公共科学图书馆一号。2014; 9（1）：e87120。
Glypican-3阳性免疫染色的发育不良结节：早期肝细胞癌的风险
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李功
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
Pin Ren公司
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
张文东
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
刘晓燕
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
韩秀娟
1第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹中德癌症研究实验室，中国西安
李瑶
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
朱绍军
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
苗岚
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
李彦宏
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
三中国西安第四军医大学唐都医院妇产科
张伟（音译）
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
费鲁西奥·博尼诺，编辑器
1中华人民共和国西安第四军医大学唐都医院病理科亥姆霍兹Sino-German癌症研究实验室
2中国西安第四军医大学唐都医院核医学系
三中国西安第四军医大学唐都医院妇产科
意大利比萨大学
#贡献均等。
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
构思和设计实验：LG WZ。执行实验：LG PR XYL ML。分析数据：LG。提供的试剂/材料/分析工具：LXW LY XJH SJZ。论文撰写人：LG WDZ YHL WZ。
2013年7月29日收到；2013年12月18日验收。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了适当的信任。
摘要
Glypican-3（GPC3）已被报道为HCC的一种新的血清和组织化学标记物。还描述了GPC3在肝脏癌前病变中的阳性或阴性，如增生异常结节（DN）。此外，我们以前的研究表明，肝硬化中的某些DN表现为单克隆增生，并证实了其肿瘤性质。然而，必须进行额外的研究，以进一步研究DN与GPC3阳性和HCC之间的关系。因此，我们首先通过免疫组织化学染色研究了136例HCC和103例小DN（直径小于1cm）中GPC3的表达，并利用X染色体失活嵌合体和雄激素受体（AR）基因多态性测定了女性患者81例DN的克隆性。然后我们在11个微卫星多态性位点检测了这些样本的染色体杂合性丢失（LOH）。结果表明，在136例HCC中103例（75.7%）和103例DN中19例（18.4%）检测到GPC3免疫反应，阳性率与HBsAg阳性相关。克隆性分析显示，15例女性患者的GPC3阳性DN为单克隆，其中12例为高级别DN（HGDN），66例GPC3阴性DN中28例（42.4%）为单克隆。此外，在19个GPC3阳性DN中，染色体LOH位于D6S1008（100%，19/19）、D8S262（52.6%，10/19）和D11S1301（57.9%，11/19）位点。然而，GPC3阴性DN的LOH频率在三个位点分别为5.95%（5/84）、23.8%（20/84）和4.76%（4/84）。因此，我们得出结论，GPC3阳性DN，特别是GPC3阳性HGDN，确实是HCC的晚期癌前病变。
介绍
肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是第三大癌症相关死亡原因[1]高达80%的肝癌发生在与乙型和丙型肝炎病毒感染相关的肝硬化中。不同的病变被认为代表人类肝脏的癌前病变。包括发育异常结节（DN）和发育异常病灶（DF），它们又分为大细胞改变（LCC）和小细胞改变（SCC）[2]，[3]这两种类型的病变是否代表真正的前体病变，以及哪种前体病变与肝癌的关系更密切，目前仍存在激烈的争论。越来越多的证据表明，在人类肝癌发生过程中，SCC代表着比LCC更为严重的前驱病变[4]与周围的肝硬化非发育异常肝细胞相比，这两种病变都含有较短的端粒，但只有SCC显示出检查点消除的高患病率。上述数据支持SCC在人类肝癌发生中的癌前状态。
DN包括低级增生异常结节（LGDN）和高级增生异常结节，是明显的结节性病变，与周围肝实质在大小、颜色和质地上不同。它们通常出现在肝硬化肝脏中，大多数直径约为1厘米。组织学上，与肝硬化结节相比，LGDN表现出轻微的细胞学异型性，细胞密度增加，且模式单调。可能找到LCC，但SCC不存在。HGDN总是表现出一定程度的细胞学和结构异型性，但不足以诊断恶性肿瘤。结节内常可见鳞状细胞癌，但也可检测到LCC。一些证据支持DNA的癌前性质[5].
关于Park描述的肝癌发生过程中癌前结节和肿瘤结节的发生[5]这些癌前病变逐渐发展为早期HCC，对应于原位癌或微侵袭癌；然后通过“结节中结节”型HCC阶段发展为进行性HCC。因此，我们建议对肝硬化高危人群进行监测，特别关注其遗传变化，有助于早期发现HCC，并可能降低其发病率和死亡率。
Glypican-3（GPC3）已被多组报道为HCC的一种新的血清和组织化学标记物[6]，[7]，[8]它是一种癌胚蛋白，在胎儿肝脏中大量表达。它在正常成人肝脏中也不活跃，作为HCC诊断的辅助物显示出巨大的前景。52.5%至85%的HCC中报告GPC3免疫阳性[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]同时，已报道DN的GPC3阳性[19]，[20]然而，尚不清楚一些GPC3阳性结节是否预示着肝癌及其分子遗传改变。
单克隆性是大多数肿瘤的主要特征。相反，正常组织和反应性增生是多克隆的。病变是肿瘤或反应性增生，可通过基于女性体细胞中磷酸甘油酸激酶（PGK）和雄激素受体（AR）基因座的X染色体失活嵌合体和多态性的克隆性分析来确定。在以往的研究中，我们曾检测过一些小DN（直径小于1cm）在肝硬化中的克隆性，结果表明，肝硬化组织中的部分LGDN和所有HGDN均为单克隆增生。HGDN伴SCC的发生是DN进展中的晚期事件，被认为是癌前形态学表型[21]这些观察结果进一步支持了DN是HCC癌前病变的论点。
为了进一步评估糖尿病肾病（DN）与GPC3免疫染色和肝癌的关系，我们研究了136例肝癌和103例糖尿病肾病（包括30例HGDN和73例LGDN）中GPC3的表达，并采用X染色体失活镶嵌和雄激素受体（AR）多态性检测了女性患者糖尿病肾病的克隆性并在11个微卫星位点观察了所有DN的染色体杂合性丢失（LOH）。
材料和方法
2.1、。道德声明
该研究方案由中国西安第四军医大学医学伦理委员会批准。我们获得了参与本研究的所有参与者的书面知情同意书。
2.2. 样品
2007年1月至2011年12月，从第四军医大学唐都医院（中国西安）收集了136例手术切除的HCC肝组织样本，其中128例有临床资料，8例无临床资料。每个病例由三名病理学家检查，并根据世界卫生组织国际肿瘤组织学分类进行诊断。根据Edmondson标准对HCC样本进行分级。所有样本均经手术切除，固定在10g/L中性福尔马林中，并包埋在石蜡中。连续切片用苏木精和伊红（H/E）染色。根据国际工作组的标准，对103例小DN（直径小于1厘米）进行了分类，其中81例来自女性，22例来自男性。具体而言，LGDN的形态特征与所谓再生结节的形态特征相同。它们通常表现出细胞密度轻度增加，呈现单调模式和/或克隆变化，由储存糖原的透明细胞和糖原缺失的双亲细胞组成。LGDN可能在细胞学上表现平淡，但不是坦率的建筑异型性。LCC常见于结节内外，为显微镜下的增生异常病灶。HGDN由储存糖原的透明细胞和嗜碱性细胞组成，细胞密度增加，具有一定程度的细胞学和结构异型性，但不足以诊断恶性肿瘤。结节内常可见鳞状细胞癌。
2.3. 免疫组织化学
将每个病例的代表性块的切片（4µm厚）脱蜡，在分级醇中再水化，用H培养2哦2阻断内源性过氧化物酶活性；然后在pH 6.0的0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液中微波加热20分钟，进行热诱导表位检索。然后在室温下将载玻片与GPC3特异性的初级单克隆抗体（稀释比例为1∶200，中国福州麦欣有限公司）孵育2小时。在与兔抗鼠二级抗体孵育后，使用无生物素的辣根过氧化物酶酶标聚合物进行后续反应，并使用EnVision plus检测系统进行可视化。使用染色剂3,3′-二氨基联苯胺（Dako），切片用苏木精复染。胎盘组织作为阳性对照。非特异性IgG用作阴性对照。
当在细胞质和/或膜中发现颗粒棕色反应时，认为GPC3染色阳性。因此，每个病例都由三名病理学家进行观察。具体而言，通过检查视野（放大倍数×200）半定量测定免疫反应性。使用（0–3+）标度，染色被描述为0染色（阴性）、1+染色（<10%的细胞）、2+染色（10%-25%的细胞）或3+染色（>25%细胞）。使用双尾Fisher精确检验或χ进行统计分析2使用Yates连续性校正进行测试。一个P（P）<0.05的值被认为具有统计学意义。
2.4. 激光显微切割和DNA提取
根据免疫组织化学染色结果，我们选择了相应的DN石蜡块，特别是GPC3阳性DN，然后制备了8个连续的10µm组织切片，然后放置在紫外线吸收膜上，用LMD6000进行激光显微切割（Leica Microsystems Ltd，Wetzlar，Germany）。HE染色后，将载玻片安装在显微镜上，用紫外激光通过机动光束扫描对选定的结节进行解剖。将解剖的组织（连同所附的标本）汇集到0.5毫升微离心管的盖子中，该管内充满40µL裂解液缓冲液和10µL蛋白酶K。将每个解剖的结节与周围相同大小的正常肝组织分离并分析，作为对照。将微型离心管置于水浴（48°C）中，以消化组织样本。消化12–20 h后，使用德国Qiagen blood&tissue Kit提取基因组DNA，并通过凝胶电泳（20 g/L琼脂糖）进行确认，然后在−20°C下保存直至使用。
2.5. 聚合酶链反应（PCR）扩增克隆性
如前所述，采用巢式聚合酶链反应（PCR）扩增AR基因座位外显子1中CAG短串联重复序列（STR）的长度多态性[22]从DN和周围正常肝组织中提取的AR基因基因组DNA各10µL，用5 U的哈哈I（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）在37°C下以20µL的体积放置3小时，其中含有2µL 10×反应缓冲液。然后对每个1µL的消化DNA样品进行巢式PCR。反应混合物的体积为50µL，含有4µL的10 mM dNTP（Gibco BRL，Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD，USA）、引物AR1A和AR1B（各20µM）、5µL 10×缓冲液、1.5µL 50 mM MgCl2和2.5U的Taq DNA聚合酶（Gibco BRL）。第一轮使用PT-200热循环仪（MJ Research，Inc.，Watertown，MA，USA）进行25次循环（94°C 40秒，56°C 50秒，72°C 1分钟）扩增。PCR产物（1µL）用作模板，使用引物AR2A和AR2B进行第二次PCR反应。放大程序与第一轮相同。最后，通过在2%琼脂糖凝胶上解析PCR反应等分样品来检查扩增效率。PCR产物（每个4 uL）也与相同体积的加载缓冲液（1 g/L二甲苯氰基，1 g/L溴酚蓝，甲酰胺）混合，并在含有8 mol/L尿素的8%聚丙烯酰胺凝胶上用Mini-VE系统（Amersham Biosciences，San Francisco，CA，USA）在120 V下溶解4 h。用银染色法观察条带。
2.6. PCR产物的分析与评价
记录PCR凝胶图像，并使用图像分析系统（LabWorks 3.0，UVP，Cambridge，UK）量化两个等位基因的PCR带强度。与不存在时获得的条带的强度相比，任一条带的荧光强度至少降低50%哈哈I消化被用作X染色体失活嵌合体缺失的指标[22]通过将同一样品在消解前后的上带强度与下带强度之比或反比除以，计算校正比（CR），得出CR值>1。在本研究中，CR值≥2用于定义X染色体失活嵌合体的丢失。
2.7. LOH分析
通过PCR扩增多态性微卫星标记，对DN和周围正常肝组织进行LOH分析。11个微卫星标记()根据我们之前的肝癌中发生频率高的LOH基因座数据选择。对于PCR扩增，对1µL DNA样本进行PCR。反应混合物的体积为50µL，含有1.25µL的10 mM dNTP（Gibco BRL，Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD，USA）、引物1A和1B（各20µM）、5µL的10×缓冲液和2.5U的Taq DNA聚合酶（Gibco-BRL）。使用PT-200热循环器（MJ Research，Inc.，Watertown，MA，USA）进行35个周期或25个周期的放大（95°C 40秒，60°C 50秒，72°C 1分钟）。
表1
本研究中使用的微卫星标记。
| 不。 | 基因座 | 标记 | 福沃德 | 反向 | PCR产品规模（bp） |
| 1 | 16季度23.3季度24.1 | D16S518型 |
GGCCTTTGGCAGTCA公司
|
ACCTTGCCTCCCACC公司
| 271–290 |
| 2 | 16季度23.3季度24.1 | D16S3049型 |
GCAATGAAGGCAACAAGT公司
|
TTAAAAGACCTGGGGAAT公司
| 233–255 |
| 三 | 16季度23.3季度24.1 | D16S3096型 |
关贸总协定
|
CCGTGATGTCTGAAC公司
| 173–219 |
| 4 | 16季度23.3季度24.1 | 第16页第3029页 |
共济会
|
CTTTCCTGAAATTGGAAGTGA公司
| 271–299 |
| 5 | 16季度23.3季度24.1 | D16S504型 |
AGCTTGTCAGGGAAACC公司
|
CAGGATGTAGGACGTAGG公司
| 149 |
| 6 | 16季度23.3季度24.1 | D16S684型 |
GGCAAAAAGCATTGG公司
|
TGGAATTTAGTGGCTTTCT公司
| 337 |
| 7 | 第6季度26 | D6S305型 |
CACCAGGTTAGACTGC公司
|
GCAAATGGAGCTGCACT公司
| 204–230 |
| 8 | 第6季度23至第25季度 | D6S1035型 |
ACTTGAATCCAGCATTCAG公司
|
AAAACTCAAGCTCAAAGGC公司
| 130–152 |
| 9 | 第6季度26 | D6S1008型 |
AAGAAAGACTAGAGAGAGACAAGC公司
|
ATCATTTGCCCATTTACAA公司
| 246–267 |
| 10 | 第11页，共13页 | D11S1301型 |
GGCAAAGAGTGAGACTCA公司
|
GTGTTCTTTAGTGTAGTTC
| 336 |
| 11 | 8p23.2页 | D8S262型 |
AGCTCAAAGCGAAGGTGAT公司
|
GGCAACAAGTGAGATCCTG公司
| 114–128 |
记录PCR凝胶图像，并使用图像分析系统（LabWorks 3.0，UVP，Cambridge，UK）量化两个等位基因的PCR带强度。
与正常组织中的相同等位基因相比，DN中的1个或多个等位基因的荧光强度降低50%或更大被认为是LOH的指标。使用带有Yates连续性校正的双尾Fisher精确检验进行统计分析。一个P（P）<0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
3.1. 肝癌的临床病理特征
有临床资料的128例患者中，男性108例，女性20例，男女比例为5.4∶1。肝硬化患者中男性82例（75.9%），女性17例（85%）。肝癌患者的年龄为27至84岁（平均52岁）。不幸的是，除了年龄、性别和HCC分级外，128名患者中有26名没有其他信息。在61.76%（63/102）和5.88%（6/102）的患者血清中分别检测到乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和丙型肝炎病毒（HCV）。56.86%（58/102）的患者血清甲胎蛋白（AFP）水平升高，值为21.51–35350 ng/mL。组织病理学检查，10.94%（14/128）HCC为高分化，60.93%（78/128）为中分化，28.13%（36/128）分化不良().
表2
肝细胞癌患者glypican-3（GPC3）表达与临床特征的关系。
| Wk13374861变量 | GPC3-阳性 | GPC3-阴性 | χ2
|
P（P）
|
| 年龄（岁） | | | | |
| ≤52（n=68） | 51 | 17 | 0.046 | 0.842 |
| >52（n=60） | 44 | 16 | | |
| 性别 | | | | |
| 男性（n=108） | 81 | 27 | 0.22 | 0.781 |
| 女性（n=20） | 14 | 6 | | |
| 法新社 | | | | |
| ≥20纳克/毫升（n=58） | 46 | 12 | 0.061 | 0.813 |
| <20纳克/毫升（n=44） | 34 | 10 | | |
| HBsAg或HCV | | | | |
| +（n=69） | 62 | 7 | 16.453 | 0 |
| −（n=33） | 18 | 15 | | |
| 肝癌分化 | | | | |
| 一级（n=14） | 8 | 6 | 2.443 | 0.295 |
| 二级（n=78） | 60 | 18 | | |
| 三级（n=36） | 27 | 9 | | |
| 肿瘤大小 | | | | |
| ≥5厘米（n=47） | 37 | 10 | 0.004 | 0.947 |
| <5厘米（n=55） | 43 | 12 | | |
| 肝外转移 | | | | |
| 存在（n=32） | 25 | 7 | 0.003 | 0.959 |
| 缺席（n=70） | 55 | 15 | | |
3.2. 肝癌和糖尿病肾病中GPC3的表达
我们检测了136例HCC中GPC3的表达，发现103例（75.7%）GPC3染色阳性。反应量分级为1+（<10%细胞）13例（12.62%），2+（10%-25%细胞）22例（21.36%），3+（>25%细胞）68例（66.02%）。接下来，我们评估了GPC3的表达与临床病理特征的关系，如年龄、性别、AFP水平、血清中HBsAg或HCV、HCC分化、肿瘤大小和转移。GPC3表达与HBsAg阳性密切相关(P（P）<0.05). 尽管GPC3在中分化和低分化肝癌中的表达高于高分化肝癌，但这种表达差异在统计学上并不显著(P（P） = 0.295). 同样，有或无肝外转移的HCC中GPC3表达的差异也没有达到统计学意义(P（P） = 0.959) (). 此外，我们在肝癌GPC3阳性中发现了3种不同的免疫染色模式：以细胞质为主（图1A），以膜为主（图1C、D），以及膜和细胞质兼有（图1B）。然而，这3种不同的染色模式似乎与肝癌的分化状态、年龄和性别无关。
肝癌组织中GPC3免疫组化染色。（图A×200、B×200、C×200、D×400）。A） 弱阳性；B、 C和D）强阳性。
103例DN进行GPC3染色，包括30例HGDN和73例LGDN。结果显示19例DN阳性（18.4%），其中15例为HGDN，4例为LGDN(). HGDN（15/30，50%）明显高于LGDN（4/73，5.48%），差异有统计学意义（P<0.05）(，). 反应量分级为1+（<10%细胞）4例（21.05%），2+（10%-25%细胞）10例（52.63%），3+（>25%细胞）5例（26.32%）。此外，我们注意到在DN中有两种类型的GPC3表达。在某些DN中，只有几个肝细胞GPC3阳性（图2），但在另一个DN中，整个结节GPC3呈阳性（图3）。糖尿病肾病GPC3的阳性免疫染色模式与肝癌相似。也就是说，GPC3的阳性反应主要在膜（图3A、3B、3C和3F）或细胞质（图3D和3E）中。
表3
本研究纳入20名女性和9名男性患者的临床信息及其肝脏病变的病理特征。
| 案例（否） | 年龄 | 乙型肝炎表面抗原 | 甲胎蛋白（微克/升） | 病理诊断和HCC分级 | DN数量（HGDN） | 单克隆病变数（GPC3阳性DN） |
| 01 | 59 | + | 350 | HCC III，肝硬化 | 4 (1) | 1 |
| 02 | 64 | + | 68.25 | HCC II，肝硬化 | 4 (1) | 1 |
| 03 | 42 | + | 236.3 | HCC III，肝硬化 | 6 (2) | 3 (2) |
| 04 | 79 | + | 1730 | HCC II-III，肝硬化 | 8 (3) | 5 (2) |
| 05 | 57 | + | 28.45 | HCC II，肝硬化 | 三 | 1 |
| 06 | 50 | + | 124 | HCC I，肝硬化 | 4 (1) | 2 |
| 07 | 51 | + | 44.51 | 肝癌I-II，肝硬化 | 6 (2) | 3 (1) |
| 08 | 33 | − | 48377 | 肝癌II-III | 0 | |
| 09 | 56 | + | 22.99 | HCC II，肝硬化 | 5 (1) | 3 (1) |
| 10 | 59 | + | 11746 | HCC II，肝硬化 | 10 (4) | 6 (3) |
| 11 | 57 | + | 496.1 | HCC II，肝硬化 | 4 (1) | 三 |
| 12 | 48 | − | 1429 | 肝癌III | 0 | |
| 13 | 54 | + | 28.50 | HCC II-III，肝硬化 | 4 | 2 (2) |
| 14 | 39 | + | 23631 | HCC II，肝硬化 | 8 (4) | 6 (2) |
| 15 | 41 | + | 34.48 | 肝癌I-II，肝硬化 | 三 | 1 (1) |
| 16 | 32 | + | 53109 | HCC II，肝硬化 | 3 (1) | 1 |
| 17 | 76 | − | 18.6 | 肝癌二期 | 0 | |
| 18 | 40 | + | 65.99 | HCC II-III，肝硬化 | 6 (2) | 4 (1) |
| 19 | 39 | + | 505.3 | 肝癌II-III | 0 | |
| 20 | 49 | − | 17.5 | HCC II-III，肝硬化 | 3 (1) | 1 |
| 21 | 38 | − | 350 | HCC II，肝硬化 | 2 | |
| 22 | 58 | + | 35350 | HCC II，肝硬化 | 3 (1) | （1） |
| 23 | 63 | + | 104.61 | HCC II，肝硬化 | 3 (1) | (0) |
| 24 | 49 | + | 7.37 | HCC I，肝硬化 | 2 (1) | （1） |
| 25 | 35 | + | 4761 | HCC III，肝硬化 | 2 (2) | （2） |
| 26 | 34 | + | 350 | HCC III，肝硬化 | 2 (1) | |
| 27 | 44 | + | 2344 | HCC II，肝硬化 | 三 | |
| 28 | 68 | + | 157 | HCC III，肝硬化 | 三 | |
| 29 | 71 | − | 7.95 | HCC I，肝硬化 | 2 | |
表4
具有GPC3和克隆性的女性81例DN的详细信息。
| | LGDN（n=57） | HGDN（n=24） |
| | GPC3类 | GPC3类 |
| | 积极的 | 消极的 | 积极的 | 消极的 |
|
单克隆
| 积极的 | 三 | 16 | 12 | 12 |
| 消极的 | 0 | 38 | 0 | 0 |
表5
GPC3在22例男性DN中的表达情况。
| | LGDN（n=16） | HGDN（n=6） |
|
GPC3类
| 积极的 | 0 | 4 |
| 消极的 | 16 | 2 |
几种不同DN中GPC3的弱和局部免疫组织化学染色。（A×400；B×400；C×400；D×400）。
3.3. GPC3在肝癌及其邻近DN中的表达
在同一患者中，我们发现GPC3在HCC中的表达与相邻DN一致。换言之，如果在DN中也检测到GPC3，则在相邻的HCC中也检测出GPC3（图2和图3）。相反，如果肝癌阳性，则无需在邻近DN中表达GPC3。因此，我们认为GPC3阳性DN与HCC密切相关。
五种不同DN中GPC3的广泛免疫组化染色。（A×400；B×400；C×400；D×400；E×400；F×400）。
3.4. DN克隆性测定
克隆性分析用于检测AR基因座81例女性DN的性质。在这些样本中，15个GPC3阳性DN（包括12个HGDN和3个LGDN）和28个（12个HGTN和16个LGDN哈哈我(和). 换句话说，所有HGDN（100%，24/24）和33.3%（19/57）LGDN均为单克隆。结果进一步证实了我们之前的观察结果[21].AR PCR凝胶图片显示，从组织中获得的DNA样本哈哈我消化产生两条带。当从具有GPC3阳性反应性的DN中提取的DNA样品用哈哈一、 两条带中有一条消失，表明肿瘤增生。然而，周围的正常肝组织被哈哈我仍然显示了两条强度相等的谱带（图4）。此外，我们发现3例GPC3阳性的单克隆增生LGDN来自两名无HGDN的患者（病例13和病例15，). 此外，3个GPC3阳性LGDN位于邻近肝癌。这表明部分GPC3阳性LGDN可能直接进展为HCC。
克隆性分析显示，当DN被消化后，一条带消失哈哈I、 但当周围的肝组织用赫哈一、。N、 周围肝组织；N01-N03，3 GPC3阳性染色DN；−，没有哈哈我消化；+，具有哈哈我消化。
3.5. LOH分析
LOH在D8S262、D11S1301和D6S1008位点检测到，但在其他微卫星标记中未检测到。在19个GPC3阳性DN中，染色体LOH位于D8S262（52.6%，10/19）、D11S1301（57.9%，11/19）和D6S1008（100%，19/19）位点(，). 然而，在上述三个位点中，GPC3阴性DN的LOH频率分别为23.8%（20/84）、4.76%（4/84）和5.95%（5/84）。也就是说，Fisher精确检验表明，在上述三个位点上，GPC3阳性DN与GPC3阴性DN的LOH频率差异较大(). 此外，这种差异也具有统计学意义（P<0.05）。此外，在任何位点出现染色体LOH时，HGDN的比率都高于LGDN。这表明HGDN与其邻近肝癌之间存在密切关系。
D8S262（A）、D11S1301（B）和D6S1008（C）处的LOH分析结果：A） 单克隆GPC3阳性DN的一条或两条带消失。这些条带存在于正常肝组织中。N1-N8，正常肝组织；N01-N08，8种不同的单克隆GPC3阳性DN。
表6
GPC3阳性和GPC3阴性DN在三个位点的LOH频率。
| DN（公称直径） | n个 | D8S262型 | D11S1301型 | D6S1008型 |
| | %（HGDN+LGDN）/n | %（HGDN+LGDN）/n | %（HGDN+LGDN）/n |
|
GPC3-阳性DN
| 19 | 52.6% (10+0)/19 | 57.9% (11+0)/19 | 100% (15+4)/19 |
|
GPC3-负DN
| 84 | 23.8% (14+6)/84 | 4.76% (4+0)/84 | 5.95% (5+0)/84 |
| 方形 | | 6.236 | 35.158 | 76.688 |
|
P（P）
| | 0.013 | <0.001* | <0.001* |
讨论
Glypican-3（GPC3）是一种癌胚抗原，是膜结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Glypican家族的成员。它在特定组织中细胞增殖和凋亡的发展和调节中发挥作用[23]，[24]该基因在胎儿肝脏和祖细胞中表达，在许多肝癌和其他组织中也表达。最近，一些研究表明，GPC3在大多数HCC中呈阳性，52.5%至85%的HCC中检测到阳性免疫染色，但在健康肝脏或各种良性肝脏病变中，包括肝硬化、肝细胞腺瘤和局灶性结节增生中未检测到阳性。这种表达模式表明GPC3作为HCC的诊断标志物具有很大的前景[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]在我们的研究中，136例HCC患者中有103例（75.7%）检测到GPC3免疫反应，GPC3表达与HBsAg阳性密切相关，但与性别、HCC分化程度、年龄、血清AFP水平、肿瘤大小和肝外转移无关。肝细胞癌中GPC3的高表达与以前的研究相似[9]，[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，进一步支持GPC3对肝癌的诊断价值。然而，一些作者已经证实良性肝结节呈阳性染色，范围从零到零[25]至HGDN的7%至22%[6]，[10]，[26]，[27]达到HGDN的75%和LGDN的25%[19]其他报告也发现良性肝硬化结节有不同程度的阳性，尽管染色通常被描述为弱和局灶性[19]此外，一些作者认为，在大多数病例中，从癌前病变向小肝癌的转变与GPC3表达的急剧增加有关。同时，无论GPC3阳性细胞的百分比如何，肝硬化中GPC3小范围阳性的发生都表明强烈的HCC[10]因此，GPC3阳性肝结节可能对监测HCC的发生和早期诊断具有重要价值。
与其他癌症一样，肝癌也具有明显的多阶段肿瘤进展过程的特征[5]，[28]，[29]基于组织病理学和分子研究。HCC最多发生在由乙型和丙型肝炎感染引起的肝硬化中。慢性病肝脏，尤其是肝硬化也会出现称为DF和DN的癌前病变。因此，研究GPC3在癌前病变中的表达，GPC3阳性结节与肝癌的关系，以及GPC3阴性结节与肝癌之间是否存在遗传联系，具有重要的临床意义。
单克隆性是大多数肿瘤的一个重要特征。在我们之前的研究中，我们对9例女性肝硬化患者的93个结节性病变进行了显微解剖，观察了其组织病理学特征，并检查了其克隆状态。结果显示，在3个大再生结节和12个HGDN中检测到X染色体失活嵌合体丢失，表明它们具有肿瘤性质。在60个LGDN中，29个（48.3%）为单克隆，4个透明细胞病灶和14个再生结节为多克隆。因此，我们得出结论，HBV相关性肝硬化中的某些DN，尤其是HGDN，已经是肿瘤性病变。HGDN伴SCC是DN进展中的晚期事件，提示存在癌前表型[21]在本研究中，我们首先发现103例DN中有19例（18.4%）对GPC3阳性，其中15例（50%，15/30）为HGDN，4例（5.48%，4/73）为LGDN。GPC3的HGDN表达率明显高于LGDN表达率。结果与文献报道的结果相似。因此，肝癌中GPC3的表达与同一患者的相邻DN一致。换言之，如果在DN中也检测到GPC3，则在相邻的HCC中也检测出GPC3。相反，如果GPC3对HCC呈阳性，则无需在邻近DN中表达GPC3。因此，我们得出结论，GPC3阳性DN，特别是GPC3阳性HGDN，与HCC密切相关。其次，我们发现所有15例GPC3阳性DN和28例GPC3-阴性DN均为单克隆。此外，来自雌性的所有24个HGDN都是单克隆的，无论它们是否表达GPC3。这些结果进一步支持了肝硬化肝组织中GPC3阳性DN与HCC之间的密切关系，尽管使用GPC3筛查癌前肝病变仍存在争议[13]，[26]，[30]至少我们可以认为GPC3阳性的DN，尤其是HGDN，是HCC的晚期癌前病变，从而有可能监测HCC的发生。当然，必须进行额外的研究，以研究GPC3在肝硬化转化为肝癌过程中的潜在作用。此外，我们发现3例GPC3阳性的单克隆增生LGDN来自2例无HGDN的患者。此外，3个GPC3阳性的LGDN位于邻近的HCC中。这表明部分GPC3阳性LGDN可能直接进展为HCC。有趣的是，我们观察到在一些LGDN中只有几个细胞的GPC3阳性。然而，克隆试验表明，这些DN也是单克隆的。最可能的解释是，这些GPC3阳性细胞是在肝癌发生过程中最终转化为HCC的细胞。当然，还需要进一步的研究来确定GPC3在非肿瘤性肝病中的发病机制、意义和其他潜在的诊断用途。
当然，基于X染色体失活嵌合体和AR基因多态性的克隆分析在本研究中有其局限性。具体来说，它只能用于分析女性个体的样本。分子遗传学研究表明，恶性肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。TSG失活的一种重要形式是一个等位基因的突变和其他等位基因杂合性（LOH）的丢失。为了进一步扩大我们的分析并进一步证实我们的结论，我们选择了11个微卫星标记来评估81例女性DN和22例男性DN的染色体LOH。结果表明，在D6S1008、D8S262和D11S1301位点分别检测到高频率的LOH。此外，在任何位点，GPC3阳性DN的LOH频率都显著高于GPC3阴性DN。这表明这些GPC3阳性DN发生了遗传改变，进一步支持了它们代表了肝癌的癌前病变。此外，在任何位点出现染色体LOH时，HGDN的比率都高于LGDN。这表明HGDN与其邻近肝癌之间存在密切关系。因此，我们认为GPC3阳性DN，尤其是GPC3阴性HGDN，可能被认为是肝癌早期诊断和检测的生物标志物。此外，邻近D6S1008、D8S262和D11S1301的抑癌基因可能与早期HCC的发生有关。
总之，我们得出结论，GPC3阳性DN，尤其是GPC3阴性HGDN，确实是HCC的晚期癌前病变。
致谢
作者感谢德国海德堡德国癌症研究中心细胞和分子病理学系的Bannasch Peter教授对手稿提出的建议。
资金筹措表
本研究得到了国家自然科学基金（No.30800417；30672013；81372226）、国家基础研究计划（973计划）（No.2009CB521705）和陕西省创新项目协同负责人（No.2011KTCL03-11）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。
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