公共科学图书馆一号。2014; 9（2）：e87415。
预测乳腺癌患者对Fulvestrant反应的基因表达评分的制定和验证
,1,* ,1 ,1 ,1,6 ,2 ,4 ,三和2,5
威克托·马津
1丹麦Hørsholm医学预后研究所
6现就职于丹麦奥胡斯C奥胡斯大学医院临床流行病学系
贾斯汀·林德曼
2阿斯利康英国有限公司，肿瘤iMED，英国柴郡奥尔德利公园
伊丽莎白·安德森
2阿斯利康英国有限公司，肿瘤iMED，英国柴郡奥尔德利公园
5现就职于奥地利维也纳Boehringer-Ingelheim RCV GmbH&Co KG
魏旭，编辑器
1丹麦赫索尔姆医学预后研究所
2阿斯利康英国有限公司，肿瘤iMED，英国柴郡奥尔德利公园
三阿斯利康研发中心美国沃瑟姆波士顿
4马萨诸塞州总医院，马萨诸塞州，波士顿，美利坚合众国
5现就职于奥地利维也纳Boehringer-Ingelheim RCV GmbH&Co KG
6现就职于丹麦奥胡斯C奥胡斯大学医院临床流行病学系
美国威斯康星大学麦迪逊分校
竞争利益：作者阅读了该杂志的政策，并有以下冲突。所有作者均声明过去或现在在一家公司（阿斯利康或医学预后研究所）的主要工作或所有权，该公司有可能从这些结果中受益。医学预后研究所持有该主题的专利申请。这并没有改变作者对PLOS ONE关于共享数据和材料的所有政策的遵守。
构思并设计了实验：SK JL EA。执行实验：TJ AH IK。分析数据：SK WM NL EA。撰写论文：SK NL EA。
2013年8月12日收到；2013年12月24日验收。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
摘要
Fulvestrant是一种选择性雌激素受体拮抗剂。基于在富尔维斯特存在下对60个人类癌症细胞系（NCI60）的生长抑制测定，以及60个细胞系的基线基因表达，建立了预测富尔维斯特效应的基因表达评分。该分数基于414个基因，其中103个在敏感细胞系中表达增加，而311个在无反应细胞系中表现增加。敏感性基因主要通过雌激素受体α感应信号，而抗性基因调节PI3K信号通路。后一种基因表明，靶向PI3K途径的药物可以克服对富维司琼的耐药性。在一组20个乳腺癌细胞系中测量了该基因表达评分的水平及其与fulvestrant反应的相关性。预测的灵敏度与测量的灵敏度很好地匹配（CC=−0.63，P=0.003）。该预测因子应用于II期临床试验中获得的肿瘤活检。根据新辅助治疗前活检的RNA图谱，在不了解后续反应的情况下，预测每个患者对富尔维斯特治疗的敏感性。然后将预测结果与临床反应进行比较，结果表明反应者的敏感性预测明显高于无反应者（P=0.01）。当预测中包括临床协变量、肿瘤分级和雌激素受体H评分时，有应答者和无应答者之间的预测敏感性差异有所改善（P=0.003）。与临床数据相比，使用预先定义的临界值将患者分为预测敏感型和预测耐药型，阳性预测值为88%，阴性预测值为100%。我们的结论是，使用新的基因表达预测因子进行预筛查的患者有可能确定那些患有局部晚期雌激素受体阳性乳腺癌的绝经后妇女最有可能对富尔维斯坦产生反应。
介绍
Fulvestrant是一种高选择性雌激素受体（ER）拮抗剂，没有已知的激动剂效应，已被批准用于治疗绝经后疾病进展妇女的ER阳性转移性乳腺癌。对ER阳性原发性乳腺癌患者进行的大量临床前研究和术前研究表明，fulvestrant治疗主要通过剂量依赖性下调ER蛋白发挥作用。这伴随着ER调节蛋白、孕酮受体（PgR）的耗竭，以及Ki67标记指数显示的增殖活性降低。这种作用机制不同于三苯氧胺，它是一种选择性雌激素受体调节剂，也不同于芳香化酶抑制剂，如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦，它们抑制内源性ER配体雌二醇的合成。Fulvestrant独特的作用机制被认为有助于其对使用其他内分泌药物治疗后病情进展的患者的疗效[1]此外，在一线设置中，有一些证据表明富尔维斯特可能比目前标准的芳香化酶抑制剂更有效。FIRST试验是一项随机的II期研究，比较了富尔维斯特和阿那曲唑在激素受体阳性的绝经后晚期乳腺癌一线治疗中的疗效，其数据显示，富尔维斯特兰500mg组的进展时间为23.4个月，而阿那曲氮组为13.1个月（HR=0.66，95%可信区间0.47–0.92；p=0.01[2]). 然而，正如其他内分泌药物的情况一样，很明显，并非所有ER阳性肿瘤患者都对富尔维斯特治疗有反应。显然，有一部分患者受益匪浅，而其他患者则根本没有反应。显然需要一种方法来识别ER阳性乳腺癌患者的这些亚组，并指导其进行适当的治疗。
标准护理中使用单个生物标记物（如表皮生长因子受体（EGFR）家族成员ER或HER-2）的测量，以确定患者对抗雌激素（如他莫昔芬）或HER-2靶向治疗（如曲妥珠单抗（Herceptin™））更有可能产生反应。由于这些靶向治疗在生物标记物阳性患者中的治愈率不太理想，因此可以预测对现有乳腺癌治疗反应潜力的生物标记物可能有助于改进治疗决策。目前正在开发几种能够同时测量小样本肿瘤组织中多种生物标记物的方法，其中一些已被引入乳腺癌的治疗中。其中一种检测是Oncotype Dx检测，它被证明具有预后价值，因为它可以识别早期复发风险增加的原发性乳腺癌患者[3]然而，能够更准确预测特定治疗反应的诊断分析尚未对乳腺癌的常规临床管理产生影响。
NEWEST（雌激素敏感性肿瘤女性新辅助内分泌治疗）试验比较了新辅助环境下500 mg富尔维斯特与250 mg富尔维斯特的临床和生物活性。在这项多中心II期研究中，患有可手术的局部晚期（T2，3，4b；N0-3；M0）ER阳性乳腺肿瘤的绝经后妇女被随机分组，在手术前接受两种剂量的新辅助治疗，为期16周[4]在基线检查、4周后和手术时进行肿瘤核心活检，以评估生物标记物表达的变化。在同一时间点用三维超声测量肿瘤体积。在该试验中，使用500 mg fulvestrant治疗后肿瘤体积减少或疾病稳定（使用RECIST标准）的患者百分比为36%（69名患者中有26名）。因此，在研究开始时肿瘤被证实为ER阳性的内分泌治疗初治患者群体中，有一个亚组从富尔维斯坦治疗中获得了特别的临床益处。这些临床反应数据，以及参与者生物反应信息和冷冻肿瘤组织的可用性，使得NEWEST试验成为一个有吸引力的环境，在该环境中，可以研究富尔维斯特反应的新标记物的潜力。
在本研究中，我们描述了治疗前基因表达评分的发展，该评分预测了对富尔维斯特500 mg的反应。这是基于对NCI60癌细胞株面板中的一些基因的鉴定，其基线表达与体外富尔维特治疗的敏感性相关。在一组扩大的乳腺癌细胞系中，以盲法进一步验证了产生的基因表达分数的表达。最后，在NEWEST研究提供的肿瘤样本中测定基因表达得分，并与肿瘤大小的缩小相关。据预测，肿瘤对fulvestrant敏感且接受500mg剂量fulvestlant治疗的患者中，有很大比例的患者出现了部分反应（根据RECIST标准，8名患者中有7名患者出现了局部反应）。有进一步证据表明富尔维斯特疗效的剂量依赖性，因为患者预计对富尔维斯特朗敏感，但服用低剂量富尔维特的患者通常只表现出疾病稳定（12人中有9人）。大多数肿瘤表达低于敏感性评分中位数水平的患者，无论接受的剂量如何，对富维司琼都没有反应（19名患者中有13名）。
材料和方法
道德声明
该研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并得到了各参与中心当地伦理委员会的批准。主要的IRB是Dana Farber/哈佛机构审查委员会。在加入研究之前，获得每位患者的书面同意；同意书中明确表示，这些信息将被存储并用于研究。
同意书解释说，“本研究创建的医疗信息可能会成为您病历的一部分。”患者被告知，他们受保护的健康信息可能会与研究赞助商阿斯利康共享。
患者
NEWEST（雌激素敏感性肿瘤女性新辅助内分泌治疗；9238IL/0065）是一项随机、开放标签、多中心、II期研究，涉及绝经后新诊断、ER阳性、局部晚期乳腺癌患者，这些患者此前未接受过乳腺癌治疗（NCT0093002）。符合条件的患者在手术前16周内随机分为1∶1服用富尔维斯特500 mg或250 mg。在第0天、第14天、第28天以及此后每隔28天进行两次5 ml肌肉注射，每次给予富尔维斯特500 mg，持续16周。在第0天、第28天和此后每28天注射一次富尔维斯特250 mg，每次5 ml，持续16周[4].
NEWEST共登记了211名患者。其中173人完成了研究，121人符合所有方案标准。44名患者的新鲜冷冻预处理样品中含有足够的RNA（100 ng）。由于阵列质量问题（见下文），两个样本被丢弃，剩下42名患者。在这42名患者中，500 mg治疗组有22名，250 mg治疗组20名。
在16周的治疗阶段，患者每4周进行一次临床乳房检查。在最终手术前的基线、第4周和治疗16周后，通过3D超声测量肿瘤体积。肿瘤反应定义为完全反应（CR，所有病灶消失）、部分反应（PR，3D超声肿瘤体积至少减少65%）、疾病进展（PD，肿瘤体积至少增加73%）或稳定疾病（SD，既不是部分反应也不是疾病进展）。部分反应的减少与基线有关，但进展性疾病的减少与之前任何评估中的最小肿瘤体积有关。客观应答者是指完全应答或部分应答的患者。
在可用于阵列分析的42名患者中，15名患者有部分反应，22名患者病情稳定，2名患者病情进展，3名患者无法评估。
ER H评分是通过使用1D5抗ER抗体（Dako）进行免疫组织化学染色，然后对五种染色类别（阴性、极弱、弱、中等和强）中每一种的肿瘤细胞百分比进行显微镜评估，得出0至300的H评分。
审判223[5]是一项新佐剂阿那曲唑单独或与吉非替尼联合治疗早期乳腺癌的安慰剂对照试验。我们使用B组和C组患者：阿那曲唑1 mg/d，持续16周，安慰剂1片/d，口服2周。B组患者口服吉非替尼250 mg/d，随访14周，而C组患者继续服用安慰剂14周。我们收到21名B组和C组患者的治疗前活检材料，2周后进行Ki67测量。我们收到了16名C组患者的治疗前活检材料和结果信息（RECIST）。
微阵列分析
根据制造商的说明，使用Ambion MessageAmp Premier扩增后，在Affymetrix HG-U133_Plus_2阵列上运行来自NEWEST的44个RNA样品和来自223个的21个样品。用于接受RNA的质量标准是至少100 ng总RNA，扩增成至少5µg aRNA。来自NEWEST的42个阵列和来自223个样本的21个样本通过了质量标准和阵列图像的视觉检查，以确定是否存在空间伪影。所有阵列数据均存放在GEO，登记号为GSE48905和GSE48960。
基于体外试验的预测因子开发
以前曾描述过开发药物反应预测因子的体外方法，用于临床前应用[6]和临床使用[7].生长抑制值（GI50)从DTP网站下载了60个接受富尔维斯特治疗的细胞株(http://dtp.nci.nih.gov). 60个细胞系中有6个来源于乳腺癌，其中2个为ERα阳性，4个为ERβ阴性。在这个NCI药物筛选中，细胞生长在RPMI1640中，添加了5%的胎牛血清（雌激素的来源），并添加了浓度为10−8M至10−4M以计算GI50在没有fulvestrant的情况下，在Affymetrix基因芯片平台上对相同细胞系的基线基因表达测量值来自[8]基因表达测量值进行了logit归一化，即对每个阵列进行转换logit=log[（x−背景）/（饱和−x）]，然后进行Z转换以达到平均值零和SD 1，并与生长抑制（−log（GI50)). 皮尔逊相关系数大于0.25或小于−0.25的基因分别被视为对fulvestrant后期治疗的敏感性和耐药性的生物标记，并保留为fulvestlant的反应谱。对其他药物他莫昔芬、阿那曲唑、雷洛昔芬和托雷米芬重复整个过程，得出每种药物的反应曲线。
为了减少通过皮尔逊相关阈值的假阳性标记的数量，我们应用了一种生物相关过滤器，该过滤器只保留已知的相互作用标记，类似于下面描述的方法[9].
fulvestrant的反应谱由103个正相关问题和311个负相关问题组成，并在临床数据揭盲前锁定。
临床样品中Fulvestran敏感性的预测
稳健多阵列平均（RMA）后[11])将来自临床样本的阵列数据归一化，利用响应曲线中每个基因的表达来预测敏感性：预测得分=平均值（正相关基因）-平均值（负相关基因）。这意味着配置文件中的每个基因都被赋予同等的权重。接下来，通过对所有患者样本的预测得分进行线性变换，将预测得分标准化为0到100的范围。
固有亚型和复发风险的预测
使用PAM50质心预测管腔A、管腔B、Her2、正常和基底的固有亚型，计算公式为[12]使用来自的genefu包www.bioconductor.org。复发风险（ROR-S）评分的计算方法如下：[12]使用基因列表和genefu中提供的风险函数计算Oncotype DX复发评分。
统计分析
根据统计分析计划，对患者对富尔维斯特的预测和观察敏感性进行统计分析，预先指定的截止值等于临床数据揭盲前商定的人群中位数和成功标准。主要分析是对客观应答者（PR）和无应答者（SD+PD）之间预测得分差异的单侧Wilcoxon检验，以及预测得分和Ki67与基线相比在4周时的下降之间的Pearson相关性。统计分析计划中规定的临床协变量与预测得分相结合，无偏差，方法是对预测得分和每个可用的临床协变量给予同等权重：组合得分=预测得分+30*肿瘤等级+ER Hscore/3预测敏感性和预测抗fulvestrant性之间的界限被预先定义为预测得分的人群中位数。从两个剂量组的所有样本中取人口中位数。利用pROC软件包计算接收器工作特性（ROC）曲线下面积（AUC）网址：www.r-project.org使用Delong方法计算置信区间[13].
结果
反应预测基因及其生物学解释
在NCI60细胞系中，共有103个与Fulvestran敏感性相关的问题。这意味着它们在对富尔维斯特敏感的细胞系中的表达高于耐药细胞系。103个探针映射到83个独特的基因，如。在本表中，它们根据功能关联进行分组。这些敏感基因中的一些（在富司琼敏感细胞系中表达较高）通过雌激素受体α感知信号，这可能是因为它们的启动子中含有雌激素反应元件（ERE），和/或通过微小RNA调节，或通过与雌激素-ER复合物的直接相互作用[14]–[18]其他基因与细胞激活和刺激反应的更广泛的基因本体定义有关。许多基因与免疫系统和细胞粘附有关（未显示）。请注意，组可能重叠。
表1
fulvestrant敏感性基因的功能分组。
| 功能 | 基因 |
| 雌激素信号 | GATA3、TFF1、BCL2、NHERF1、PDCD4 |
| GO细胞激活 | GATA3、CD8B1、BCL2、CD37、SPI1、DGKZ、SELPLG、ICOS、FLT3LG、CD28、CD48、ITGAM |
| GO对刺激的反应 | GATA3、TFF1、CD8B1、BCL2、FBP1、ITGB7、PDCD4、CD37、ORM1、DGKZ、SELPLG、ICOS、FLT3LG、HCLS1、PTGER3、CD28、BIN2、TOB1、ATP2A3、MFNG、TNFRSF25、IGLL1、SIPA1L3、NUP210、CISH、IFI30、CTSS、CD48、IGFBP5、RNASE6、CLICICC3、DOK2、GLUL、ICAM3、ITGAM、IGJ、ICAM2、DMBT1、HSPA6、PACAP |
| 其他 | CBFA2T3、SPDEF、HBA1、TBC1D30、VNN2、HIST1H3H、HBA2、TARP、KIAA0182、PTP4A3、JUP、PSCD4、HEM1、GIMAP4、HAB1、SIRPB2、PNAS-4、TRDD3、CIZ1、CLDN3、HIST1 H2BG、SLC39A6、FMO5、ASS、LRMP、MCCC2、MAGEA9、MYLIP、CABC1、MDS028、LOC81558、GALNT6、FOXO1A、DHCR7、SSBP2、BG1、ZNF165、C1或f 38岁，TETRAN，@艺术、PSTPIP2、PIM2、ZNF394、ABCA7 |
共有311个问题与fulvestrant耐药性相关，这意味着它们在对fulvestlant耐药的细胞系中表达更高。按相关性排列的前100个问题映射到78个独特的基因，这些基因接受通路分析，并根据功能关联进行分组许多这些抗性基因（在抗性细胞系中高表达）直接或间接调节PI3K信号通路，如也在
[19]–[27]它们在对fulvestrant耐药的ER阳性乳腺癌细胞株中的表达均高于对fulvistrant敏感的ER阳性细胞株（在单侧Wilcoxon秩检验中p=0.01），因此提供了一个潜在的假设来解释为什么一些ER阳性细胞系对fulvastrant耐药。事实上，11基因PI3K谱的表达与ER阳性细胞株对fulvestrant的耐药性相关（CC=0.76，p=0.03）。这一基因集分析产生的一个假设是，靶向PI3K-AKT途径的药物可以克服对富维司琼的耐药性。其他耐药基因参与更广泛定义的细胞死亡，或响应刺激或参与细胞骨架蛋白结合。
文献中报道的相互作用。富尔维斯特敏感基因（绿色）和抗性基因（红色）与已知雌激素受体信号转导途径（蓝色）之间的相互作用。每一种相互作用都取自文献，既可以在转录水平上，也可以在蛋白质相互作用水平上。ERE是指基因启动子中的雌激素反应元件。据报道，许多抗性基因与肌动蛋白细胞骨架相互作用。
表2
fulvestrant抗性基因的功能分组。
| 功能 | 基因 |
| PI3K途径 | ANXA1、ZFAND5A、TIMP1、CD44、ACTN4、WDR1、RPS6KA3、MSN、PFN1、CD44和标记 |
| GO细胞死亡 | ANXA1、GPX1、PRNP、TIMP1、PSMB2、CD44、ACTN4、PSMD1、VIM、RPS6KA3、PFN1、YWHAB、GARS、YWHAZ、PPP2CB、MET、ACTN1、FOSL1、TNFRSF10B、FTL、PKM2、TXNRD1、F2R、CAV1、SPTAN1、TNFRSF12A |
| GO对刺激的反应 | ANXA1、GPX1、SPTBN1、ANXA2、CAPN2、PRNP、TIMP1、PSMB2、UGP2、CD44、ACTN4、MCF2L2、WDR1、PSMD1、RPS6KA3、PFN1、ASPH、YWHAB、LGALS3BP、CAV2、S100A10、PTTG1、YWHAZ、PPP2CB、MET、ACTN1、RHEB、FOSL1、TNFRSF10B、ELK3、RHOC、TXNRD1、RANBP1、F2R、CALU、STRAP、GSTO1、UPP1、ETV5、MAP4K4、TXN、PLAUR、CAV1、SPTAN1、TNFRSF12A |
| GO细胞骨架蛋白结合 | SPTBN1、ANXA2、CAPN2、TMSB10、PRNP、ACTN4、ANXA2P2、WDR1、MSN、PFN1、MARCKS、MPRIP、ACTN1、TPM4、MAPRE1、SPTAN1 |
| 其他 | PSMA1、TM4SF1、SPATS2L、ETF1、ACTG1、SEPT10、RCN1、FAT1、FLJ10350、CLIC1、CARS、FKBP1A、FTL、TPI1、PKM2、FLNA、TNPO1、NUDC、LDLR、AAK1、GALNT2、EFHD2、IMP-2 |
氟维司琼在乳腺癌细胞系中的敏感性预测
为了验证基于NCI60细胞系面板开发的预测因子确实能够预测乳腺癌细胞系的敏感性，我们根据另一个实验室测量的基线基因表达值盲预测了20个乳腺癌细胞株的敏感性[28]揭开盲后，将预测分数与测量的GI进行比较5020个细胞系的fulvestrant值(). Pearson相关性为负0.63，因为较高的预测敏感性反映为较低的GI50（P=0.003）。这远远超出了预先规定的成功定义，相关性为-0.30。
20个乳腺癌细胞株对富尔维斯特的预测和测量敏感性的比较。(A类)ERα状态由[28]使用免疫分析或基因表达，并以颜色代码显示（绿色，ERα阴性；红色，ERα阳性）。在western blotting中，SUM-52PE对ERα基因表达呈阳性，但对ERα呈阴性。预测分数是根据基因表达测量值计算出来的，并已归一化为0到100的范围（无单位）。如果将50的临界值应用于该评分，则15个细胞系中有9个被正确预测为耐药（GI505µM或更高），5个细胞系中有5个被正确预测为敏感。(B类)线性标度上的（A）ERα阳性细胞系亚群。GI公司50大于10µM的值显示为10µM。
显示，所有ER阳性细胞株（只有一个除外）的预测敏感性都在80到100范围内，无论它们对富尔维斯特敏感还是耐药。然而，仅对ER阳性细胞株进行的亚组分析表明，即使在ER阳性细胞系中，预测因子也能够根据其对富尔维斯坦的敏感性来区分细胞株（CC=-0.74，P=0.037，). 这不能仅用ESR1或PGR的表达来解释（CC=0.34和CC=-0.23，这意味着它们的表达分别与fulvestrant敏感性（GI）呈反相关和弱相关50)当在该亚组中单独分析时）。
因此，在ER阳性乳腺癌患者中，预测因子可能能够区分Fulvestran治疗的应答者和非应答者。
临床样品中Fulvestran敏感性的预测
计算了22名接受500毫克剂量富尔维斯特治疗的患者的富尔维斯特兰预测分数，我们对这些患者进行了治疗前基因表达测量。预测是在不了解临床结果的情况下以盲法进行的。揭盲后，将反应者的预测敏感性（PR，见方法）与无反应者的预计敏感性（SD+PD）进行比较(). 两名患者的反应无价值。
NEWEST试验500 mg富尔维斯特队列的预测评分和治疗反应。应答者是指在接受500 mg富尔维斯特治疗16周后，根据RECIST标准（PR，n=11），肿瘤体积缩小的患者。无应答者定义为16周治疗后病情稳定（黑色）或进展（红色）的患者（SD+PD，n=9）。对有应答者和无应答者预测敏感性之间的差异进行单侧Wilcoxon检验，得出P值为0.01。预先指定的截止值（预测分数的中位数）显示为橙色线。方框表示上四分位数、中位数和下四分位数。
预测的敏感性和Ki67从基线检查到4周的绝对减少量之间的相关性计算为0.32（500 mg和250 mg剂量，单侧p值0.02）。这在很大程度上反映了4周时预测灵敏度与Ki67之间的负相关（CC=−0.32，p=0.02）。只有预测对fulvestrant耐药的肿瘤在4周时Ki67值较高。预测分数与Ki67从基线检查到第4周的相对降低无显著相关性（CC=0.15）。在临床试验中，Ki67的相对和绝对变化在治疗4周后都是显著的（250mg剂量时平均减少47%，500mg剂量时平均减少79%，[4])
乳腺癌的标准临床病理特征已为人所知：尤其是免疫组织化学法测定的ER含量（H评分）、肿瘤分级、肿瘤大小和患者年龄。因此，在揭开盲之前，计划将预测分数与这些协变量进行比较，并评估组合的性能。
当将ER H评分与Ki67的绝对减少值相加时，综合评分与预测敏感性的相关性增加到0.41。
预测的敏感性与方法部分中描述的其他协变量相结合。显示了将500mg剂量患者的预测评分与肿瘤分级和ER H评分相结合得出的评分（综合评分）。很明显，与通过比较个体值和响应值获得的结果相比，这种组合得分在响应者和非响应者之间提供了更好的分离。尽管根据ER阳性分类选择了所有患者作为入选者，但H评分中ER受体状态的更定量测定显然包含区分富尔司琼反应患者和无反应患者的信息。肿瘤分级也是如此。
fulvestrant敏感性和协变量的联合评分可用于肿瘤分级和ER H评分。将应答者（PR，n=8，绿色）与无应答者（SD，n=7，黑色）进行比较。五名患者，包括两名患有进展性疾病的患者具有“未完成”或“无法评估”的成绩信息，并被排除在分析之外。对有应答者和无应答者预测敏感性之间的差异进行单侧Wilcoxon检验，得出P值为0.003。组合得分的人口中位数处预先指定的截止值用橙色线表示。如果使用该临界值将这一非常有限的患者样本分为预测的敏感和预测的抗fulvestrant患者，预测的PPV为88%，预测的NPV为100%。
通过测量接收器工作特性（ROC）曲线下面积（AUC）来比较不同的预测因子。显示了灵敏度和特异性之间的权衡如何随使用的所有可能的截止值而变化。可以看出，预测分数似乎比临床协变量ER H分数和肿瘤分级的组合（AUC 0.74，95%CI 0.47–1.0）更准确（AUC 0.81，95%CI 0.6–1.0），但预测分数和协变量的组合更佳（AUC 0.91，95%可信区间0.73–1.0）。在这个有限的样本量中，组合评分和分级+ER评分之间的AUC差异在统计学上并不显著。
比较三个预测分数的接收器操作特性：等级+ER（橙色）、预测分数（蓝色）和组合分数（绿色）。虚线显示AUC为0.5。
应用截止值后，将患者分为预测敏感型和预测耐药型会丢失定量预测分数中的有价值信息。预测分数为100的患者比预测分数为60的患者更有可能对治疗作出反应，尽管他们都被归类为对富尔维斯特敏感。该信息可以在逻辑回归中可视化，该逻辑回归将预测得分转换为对治疗的反应概率。显示了三个预测分数的logistic回归曲线：等级+ER、预测分数和组合分数。同样，通过提供更大范围的对富尔维斯坦治疗反应的概率（从5%到99.66%），综合得分更高。然而，它只比预测分数稍好（反应概率为9%至98%）。
fulvestrant预测分数与反应概率之间关系的Logistic回归。显示了三个预测因子：等级+ER（橙色）、预测分数（蓝色）和组合分数（绿色）。由于样本量有限，95%的置信区间相当高（未显示），但预测分数的逻辑回归的Wald检验在统计学上具有临界显著性（P=0.0499），组合分数也是如此（P=0.075）。所有分数均已归一化为0到100之间的分数进行比较。
与其他乳腺癌基因表达特征的比较
许多预测和预测特征已经专门针对乳腺癌开发出来。其中包括PAM50基因列表，该列表将患者分为管腔A、管腔B、Her2、基础亚型和正常亚型。应用来自的PAM50矩阵[12]500 mg组的基线样本显示，有7个管腔A样、12个管腔B样和1个正常样（这是包含正常乳房样本的PAM50训练集的结果）。管腔亚型与临床反应无显著相关性（fisher P=0.07），也不参与包括肿瘤分级和ER评分在内的多元回归模型。当使用子类型创建Parker描述的风险-消逝（ROR）评分时[12]，ROR评分与Ki67治疗后的变化无相关性（P=0.94）。
帕克[12]观察到ROR评分较高的患者对化疗T/FAC新辅助治疗的临床反应概率较高。同样，在我们的队列中，ROR评分与fulvestrant治疗反应的较高概率相关（AUC 0.74，95%CI 0.54-0.94）。将ROR评分与临床协变量评分和ER H评分相结合并没有改善NEWEST数据集中的相关性（AUC 0.73，95%CI:0.48–0.99）。这表明ROR评分中的预测信息已经存在于临床协变量中（AUC 0.74，95%CI 0.47-1.0）。
Oncotype DX特征用于预测早期乳腺癌复发的风险。复发评分与Ki67绝对值显著相关（P=3×10−5)治疗后4周（P=0.03），但与治疗期间Ki67的绝对（P=0.86）或相对（P=1.0）变化无关。在多变量模型中，复发评分对预测治疗反应没有帮助。
公开签名[29]锌指转录因子诱导的fulvestrant耐药性与我们的特征重叠最小。在我们的fulvestran预测分数中使用的95个问题中，只有5个是已发表的fulvistran耐药性特征中的问题，而已发表的95个无法预测fulvestren治疗队列中的反应（在反应分数和无反应分数之间的单侧Wilcoxon检验中，P=0.29）。
250 mg fulvestran方案分析
在NEWEST试验中，19名患者接受了较低剂量的250 mg fulvestrant，获得了阵列数据和结果信息。显示了250 mg fulvestrant治疗的有应答者和无应答者的预测敏感性得分。在这19名患者中，总有效率（CR+PR）仅为500mg剂量患者的一半，分别为26%和50%。无应答组的预测得分范围很广，该组的平均得分与应答者没有显著差异。虽然两组之间预测分数差异不明显的原因尚不清楚，但可能是由于小组规模较小，以及服用了较低剂量的fulvestrant，这使得本试验中肿瘤Ki67水平下降较小[4].
250 mg富尔维斯特治疗患者的预测分数。有5名部分应答者（绿色）、13名稳定疾病患者（黑色）和1名进行性疾病患者（红色）。预测得分中位数，如，由图中的黄线表示。大多数患者被预测为敏感患者（高于黄线所示的临界值，人口中位数如)在这种剂量下表现出稳定的疾病，而在500mg剂量下则表现出部分反应().
预测对其他内分泌因子的反应
我们对21名新佐剂阿那曲唑治疗的小队列患者的fulvestran反应预测评分是否也能预测芳香化酶抑制反应进行了测试，新佐剂阿那曲唑的治疗方案与fulvestlant相似[5]预测对富尔维斯特的敏感性与对阿那曲唑的总体反应之间没有相关性。9名应答者的平均预测敏感性为52（95%CI 20-84）。7名无应答者的平均预测敏感性为51（95%可信区间4-97）。此外，预测分数与阿那曲唑治疗2周后Ki67的变化之间没有相关性（N=21，P=0.9）。
显示了富尔维斯特兰特、他莫昔芬和其他靶向ER的药物在同一NCI60细胞系面板上的体外作用的差异。对于fulvestrant，具有GI的细胞系50小于5µM被认为是敏感的。根据这个定义，有三种细胞系是敏感的，其中两种具有高表达的ER基因(ESR1系列). 然而，数据表明，其他因素也可能导致体外富尔维斯坦敏感性。通过对本研究中发现的抗性和敏感性决定基因的研究，可能会揭示这些问题。很明显富尔维斯特与他莫昔芬、雷洛昔芬和托瑞米芬的敏感性不同。事实上，富尔维斯特兰特的预测分数比另一个好在体外基于预测分数的500mg剂量富尔维斯特临床数据预测fulvestrant评分：P=0.010，tamoxifen评分：P=0.012，anastrozole评分：P=0.56，ER表达（ESR1基因）：P=0.10。三苯氧胺评分可以预测对富尔维斯特的反应这一事实并不奇怪，尽管它们在体外的表现有所不同()，这两种药物靶向相同的分子。
NCI60细胞系对靶向ER通路药物的敏感性（GI50）差异。对于每种药物和每种细胞系，相对于所有细胞系的平均GI50，GI50以对数标度上的条形显示（富尔维斯特63µM，他莫昔芬4.3µM、雷洛昔芬8.4µM和托雷米芬13µM）。平均值右侧的条表示高于平均值的灵敏度细胞系，而平均值左侧的条表示低于平均值的敏感性细胞系。ER表达用Affymetrix阵列在所有细胞系上测量，并以相对于平均表达的对数标度显示。MCF7和T-47D是众所周知的ER阳性细胞系。
讨论
我们在这里描述了一个基因表达预测评分，该评分来源于对用富尔维斯特治疗的培养细胞系的分析，当应用于临床组织时，富尔维斯特新佐剂治疗的乳腺癌患者的反应可能会增加。这就增加了制定前瞻性评分的可能性，该评分可以确定最有可能对富尔维斯特治疗产生反应的患者和最有可能产生耐药性的患者。这两组患者都有潜在的临床益处：基因表达评分定义的fulvestrant敏感患者在肿瘤缩小和PFS延长方面可能有更大的反应概率。预计对fulvestrant不敏感的患者可以不用进行治疗，这种治疗不太可能有效，并且可以改用其他可能更合适的治疗方案。
体外使用的fulvestrant浓度（10−8到10−4NCI60面板中的M，10−9到10−5乳腺癌细胞系中的M值）略高于患者血浆中的测量值（10−9到10−8M（M）[30]). 需要更高浓度才能达到可测量的效果，这并不罕见在体外在在体外化验。
图中显示的抗性基因可用于提出克服氟维司琼耐药性的方法。由于耐药基因主要通过PI3K信号转导途径发挥作用，靶向PI3K的药物应抑制对富尔司他丁耐药的细胞。这表明，将富尔维斯特与PI3K抑制剂药物联合使用可以进一步提高应答率。这是以前建议过的[31]并证明在体外
[32]PI3K抑制剂LY294002能够增强富尔维斯特的细胞抑制作用[33]其中AKT抑制剂AZD5363和fulvestrant联合治疗抑制MCF-7异种移植瘤生长的效果优于单独使用这两种药物。PI3K抑制剂和fulvestrant的联合应用目前正在进行临床试验[34]三项临床试验表明，在内分泌治疗中添加mTOR抑制剂依维莫司可提高ER阳性乳腺癌的缓解率或生存率[35]–[37].
尽管ESR1的表达较低，但有一个细胞系对富尔维斯特敏感，有两名患者对富尔维斯特治疗有反应，尽管ER H评分较低（0-1分，0-300分）。这表明fulvestrant可能触发内质网阴性细胞的凋亡，这已在体外内质网阳性细胞上得到证实[38]富维司琼诱导细胞凋亡的机制可以在对刺激作出反应的基因。其中，BCL-2和TNFRs以前被认为与富尔维斯特诱导的细胞凋亡有关[39].
应用于预测基因的生物相关过滤器具有去除假阳性相关基因的效果，但存在丢失重要通路（假阴性基因）的风险。在没有生物相关性过滤器的情况下，预测分数不再与患者反应显著相关（p=0.06），这就是为什么我们选择只信任那些通过生物相关性过滤器（biological relociation filter）的基因。
最近在ER阳性乳腺癌患者中发现ESR1突变，可以解释内分泌抵抗[40]–[41]。我们尚未对患者和细胞系中的ESR1基因进行测序。
本研究中用于测试临床前数据得分的临床样本量较小。因此，重要的是，当在接受fulvestrant治疗的更大队列患者的组织上进行测试时，尤其是当应用于晚期和复发性乳腺癌患者的肿瘤时，确定fulvestlan反应的基因表达评分是否会保持其预测力。在晚期和复发情况下，将预测分数与无进展生存率进行比较至关重要。确定从单个诊断原发性肿瘤样本和复发性转移性疾病活检中获得的预测分数之间的不一致程度仍然至关重要。最后，应使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本而不是新鲜肿瘤样本来测试和验证检测和量化此预测评分的能力，以最大限度地发挥此预测评分在未来的潜在临床效用。
资金筹措表
这项工作完全由阿斯利康和医学预测研究所资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定和手稿准备方面发挥了作用。
工具书类
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