月，我们使用了以下测试：极点下降、波束漫游和网格漫游测试。
电杆下降试验
将动物直立悬挂在垂直（直径8mm；长度55mm）的柱子上，并给予3分钟时间改变下降方向。对动物进行了三次试验，以平均潜伏期下降到底部。未能从杆上下降或跌落的时间最长为3分钟。
电网测试
将动物放在一个网格上（宽30厘米，长30厘米），允许它们行走5分钟，同时记录它们的自发运动。随后，对视频进行分析，并计算步骤错误。步长误差定义为任何脚进入网格孔内的时间。步长误差是指动物在5分钟内的步长总数，用%表示。
横梁行走试验
动物被放置在1.7 cm的高架梁的最右侧，并被激励穿过梁的1 m距离。对动物进行了三次横穿光束的试验，平均花费的时间为1米。每次跑步之间允许动物休息15分钟。
BN-PAGE和SDS-PAGE
为了确定和评估个人呼吸复合物的水平，用1%月桂基麦芽糖苷（Sigma）处理皮层匀浆，并用BN-PAGE在4–16%丙烯酰胺梯度凝胶（Invitrogen）中分离(68，69)。对于western blot分析，20µg蛋白质通过PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Bio-Rad）上，并与针对不同线粒体呼吸复合物的几个亚单位的抗体依次孵育。
对于超复杂分析，皮层匀浆用洋地黄素（Calbiochem）处理，去污剂与蛋白质的比例为8:1，如前所述(70)。蛋白质（20µg）通过BN-PAGE在3–12%预制BN凝胶（Invitrogen）中分离。
为了研究蛋白质的稳态水平，用含有5%β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）处理皮层样品。蛋白质（20–40µg）通过SDS–PAGE在4–20%丙烯酰胺梯度凝胶（Bio-Rad）中分离，并转移到PVDF膜上。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）–0.1%吐温20（PBST）中用5%非脂肪干乳封闭膜，然后用特定的一级抗体进行印迹。使用与辣根过氧化物酶（细胞信号）结合的二级抗体，并使用SuperSignal-West试剂（美国伊利诺伊州罗克福德）通过化学发光法确定反应。
NDUFA9、NDUFS3、NDUFS4、SDHA、UQCRC2、COXI、OXPHOS鸡尾酒、Cytc、ETFA、MCAD的抗体，N个-从Abcam中获得酪氨酸、4-HNE和电压依赖性阴离子通道1；西格玛的肌动蛋白和管蛋白；BD Biosciences的Tim 23；圣克鲁斯生物技术公司的SCOT；Proteintech Group的ACAT1；细胞信号转导中的GFAP；来自Covance的Tuj1，来自Research Diagnostics的SOD1；来自Upstate和多克隆NDUFA5抗体的SOD2由John Walker博士（英国剑桥MRC）捐赠。所有抗体均以1/1000稀释度使用（PBST中0.15%的牛奶），但NDUFA5以1/7500使用，ACAT1以1/500使用，SCOT以1/100使用，N个-酪氨酸在1/400和4-HNE在1/80的阻隔缓冲液中使用（PBST中5%牛奶）。
酶活性测定
皮质匀浆在含有完整蛋白酶抑制剂的PBS鸡尾酒（罗氏诊断）中制备，体积为10倍重量。用电动杵敲打10-15下，组织被打碎。匀浆在100℃下离心克5分钟，上清液用于酶分析。
如前所述，分光光度法测定CI、CII、CIII和CIV以及柠檬酸合成酶的活性(71)。使用Bio-Rad-Bradford检测试剂盒以牛血清白蛋白（BSA）为标准测定蛋白质浓度。测定比活性，同时进行以对照值的百分比表示的值。
对于脂肪酸氧化：通过测量340 nm处由于使用30µM乙酰乙酰乙酰辅酶A还原NADH而导致的吸光度降低，反向测定l-3-羟基乙酰辅酶A脱氢酶的活性，如参考文献1所述(72，73)。棕榈酰辅酶a脱氢酶的活性是通过测定辅酶ASH在578nm处吸光度降低时二氯苯酚-吲哚酚的还原速率来测定的(73)使用40µM棕榈酰辅酶a作为底物。将活性归一化为通过Bradford方法获得的蛋白质浓度，并用蛋白质的µmol/min/mg表示。
乳酸测量
从麻醉小鼠的心脏采集血液，离心并在美国德克萨斯州TAMU CVM临床病理实验室测量血浆中的乳酸水平。
免疫组织化学
麻醉小鼠经心灌注冰镇PBS，快速分离半个半球并将其固定在4%多聚甲醛中过夜，然后在PBS制备的30%蔗糖溶液中孵育进行冷冻保护。将冷冻保护的大脑浸没在OCT复合溶液（TissueTek）中并在液氮冷却的2-甲基丁烷中快速冷冻。在低温恒温器（徕卡）上以30μm的厚度切割矢状切面，并在使用前储存在−80°C下。
为了进行形态学分析，准备了30µm切片用于标准H&E染色。图像是用奥林巴斯BX51显微镜拍摄的。典型的大脑皮层和海马区n个=每组5人。
为了对氧化核酸进行免疫染色，切片先在PBS中清洗1×，然后在10 m内微波加热两次，每次加热1 min米柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）。然后将切片在0.2%Triton X-100中渗透30分钟，并将切片浸入含有0.3%H的100%甲醇中以猝灭内源过氧化物酶活性2O（运行）2在室温下用10%的正常山羊血清封闭切片1小时后，用8-羟基-2′-脱氧鸟苷（OH）单克隆抗体孵育切片30分钟8dG）和8-羟基鸟苷（OH8G） （1:1000，QED Bioscience）在4°C下，在5%的山羊血清中放置2小时。如上所述，使用链霉亲和素过氧化物酶/DAB染色检测结合的一级抗体。对于阴性对照，在初级抗体孵育之前，在37°C的1×反应缓冲液（Promega）中预先用10µg/µl RNase（Qiagen）和0.04单位/µl DNase（Promeca）孵育脑切片1小时。对于阳性对照，脑切片用30%的H进行预处理2O（运行）2用NGS阻塞前保持10分钟。图像是用奥林巴斯BX51显微镜拍摄的。
对于荧光免疫组织化学图像，30µm切片在室温下解冻，在PBS中清洗，并用0.4%Triton X-100在PBS内渗透。在室温下用2%BSA封闭载玻片1小时，并用主要单克隆抗体抗NDUFA9（1/200，Abcam）、单克隆抗GFAP（1/200、Cell Signaling）孵育和多克隆抗Iba1抗体（1/1000，Wako）在4°C下过夜。特异性Alexa 488或594缀合的第二抗体（1/500，Invitrogen）和单克隆抗体抗COX1-Alex-488缀合的（Abcam）在室温下在黑暗中使用3小时。洗涤后，用含有4′，6-二脒基-2-苯基吲哚的荧光安装介质（Vector Laboratories）安装载玻片。使用LSM710共焦显微镜（蔡司）拍摄图像。为了检测细胞死亡，按照制造商的说明，使用TM进行tunel染色现场细胞死亡检测试剂盒（罗氏）。
通过计算运动皮层和CA1区NeuN-阳性细胞的数量来确定神经元数量的量化。来自控制和恩杜法5在4°C下过夜，对CNS小鼠进行NeuN（1:200，Millipore）染色。用链霉亲和素过氧化物酶/DAB染色检测NeuN-结合抗体。安装后，使用蔡司Axiovert 200M显微镜拍摄照片。使用分馏器探针MBF生物科学立体研究者9.10.2对神经元进行定量。对于运动皮层区域，计数框（C.F.）为50×50μ2，样品网格（S.G.）为125×125μ2对于CA1区域，C.F.为25×25μ2S.G.为50×75μ2. (n个=每组3个）。
统计分析
使用双尾、非配对学生的t吨-在两组之间进行测试。当P（P）< 0.05.
