CaMKIIa阳性神经元中Ndufa5基因的消融导致轻度脑病
CI缺陷与遗传疾病和神经退行性疾病有关,尤其是PD。然而,迄今为止,很少有哺乳动物研究CI缺陷模型,几乎所有模型都与早期死亡有关。我们使用了CaMKIIa-Cre公司推动出生后KO基因的删除恩杜法5-在前脑神经元中漂浮转基因,产生温和的表型。
尽管NDUFA5亚基在CI中的具体功能尚不清楚,但我们的数据表明,它是哺乳动物CI组装/稳定性所必需的。在我们的中枢神经系统模型中,我们发现11个月时CI水平和活动部分下降。BN凝胶的定量表明,含有NDUFA9亚单位的组装CI减少了70%,而含有NDUFA5的组装CI则减少了85%。该结果表明,在该模型中存在不含NDUFA5亚单位的组装CI百分比(15%)。虽然这表明NDUFA5亚单位对组装过程不是必需的,但这种差异可以通过使用不同抗体的western blot定量的非线性来解释。因此,在这一点上,我们没有强有力的证据表明没有NDUFA5就可以存在稳定的CI子组件。
有趣的是,尽管组装CI的稳态水平显著降低(降低70-85%),但CI的酶活性在CNS-KO中降低了40%。这种差异可能是由于BN-PAGE分析中不存在NDUFA5亚单位时CI稳定性降低所致。此外,酶分析是在电子供体和受体的最佳条件下进行的,反映了最大活性。虽然KO大脑中含有CI的超复合体的水平有所下降,但基本上所有剩余CI都存在于被认为可以优化电子转移的超复合物中(40,41). CI缺乏与轻度运动表型相关,包括运动技能下降和同年龄段的活动减少。
迄今为止,CI缺乏最受研究的模型是普遍存在的KO恩杜夫斯4与我们的模型相反,该基因在出生后50天内发展为严重的共济失调性脑病,死亡(24). 删除大脑中的基因,由雀巢Cre导致了类似的严重表型(26). 在该模型中,脑干的嗅球和前庭核以及小脑蚓部的后叶受到了特别的影响。这些区域显示神经元丢失以及严重的胶质细胞激活。模型之间存在差异,可以解释我们模型中较温和的表型,包括我们使用了CaMKIIa-Cre公司(CaMKIIa公司神经元特异性,33)而金塔纳和同事使用内斯汀-Cre(在神经元和胶质细胞中表达)。另一个可能导致严重表型的原因恩杜夫斯4-KO模型在发育过程中缺失,因为Nestin驱动的表达在神经元前体的早期胚胎中。相反,CaMKIIa公司-驱动表达是后天的(34). 因此,这些结果表明,中枢神经系统发育过程中的功能性CI是神经元存活所必需的。另一方面,出生后的神经元会耐受更好的CI缺乏。因此,当恩杜夫斯4该基因通过三苯氧胺诱导系统在成年小鼠中广泛失活(26).
此外,最近的研究表明,删除恩杜夫斯4前庭核导致呼吸衰竭并导致死亡恩杜夫斯4-KO小鼠(27).
然而,使用相同的CaMKIIa-Cre公司我们发现,删除CIV组装(COX10)所需的基因后,可以观察到更严重的缺陷,在3-4个月时明显发病(42,43). 类似地,使用CaMKIIa公司启动子,在小鼠中诱导了更严重的表型,动物在3.5个月大时死亡(42). 分子或细胞代偿机制可能会减少恩杜法5神经元消融。我们的数据表明,观察到的较温和的表型可能与通过电子转移黄素蛋白(ETF)系统的电子转移增加有关。ETF参与脂肪酸的氧化,直接给CoQ10提供电子,绕过CI和CII,这将有助于CIII和CIV维持膜电位(36,44). 事实上,我们确实检测到异三聚体酶的ETFA亚基水平增加。
此外,我们发现酮体代谢也可能是这种代偿机制的一部分。在能源短缺期间,大脑积极代谢酮体以产生能量和进行生物合成过程(45,46). ACAT1酶是一种线粒体ACAT,参与酮生成的调节(47). 它催化一个乙酰基辅酶A分子转化为两个乙酰基辅酶A分子。因此,在我们的模型中,CI缺乏可能导致ACAT1增加,增加可进入三羧酸(TCA)循环的乙酰-CoA分子的可用性,生成可通过CII供给OXPHOS系统的琥珀酸。研究表明,在帕金森小鼠模型中输注β-羟基丁酸通过依赖于CII的机制拯救OXPHOS功能(37). 此外,生酮饮食已被证明可以诱导参与能量代谢的线粒体基因的协调上调,并刺激线粒体的生物发生(48). 事实上,生酮饮食减缓了“缺失”小鼠线粒体起源肌病的进展(49)并通过持续的线粒体能量功能降低阿尔茨海默病小鼠模型的病理学(50). 然而,在我们的模型中,酮体增加氧化磷酸化的能力,在这个意义上有助于轻度的恩杜法5CNS-KO尚待阐明。NAD的减少可能会减缓TCA循环+然而,在肝脏中,ACAT1已被证明会发生反向反应,这是构建新酮体的第一步(51). 此外,星形胶质细胞产生大量酮体(52,53). 对观察到的ACAT1水平增加的另一个可能的解释是,由于不能进入克雷布斯循环的过量乙酰辅酶A必须通过生成酮来消除,酮可用于生物合成过程(54).
TCA循环不仅为OXPHOS系统提供还原当量,还生成高能磷酸盐(ATP/GTP)(55). α-酮戊二酸脱氢酶(KGDHC)的产物琥珀酰辅酶A是琥珀酰辅酶A合成酶(SCS)对ADP进行“底物水平磷酸化”的底物。SCS是唯一一种能够在线粒体内膜缺乏质子原动力的情况下产生ATP的酶,在能量不足的条件下,如短暂缺氧,可能在维持基质ATP水平方面发挥作用(56). 因此,该机制也有助于抵消我们模型中的CI赤字。
因此,我们认为,我们观察到的相对温和的表型和迟发是至少两种主要代偿机制的结果:(i)通过黄蛋白脱氢酶电子转移到辅酶Q10的电子转移增加,以及(ii)对生酮环境的生理适应。轻度CI缺陷可能会给这种适应留出时间。
中枢神经系统部分CI缺陷与氧化损伤增加无关
大量工作体外已经表明,药物抑制CI会导致氧化损伤增加,主要是因为CI水平形成的超氧物(57——59). 然而,我们没有发现11个月大的婴儿大脑中存在氧化损伤恩杜法5CNS-KO公司。因为在我们的模型中CI水平高度降低,ROS的形成也可能减少。我们一致认为,基因缺陷会降低氧磷组分的水平,但不会增加氧化损伤。这不仅在目前的CI缺陷模型中发现,而且在CNS CIV缺陷的小鼠模型中也发现(42,43)和线粒体DNA缺失(60). 同样,积累线粒体DNA突变的突变小鼠也没有表现出ROS损伤的增加(61,62)在一些组织中,例如骨骼肌,氧化损伤实际上减少了(63). 同样在患者中,NDUFS4的缺失和集合CI的完全缺失与ROS生成的增加并不平行(64). 此外,通过敲除NDUFS3亚单位或CI组装因子NDUFAF1抑制CI组装,降低ROS的生成体外(65,66). 相比之下,金塔纳及其同事发现恩杜夫斯4-KO小鼠,但该模型在分析的时间点显示出严重的星形胶质细胞增生、小胶质细胞增多和炎症(26).
在中枢神经系统CIII缺陷小鼠模型中,我们确实发现梨状皮层和体感皮层的氧化损伤增加(CaMKIIa-Cre公司CIII的Rieske铁硫蛋白缺失)(42). 很明显,ROS的潜在增加取决于OXPHOS缺陷的位置和类型。然而,在大多数遗传病例中,复合物的稳态水平降低,ROS生成或氧化损伤似乎没有增加(67).
总之,我们开发了一种新的中枢神经系统CI缺乏模型,该模型表现为迟发表型,在某些方面可能模拟在几种神经退行性疾病中观察到的与年龄相关的CI降低(13,14).
与其他呼吸复合物中的缺陷相比,这种轻微的表现可能是由于通过ETF系统的电子转移增加以及对更生酮环境的生理适应所致。在受影响的大脑区域未观察到氧化应激,这证明影响呼吸链CI的遗传缺陷不会导致ROS损伤增加。该模型将非常有助于分析部分CI缺乏在迟发性神经退行性疾病中的作用。