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结构。作者手稿；PMC 2015年2月4日提供。
以最终编辑形式发布为：
结构。2014年2月4日；22(2): 353–360.
2013年12月19日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.str.2013.10.021
预防性维修识别码：PMC3923519型
美国国立卫生研究院：NIHMS551992
PMID：24361270

人类转录辅激活物CBP溴代多巴胺-PHD指状模块对乙酰化氢istone H4识别的结构观察

亚历山大·普罗特尼科夫,帅扬,托马斯·加池·周,埃琳娜·鲁西诺娃,安东尼奥·弗雷斯卡、和周明明*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

溴代多巴胺作为乙酰赖氨酸结合域，调节染色质中的基因转录。溴代多巴胺正迅速成为治疗人类疾病的新的表观遗传药物靶点。然而，由于其短暂性和适度的亲和力，组蛋白结合溴代多巴胺的选择性仍然很难实现。在这里，我们报道了与赖氨酸乙酰化组蛋白H4肽结合的人类转录共激活物CBP的溴代多巴胺-PHD串联模块的高分辨率晶体结构。结构显示PHD指在串联模块中起结构作用，溴代多巴胺偏好赖氨酸乙酰基基序，在−2处损害疏水或芳香残基，在乙酰化赖氨酸的−3或−4处损害赖氨酸或精氨酸。我们的研究进一步提供了对CBP和BRD4的溴代干线分别作为转录共激活物和染色质组织者发挥不同作用的单一和双乙酰化组蛋白H4识别不同模式的结构见解，解释了它们在控制染色质基因表达中的不同作用。

简介

组蛋白中乙酰化赖氨酸残基的溴代多巴胺（BrD）识别是控制染色质基因转录的基本分子机制(Dhalluin等人，1999年;桑切斯和周，2009年). 溴代多巴胺和乙酰赖氨酸结合可调节染色质结构开放，促进转录因子向靶基因启动子和增强子位点的募集，并促进暂停的RNA聚合酶II机械复合体的组装和激活，用于生产性基因转录(蒋，2009). 由于其在基因激活中的关键功能，转录相关蛋白如BET（溴代和末端外结构域）蛋白的溴代(Dawson等人，2011年;Delmore等人，2011年;Filippakopoulos等人，2010年;Nicodeme等人，2010年;Zhang等人，2012年;Zuber等人，2011年)和转录共同激活剂CBP(Borah等人，2011年)和PCAF(Zeng等人，2005年)已被报道为一系列人类疾病（包括癌症和炎症）的新表观遗传药物靶点。

核小体组蛋白中位点特异性赖氨酸残基的乙酰化反应表现出直接有序基因转录的独特生物学功能。例如，组蛋白H3在赖氨酸14（H3K14ac）或赖氨酸18（H3K18ac）的单乙酰化标志着染色质重塑，而组蛋白H4在赖氨酸5和赖氨酸8（H4K5ac/K8ac）或赖氨酸12和赖氨酸16（H4K12/K16ac）的二乙酰化标志着基因转录的活性状态。与组蛋白-甲基赖氨酸结合蛋白模块相比，如色域和PHD指(Patel和Wang，2013年;Yap和Zhou，2010年)，溴代多巴胺/乙酰基赖氨酸的相互作用通常是短暂的，并且具有适度的十到百摩尔亲和力(Filippakopoulos等人，2012年). 因此，人类溴氰菊酯酶的组蛋白结合选择性仍然很难以捉摸。人类溴多巴胺家族由61个成员组成，位于46种不同染色质和转录相关功能的蛋白质中(图1A). 其中有两个不同的亚群，代表组蛋白乙酰转移酶转录共激活物，包括CBP/p300和PCAF，以及具有两个串联溴代腺嘌呤（如BRD4）特征的BET家族蛋白。后者最近已被广泛描述(Filippakopoulos等人，2012年;Moriniere等人，2009年). 然而，尽管它们在基因激活中对赖氨酸乙酰化具有同样重要的功能，但前一亚组溴结构域的组蛋白结合选择性尚不清楚。

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CBP-BrD-PHD与H4K20ac肽配合物的晶体结构

(A类)左图，CBP和其他人类溴代主要蛋白的结构域组织。对，人类BrD蛋白的系统发育树。

(B类)CBP与组蛋白H4K20ac肽结合的串联BrD（绿色）和PHD指（橙色）的3D结构的带状描绘（以黄色碳原子棒显示）。BrD-PHD模块的连接器为浅青色，缺乏电子密度的区域用圆点表示。锌原子显示为洋红色球体。

(C类)CBP BrD-PHD/H4K20ac复合结构的表面填充表示。

(天)CBP BrD-PHD/H4K20ac结构的静电表面电位表示。

另请参阅图S1.

值得注意的是，Ragvin及其同事以前曾报道过人类共激活物p300的溴代多巴胺-PHD指串联模块与具有高度赖氨酸乙酰化的核小体结合，并且这种结合需要溴代多巴素和PHD指同时存在(Ragvin等人，2004年). 此外，我们最近的核磁共振结合分析表明，与p300的序列一致性为98%的CBP的溴代多巴胺表现出与赖氨酸20-乙酰化组蛋白H4（H4K20ac）（GGARKRHR-Kac-VLRDNIQ，残基13-27）的结合优先于其他赖氨酸乙酰化组肽，其分子基础尚不清楚(Zeng等人，2008b). 溴代多巴胺组蛋白结合特异性的测定需要详细了解溴代多巴碱识别功能相关的乙酰化组蛋白肽的分子基础。在本研究中，我们报道了CBP与赖氨酸乙酰化组蛋白H4肽复合物中溴代多巴胺-PHD指串联模块的两种晶体结构。

结果和讨论

CBP-BrD-PHD模块/乙酰化H4肽复合物的结构

为了确定CBP溴代多巴胺的组蛋白结合选择性以及它如何与相邻的PHD指一起发挥作用，我们解决了人CBP溴代谢物-PHD串联模块与赖氨酸乙酰化组蛋白H4肽（残基5–25）复合物的晶体结构含有H4K20ac（KGGKG-LGKGGAKRHR-Kac-VLRDN，其中Kac是乙酰化赖氨酸）(图1B-1D;图S1A-1B)或H4K12ac/K16ac（KGGKGLG-Kac-GGA-Kac-RHRKVLRDN），分辨率分别为1.9º和1.83º(表1). 新结构表明，串联结构域中的溴代多巴胺和PHD指建立直接相互作用，形成一个单一的结构单元。具体而言，CBP溴代多巴胺采用经典的左旋四螺旋束结构与乙酰化H4肽复合。溴结构域的H4肽结合结构与游离状态的蛋白质的结构几乎相同，所有C的均方根衍生为0.46Å和0.47Å一原子。PHD指在与乙酰赖氨酸结合囊相反的螺旋束一端紧靠螺旋B和螺旋C之间的溴代多巴胺进行包装。X射线晶体学数据中的电子密度中缺少连接两个模畴（包括残基1212至1251和1262至1270）的长连接体的很大一部分，这表明溶液中的结构迁移率很高。

表1

结晶数据和精炼统计

CBP-BP/H4K20ac公司CBP-BP/H4K12ac/K16ac
PDB代码------
数据收集
“空间”组第121号第121号
单元格尺寸
  一,b条,c（c）(Å)92.46、59.31、53.4492.01、59.46、53.88
  α, β, γ (°)90, 102.96, 9090, 102.68, 90
分辨率（Ω）（最高分辨率外壳）30.00-1.9 (1.95–1.9)30.00-1.83 (1.88–1.83)
R（右）合并(%)5.1 (32.2)4.9 (48.9)
我/σ我35.9 (5.6)26.7 (2.7)
完整性（%）98.7 (93.8)98.4 (96.9)
冗余7.4 (7.1)4.9 (4.4)
精炼
分辨率（Ω）19.6-1.919.69-1.83
反射次数20,88423,279
R（右）工作/ R（右）自由的(%)23.2/28.324.2年9月20日
原子数1,7091,785
风险管理与可持续发展部
粘结长度（Ω）0.0160.02
结合角（°）1.81.7

值得注意的是，Delvecchio及其同事最新报道的p300催化核心的晶体结构证实了CBP溴odomain-PHD模块的这种结构观察(Delvecchio等人，2013年)由溴代多巴胺-PHD指-HAT串联模块组成，在缺乏乙酰化组蛋白肽的情况下溶解。后一种结构表明，p300中残基1168–1242的区域包含一个含CH2的环结构域，该环结构域与HAT催化结构域相互作用，推测在控制HAT对生物配体的活性方面发挥作用。在我们构建的CBP串联溴代多巴胺-PHD指中，我们只观察到环结构域的部分电子密度。与p300催化核心结构相比，我们可以可靠地追踪几个氨基酸残基的主链原子的电子密度的区域适应了不同的构象，这表明该环结构域非常灵活。然而，值得注意的是，这两种晶体结构代表了CBP溴代多巴胺-PHD指状串联模块的第一个高分辨率晶体结构，以及与赖氨酸乙酰化组蛋白肽结合的CBP溴化多巴胺。因此，我们的结构特征分析如下所述，为CBP在控制染色质中基因转录中的分子功能提供了新的见解。

溴代胺PHD手指相互作用

CBP的PHD指具有标准PHD指褶，该指褶由一个由短α螺旋包裹在一侧的小的两品牌β片组成，短α螺旋由两个锌原子稳定，分别由Cys1199、Cys1200、His1291和Cys1294以及Cys1283、Cys1286、Cys1308和Cys1311配位(图2A). 这两个锌协调中心也为PHD指和溴代多巴胺之间建立的扩展界面提供了一个稳定的基础。该域间界面包括疏水/芳香和静电相互作用网络，分别涉及Asp1149与Lys1289、Trp1151与Phe1280、Asp1155与Lys1203、Trp115与Tyr1204以及Tyr1198与溴代烷和PHD指的Arg1288(图2B).

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CBP的BrD-PHD模块组蛋白识别的分子基础

(A类)CBP的PHD手指特写。与锌原子配位的残留物（在品红球体中）呈棒状并贴上标签。

(B类)溴代多巴胺和CBP PHD指的域间相互作用。

(C类)CBP、BPTF、TRIM24、TRIM28和TRIM33串联BrD-PHD指形模块的结构比较。PHD模块用橙色表示，BrD用蓝色和绿色表示CBP，域之间的连接器用浅青色表示。锌原子显示为洋红色球体。

(天)CBP和BPTF PHD模块的叠加。以卡通形式表示的领域，分别以橙色和鲑鱼色表示CBP和BPTF。对于CBP和BPTF，锌原子分别显示在洋红色和鲑鱼球形中。右侧是与H3K4me2肽结合的BPTF PHD指状物的表面表示（以黄色标记碳原子的棒状物显示）。包含芳香笼的残留物以棒状显示。

(E类)结合到H3K4me2肽的CBP模型的表面表示。方向如所示A类.

(如果)与H3K4me2肽结合的CBP PHD指模型的特写视图。靠近甲基化赖氨酸的残基和排列在结构域凹槽中的残基显示在木条上并标记。

另请参阅图S2和S3.

值得注意的是，虽然参与域间相互作用的许多残基在人类和小鼠等不同物种的CBP或p300中保守，但它们并非都存在于许多不同类型转录相关蛋白的溴代腺苷中，尤其是BET蛋白质和不含溴代多巴胺和PHD指串联模块的蛋白质(图S2). 甚至在溴多巴胺-PHD指状或PHD指状-溴多巴胺串联模块中的域-域相互作用或取向差异很大，如与BPTF的此类串联模块结构的比较所示(Li等人，2006年)，阀内件24(Tsai等人，2010年)，阀内件28(Zeng等人，2008a)和TRIM33(Xi等人，2011年) (图2C). 这表明串联模块中的结构域取向可能与单个结构域或整个串联模块的特定功能有关，这些结构域或整体串联模块在控制基因转录的组蛋白分子相互作用中具有不同的功能。事实上，与其他与组蛋白相互作用的串联模块不同，人类共同阻遏物TRIM28（也称为KRAB相关蛋白，KAP1）的串联PHD指-基底膜作为一种独特的小泛素样修饰物（SUMO）E3连接酶，用于基因转录沉默(Zeng等人，2008a).

PHD指在串联模块中的结构作用

我们进行了广泛的核磁共振15N-HSQC滴定15CBP的N标记串联溴代多巴胺-PHD指以及带有一组游离形式的组蛋白H3和H4肽或具有位点特异性赖氨酸甲基化（例如H3K4me3、H3K9me3、H3G27me3和H4K20me3）的单个PHD指。无论是在串联模块中还是在其单个构建体中，我们都没有观察到PHD指与任何特定的组蛋白肽结合(图S3). 我们的结果与最近对CBP PHD手指的一项研究一致，该手指与组蛋白不相互作用(Park等人，2013年). 为了研究CBP PHD手指的结构-功能关系，我们将其结构特征与已知与H3K4me3结合的BPTF PHD手指进行了比较(Li等人，2006年). 值得注意的是，虽然两个PHD手指的整体结构非常相似，但所有C的r.m.s.d.均为2.8º一原子(图2D)，并且CBP溴代多巴胺-PHD指串联模块中可能存在H3肽结合位点，CBP PHD指中没有识别H3K4me3的BPTF中的关键芳香笼残基，如Tyr10、Tyr17和Trp32(图2E). 这解释了其缺乏与组蛋白肽的相互作用。此外，与乙酰化H4K20ac肽结合的CBP溴代酪氨酸-PHD模块的整体结构与p300溴代酪酸-PHD指状HAT模块的自由形式结构非常相似(Delvecchio等人，2013年). 综上所述，这些结果支持我们的观点，即PHD指在溴代多巴胺-PHD指串联模块中发挥结构作用，该模块作为一个功能单元，协助对CBP组蛋白乙酰转移酶活性的底物识别。

BRD溴胺对位点特异性乙酰化H4的识别

与两个乙酰化H4肽结合的溴代多巴胺-PHD模块的晶体结构揭示了CBP溴代多巴素结合组蛋白选择性分子基础的原子级细节。两种H4肽都包含相同的H4残基5–25，但携带不同的赖氨酸乙酰化位点，即KGG的H4K20acKGLG公司KGGAK公司右侧（RHR）-卡克-V（V）LRDN和KG的H4K12ac/K16acG公司KGLG公司-卡克-GGA公司-卡克-右侧（RHR）KVLRDN（VLRDN）。值得注意的是，在电子密度中只观察到每个H4肽的一小部分（在H4肽中下划线），电子密度以一个乙酰化赖氨酸结合到CBP溴代多巴胺为中心(图3A). 尽管序列中氨基酸残基不同，但与溴代多巴胺结合的两个H4肽在ZA环和BC环之间形成的表面暴露的配体结合囊中采用几乎相同的构象。类似地，在乙酰赖氨酸结合囊中的几个关键残基的主链或侧链构象中，当溴代多巴胺与两个H4肽结合时，观察到的结构衍生物很少。最值得注意的是保守的Asn1168，它与单结合乙酰化赖氨酸的乙酰基H4K20ac或H4K12ac形成一个重要的氢键。值得注意的是，H4K20ac肽中的His18和H4K12ac/K16ac肽中的Leu10的侧链定向在几乎相同的位置，并与CBP溴结构域的Pro1123相互作用。此外，H4K12ac/K16ac肽中Lys8的侧链氨基被与Trp1165、Leu1166、Tyr1167和Asn1168主链氧原子簇的静电相互作用吞没，这些主链氧离子簇形成螺旋B的最后一个C末端转折(图3B). H4K20ac肽中的Arg19部分完成了这组相互作用(图3C). 总之，这些新的结构见解表明，CBP溴代多巴胺更倾向于与单独的赖氨酸乙酰基基序相互作用，这些基序在−2处损害疏水性或芳香性氨基酸，在乙酰化赖氨酸的−3或−4处损害赖氨酸或精氨酸。这个一致的识别序列与我们之前对CBP溴代烷识别H4K20ac的核磁共振结构分析一致(Zeng等人，2008b)以及活化的乙酰化肿瘤阻遏物p53在K382ac（QSTSRHK-Kac-LMFKTEG，残基375-389）(Mujtaba等人，2004年). 后者已被证明在HAT共激活物CBP的p53募集到其靶基因转录激活以响应DNA损伤修复方面发挥重要作用(Mujtaba等人，2004年;Mujtaba等人，2006年).

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CBP BrD识别H4的分子见解与巴西雷亚尔4

(A类)与H4K20ac（黄色）和H4K12ac/K16ac（白色）结合的CBP-BrD-PHD的叠加晶体结构的特写图。H4肽按原子类型进行彩色编码。

(B类), (C类)结合到H4K20ac（黄色）和H4K12ac/K16ac（白色）的CBP BrD-PHD单个结构中乙酰化H4结合位点的特写视图。与肽相互作用的关键蛋白残基显示在木条中。

(天)在荧光各向异性分析中测定CBP和BRD4的BrD对赖氨酸乙酰化H4肽的结合亲和力。H4肽H4K5ac/K8ac、H4K12ac/K16ac和H4K20ac分别由H4残基1–13、5–25和17–23组成。

(E类)CBP BrD和BRD4-BrD1的配体结合囊的重叠。CBP-BrD和BRD4-BrD1的配体结合位点显示在透明表面上，并分别用灰色和浅橙色表示。BRD4-BrD1-H4K5ac/K8ac复合物的H4K5acc/K8ac肽和CBP-BrD-PHD/H4K20ac复合体的H4K20ac肽分别呈青色和灰色。乙酰赖氨酸残留物显示在木条中。在配体结合位点紧密结合的水分子显示为球形。在左侧面板上，CBP蛋白链以卡通形式显示，并用绿色表示。

(如果)水分子在BrD识别乙酰赖氨酸中的作用。CBP-H4K20ac和BRD4-BrD1-H4K5ac8Kac配合物乙酰基-赖氨酸结合位点中的水分子相互作用示意图。水分子显示在球体中，氢键绘制在虚线中，并且给出了受体与受体之间的距离。该图形是使用程序LIGPLOT生成的。

(G公司)CBP（左）和BRD4-BrDs（中）分别对单一和双重赖氨酸乙酰化H4肽进行结构比较。CBP和BRD4显示在浅灰色表面，H4K20Ac和H4K5Ac8Ac肽的碳原子分别为黄色和青色，与肽相互作用的残基显示在棒状物中，碳原子为浅灰色。右侧，CBP-BrD-PHD/H4K20ac和BRD4-BrD1-H4K5ac/K8ac复合物的结构重叠。仅显示CBP的表面表示。用于区分单一结合和二乙酰化H4的残基显示为棒状，碳原子显示为绿色。

另请参阅图S4.

CBP和BRD4溴代mains组蛋白结合特异性的差异

接下来，我们对CBP和BRD4的溴代干线对赖氨酸乙酰化组蛋白H4的识别进行了结构比较，它们在染色质的基因转录调控中具有不同的功能。与美国海关与边境保护局溴碘甲烷不同(图3D;图S4)BRD4的两个溴代主链，以及BET蛋白家族的其他成员，已被证明更倾向于特征性的二乙酰化组蛋白H4序列，尤其是H4K5ac/K8ac，其中H4K5 ac充当BRD4-BrD1中保守Asn140的锚定乙酰基赖氨酸氢键(Filippakopoulos等人，2012年;Moriniere等人，2009年). 引人注目的是，CBP和BRD4-BrD1的溴总管中乙酰赖氨酸结合囊中的五个稳定结合的水分子位于几乎相同的位置(图3E)其中一个水形成两个氢键，一个与乙酰基赖氨酸的氧形成氢键，另一个与CBP中保守的Tyr1125和BRD4中的Tyr97的苯氧基形成氢键(图3F). H4K5ac/K8ac肽中的第二乙酰化赖氨酸H4K8ac-与Trp81、Pro82、Leu92和Ile146增加疏水性和芳香性相互作用，形成位于ZA通道和WPF货架中的浅腔(图3G). 值得注意的是，由于与H4K5acK8ac肽的空间位阻，CBP溴代烷中Arg1173的长侧链会阻止H4K8ac-结合，从而解释了CBP溴化烷可能只与组蛋白中的单乙酰化赖氨酸结合，而BRD4溴代烷可能适应与二乙酰化组蛋白H4的相互作用。

结论

溴代多巴胺/乙酰基赖氨酸识别是一种基本的分子机制，它调节组蛋白和非组蛋白之间的各种蛋白-蛋白质相互作用，这些蛋白质是染色质中受控基因转录激活所必需的。由于人类溴代谢物家族的庞大，不同亚群的溴代谢物质在基因转录中可能具有不同的功能。由于溴代多巴胺/乙酰基赖氨酸相互作用的瞬时性和适度亲和力，在体外单靠生化结合分析不足以确定溴代多巴胺对组蛋白和非组蛋白转录蛋白的结合特异性。在本研究中，我们展示了CBP溴代多巴胺-PHD指串联模块与两种不同乙酰化组蛋白H4肽（分别含有H4K20ac和H4K12ac/K16ac）复合物的高分辨率X射线晶体结构。我们的详细结构分析表明，PHD指在溴代多巴胺-PHD串联模块中起着结构作用，并且CBP溴代多巴胺明显表现出对单一乙酰化序列基序的偏好，该序列基序在−2处损害疏水性或芳香性氨基酸，和乙酰化赖氨酸的−3或−4位的赖氨酸或精氨酸。

我们的研究进一步为CBP和BRD4的溴结构域识别单乙酰化组蛋白H4和二乙酰化组蛋白H4的不同模式提供了结构见解，CBP和BRD4的溴结构域分别作为转录共激活剂和染色质组织者发挥不同的功能。鉴于溴代多巴胺正迅速成为治疗多种人类疾病的新的表观遗传药物靶点，以及CBP作为主要转录辅激活物和BRD4作为关键染色质组织者的功能差异，这一新的结构知识有望促进对组蛋白和转录蛋白中位点特异性赖氨酸乙酰化在控制染色质基因转录中的作用的机制研究。

实验程序

蛋白质和肽的制备

通过PCR扩增编码人CBP溴代多巴胺-PHD指状模块（残基1081–1316）的DNA片段，并将其亚克隆到多istidine编码区下游的pET28a-LIC载体中。CBP BrD-PHD蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）密码子加RIL菌株（Stratagene），添加1 mM异丙基-1-硫代-D-吡喃半乳糖苷，并在18°C下培养过夜。将收集的细胞重新悬浮在pH为7.4的50 mM磷酸钠缓冲液中，补充500 mM氯化钠、5 mM咪唑、2 mMβ-巯基乙醇和5%甘油，并使用微流控器（微流体公司）在20000 psi下进行裂解。通过高速离心对粗提取物进行澄清后，将裂解液装入5 mL HiTrap螯合柱（GE Healthcare）中，加入镍2+清洗色谱柱，用20 mM Tris-HCl缓冲液、pH 8.0、250 mM氯化钠、250 mM-咪唑和5%甘油洗脱蛋白质。接下来在Superdex200柱（26×60）上纯化蛋白质（GE Healthcare），用20 mM Tris-HCl缓冲液、pH 8.0和150 mM氯化钠进行平衡。用凝血酶（Sigma）处理该蛋白以分离其His-tag，并通过离子交换色谱进一步纯化至均一性。BRD4的BrD通过镍-IDA柱（Invitrogen）上的亲和层析纯化，然后通过凝血酶裂解去除多H标记，使用前面描述的程序(Zhang等人，2012年). 从生长在含有15全日空航空公司4Cl.合成组蛋白肽由GenScript合成，并经LC-MS分析证实。

核磁共振研究

蛋白质（0.2 mM）和组蛋白肽（1.2 mM）在pH 7.4的100 mM磷酸钠缓冲液中制备，缓冲液中含有5 mM全氘化DTT和0.5 mM EDTA2O（运行）/2H（H）2O（9/1）。全部为二维1H（H）-15N HSQC（异核单量子关联）核磁共振波谱是在25°C下用500 MHz或600 MHz核磁共振波谱仪采集的。

荧光各向异性结合分析

如前所述，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的溴代烷抑制剂作为分析探针，在荧光各向异性竞争分析中评估了赖氨酸乙酰化组蛋白肽与CBP和BRD4的BrD的结合亲和力(Zhang等人，2012年). 使用蛋白质（0.25–1µM）和荧光探针（80 nM）进行竞争实验，并增加PBS缓冲液（pH 7.4）中总体积为80µL的未标记竞争配体浓度。荧光配体和蛋白质在25°C下用Safire 2微孔板读取器（Tecan）孵育1小时后获得测量结果。在竞争结合试验中，荧光配体浓度≤2Kd日蛋白质浓度设定为50-80%的荧光配体结合。通过对Nicolovska-Coleska及其同事提出的Cheng-Prussoff方程的修正，计算了竞争配体的解离常数(Nikolovska-Coleska等人，2004年). 假设一个位点竞争性结合模型，用于计算K我来自IC50使用Prism拟合数据恢复的值：

K我=[我50]([L（左）50]Kd日+[P（P）0]Kd日+1),

其中[I50]是50%抑制时自由抑制剂的浓度，[L50]50%抑制时自由标记配体的浓度，以及[P0]，游离蛋白浓度为0%抑制。请注意Kd日对于每个蛋白质探针对，是可分辨的极限K我在竞争分析中。

人CBP-BrD-PHD蛋白的结晶

纯化的CBP BrD-PHD蛋白（15 mg/mL）与组蛋白H4K20ac肽（H4的残基13–26）或H4K12ac/K16ac（H4中的残基5–25）以1:10的蛋白质与H4的摩尔比在20°C下使用坐滴蒸汽扩散法结晶，方法是将1µL蛋白质溶液与1µL储液溶液混合。CBP BrD-PHD/H4K20ac复合物在25%PEG 3350、0.2 M氯化镁和0.1 M HEPES pH 7.5中结晶。CBP BrD-PHD/H4K12ac/K16ac复合物在20%PEG MME 2000、0.2 M三甲胺N-氧化物和0.1 M Tris pH 8.5中结晶。在液氮中冷冻之前，将晶体浸泡在添加了20%甘油作为冷冻保护剂的相应母液中。

数据收集和结构确定

在布鲁克海文国家实验室（Brookhaven National Laboratory）的国家同步辐射光源（NSLS）的光束线X6A处，在100K下收集了X射线衍射数据。使用HKL-2000套件处理数据(Otwinowski，1997年). CBP-BrD-PHD的结构通过使用MOLREP程序的分子置换来解决(Vagin，1997年). 采用CBP-BrD（PDB代码3DWY）的晶体结构作为搜索模型。ARP/wARP(Perrakis等人，2001年)用于自动建模。REFMAC公司(Murshudov等人，1997年)用于结构细化。图形程序COOT(埃姆斯利，2004)用于模型构建和可视化。晶体衍射数据和结构细化统计数据显示在表1.

​
  • CBP溴odomain-PHD手指串联模块作为单个结构单元发挥作用。
  • CBP PHD指具有结构作用，不与组蛋白相互作用。
  • CBP溴结构域仅识别单乙酰化组蛋白H4。
  • CBP和BRD4溴代谢物具有不同的组蛋白H4识别模式。

补充材料

01

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致谢

我们要感谢西奈山伊坎医学院核磁共振设施的曾磊博士，以及布鲁克海文国家实验室国家同步加速器光源X6A光束线的Jean Jakoncic博士和工作人员，感谢他们协助X射线数据采集。这项工作得到了美国国立卫生研究院的部分研究资助（R01HG004508和R01CA87658给MMZ）。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

接入代码与组蛋白H4K20ac或H4K12ac/K16ac肽复合的CBP溴代多巴胺-PHD指的结构因子和坐标已分别以PDB ID代码4N3W和4N4F存放在蛋白质数据库中。

作者贡献

A.N.P.和M.-M.Z构思了这个想法，并为这个项目设计了实验。S.Y.和T.J.Z.制备蛋白质样品并进行结晶。A.N.P.解决了晶体结构。S.Y.进行了核磁共振研究。A.F.构建cDNA，E.R.进行荧光各向异性结合研究。A.N.P.和M.-M.Z写了这份手稿。

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