基因本体论与病原体基因组注释：以白色念珠菌

摘要

简介白色念珠菌，一种在当今越来越重要的病原体

白色念珠菌是人类真菌病原体中研究得最好的一种，是人类的常见共生菌，在其他健康人群中引起粘膜感染，如阴道炎或口腔鹅口疮。然而，系统念珠菌感染是严重疾病或免疫功能受损患者的严重威胁，包括低出生体重儿、移植受体、化疗患者、烧伤患者和HIV感染患者[1,2]. 此外，白色念珠菌可以很容易地定植导管和其他医疗设备，在那里形成生物膜，比浮游（单个自由漂浮）细胞对药物治疗更具抵抗力[三,4]. 基于这些原因，白色念珠菌已成为医院血流感染的第三或第四常见原因，以及全身性感染的死亡率念珠菌感染率很高[5,6]. 新出现的对现有抗真菌药物库的耐药性也越来越令人担忧，目前在HIV阳性患者的分离株中普遍存在唑类耐药性[7]. 此外，其他真菌物种正在成为越来越普遍和令人担忧的病原体[8]. 因此，需要新的更有效的策略来对抗这些感染，以及由其他真菌病原体引起的感染白色念珠菌可以作为一个模型，推动了最近的研究，旨在阐明白色念珠菌毒力。基因组规模的实验是强有力的工具，可以在分子水平上提供对发病机制和其他过程的见解，但这需要一个注释良好的基因目录。基因本体（GO）词汇表是一个为此目的而特别有用的分类系统（参见：http://www.geneontology.org).

基因本体论简介

GO由三个层次控制词汇表和一组证据代码组成。这三个词汇表包含描述基因产物在细胞内的位置（细胞成分）、它所执行的活动（分子功能）以及它所履行的更广泛的作用（生物过程）的术语。每个术语都与层次树中位于其上方的不太具体的“父术语”以及它所包含的更具体的“子”术语相关。证据代码描述了用于对基因产品进行每个GO注释的推理类型，因此，表明了置信水平。根据可用的数据，基因产品可以用三个词汇表中任意数量的术语进行注释。对特定术语的直接注释也意味着对该术语派生的所有术语的间接注释。例如，被注释为细胞成分术语“线粒体内膜”的蛋白质也被隐式注释为“线粒体膜”和“线粒体”，这是细胞成分词汇中更通用的“线粒体内壁”亲本术语。

白色念珠菌生物学和致病策略

遗传多样性对于宿主在多样且往往充满敌意的环境中的适应和生存至关重要。白色念珠菌通常以二倍体或近二倍体状态存在，从未观察到减数分裂。然而，在类交配型（MTL）位点纯合的二倍体可以在一个严格调控的过程中交配形成四倍体，这需要从非交配的“白色”细胞类型形态转换为交配竞争的“不透明”细胞类型[9-12] (图1a). 遗传重组发生在产生的四倍体中，四倍体随后脱落染色体，在一个称为副性周期的过程中恢复二倍体[13,14]. 导致遗传多样性的另一个机制是非整倍体和总染色体重排的频繁发生（例如等染色体形成，在此过程中，一条染色体臂重复，另一条臂丢失）白色念珠菌表现出非凡的忍耐力。这些事件可以在耐药性和特定营养素代谢能力方面赋予选择性优势[15-17].

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图1

生命周期和形态白色念珠菌.（a）白色念珠菌准性周期。在交配型位点（MTL）处成为纯合（'a/a'或'α/α'）的二倍体酵母样细胞可能经历从“白色”到交配竞争性“不透明”细胞的表型转换。相反交配类型的不透明细胞的交配产生一个四倍体的“aa/αα”细胞，该细胞恢复到二倍体状态通过染色体丢失。（b）不同形状的白色念珠菌.根据环境条件，白色念珠菌可以以不同的形态生长：圆形的、出芽的酵母样细胞容易彼此分离，而细长的、形成丝状的真菌丝和假菌丝细胞仍然附着；细胞之间的收缩是假菌丝的一个显著特征。图改编自参考[36].

白色念珠菌以几种形态生长，包括：（i）一种芽殖酵母形态，可以从光滑的白色阶段转换为粗糙的、具有交配能力的不透明阶段，（ii）假菌丝，和（iii）具有真正菌丝形态的纤丝(图1b) [18,19]. 形态转换能力对其致病性至关重要，因为不同的生长形式在宿主遇到的不同生态位中表现出不同的成功率[20,21]. 酵母菌形态的细胞更容易在血液中扩散，而菌丝具有粘附性和机械特性，可以穿透宿主细胞膜[22,23]. 宿主巨噬细胞吞噬酵母样细胞会对其中的低血糖条件产生应激反应，并触发菌丝生长的转变，这有助于身体逃离这种不利环境[24]以及其他基因表达的变化，这些变化可能会影响巨噬细胞的特性，从而使病原体受益[25]. 白细胞和乳白色细胞适合在不同的小生境中生长，在大多数研究条件下，不透白细胞的转换是一种罕见的现象。然而，这种转换在哺乳动物胃肠道的WO-1菌株中被强烈诱导，尽管其他测试菌株没有表现出这种诱导，表明在控制这种反应方面存在遗传变异[20].

在被称为生物膜的多细胞群落中生长的能力是白色念珠菌致病性，使其能够在导管和其他医疗设备以及假牙上生长。与浮游细胞相比，生物膜中的细胞对药物表现出显著的耐药性，这使患者的治疗更加复杂[4,26-28]. 生物膜的形成取决于细胞间通信的方式，以及白色念珠菌显示对细胞密度的信号反应（群体感应），调节生长并可能促进其在宿主中的存活[29,30].

耐药性的获得是白色念珠菌临床环境中的毒力。它可以通过多种机制，包括药物外排转运体（例如Cdr1p、Cdr2p和Mdr1p）的调节，容易产生抗真菌药物治疗的耐药性[31])药物靶点突变（例如Erg11p、羊毛甾醇14-α-脱甲基酶、唑类抗真菌药物靶点[32])，调节因子突变（例如，Tac1p，药物外排的转录调节因子[15])和染色体重排[15,17,33].

白色念珠菌在“基因组时代”

的基因组序列白色念珠菌SC5314菌株于2004年发表，是一个由266个相邻片段组成的单倍体参考基因组组合[34]. 随后，以这些连续体为起点，构建了染色体水平的组装[35]. 序列的公布是进入基因组时代的跳板[36,37]，并为其开发了大量基因组资源念珠菌[38,39]其中一些已广泛提供给研究界（例如，CandidaDB：http://genodb.pasteur.fr/cgi-bin/WebObjects/CandidaDB，广泛真菌基因组计划：http://www.broad.mit.edu/node/304桑格研究所：http://www.sanger.ac.uk/Projects/Fungi/，基因水平：http://www.genolevures.org/yeastgenomes.html; 另请参见http://www.candidagenome.org/CommunityNews.shtml). 相关致病性和非致病性真菌基因组序列的最新可用性使得可以使用比较基因组学方法来完善ORF目录和基因注释，以及检查致病性真菌中已扩展的基因家族。

基因组规模的实验方法（如微阵列）现在可用于研究念珠菌发病机制可以生成大量数据，包括感兴趣的基因的长列表，这对理解结果提出了重大挑战。因此，基因产品的注释必须一致，不仅包括生物体内的所有基因产品，还包括其他（通常密切相关）生物体内的类似基因产品。有了这样的注释，来自许多生物体的实验数据可以被用来对这些大规模数据集进行更全面的分析，并提供超越简单现象学描述的生物学相关性。满足此标准的基因产品组织和分类的最全面、使用最广泛的系统是基因本体（GO）[40].

基因本体念珠菌基因组数据库

GO注释提供了基因产品最显著特征的概览。应用于大型基因集的注释时，GO充当一个句柄，可以快速检索共享功能或角色的基因列表，或者其产品位于共同的细胞位置。例如，在念珠菌基因组数据库（CGD，http://www.candidagenome.org/[41])从本体论的生物过程分支检索GO术语“致病”，因为“毒力”是GO中“致病”的同义词。CGD的GO术语页面显示了该术语在层次结构中的位置的图形视图，包括其父母和子女术语（如果它有子女），还列出了所有直接用该术语注释的基因，以及相应的证据代码、信息来源的参考文献，以及指向每个“位置摘要”页面的链接。GO术语页面示例如所示图2.

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图2

CGD网站生物过程术语“菌丝生长”的GO术语页面示例(http://www.candidagenome.org/cgi-bin/GO/GO.pl？goid=30448（见2009年1月13日）。该页面显示术语的定义，并以图形显示其在层次结构中的位置。该页面还包含一个表，该表显示了各种摘要类别中的注释数，包括通过高通量和基于计算的实验生成的注释。页面底部显示了所有注释基因的列表，以及参考和证据代码。AmiGO是一个基于web的搜索和浏览GO的工具，由基因本体联盟提供，可在http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go.cgi证据代码IMP表明注释为“从突变表型推断”

生物基因目录的注释越全面，就越容易发现在大规模研究中表现出共同特性的基因组的模式和生物相关性。GO注释提供的简明、结构化和标准化描述极大地促进了对感兴趣的基因产物列表的计算分析。例如，一份由几十个基因组成的清单，这些基因在微阵列实验中被确定为共同调控，或其产物是共同定位的，可能包括具有看似不同角色的基因，或具有完全未知的角色的基因。对这组基因的GO注释的分析可能揭示了特定生物过程的显著丰富，因此可以通过暗示未经特征化的基因产物也可能参与一个或多个丰富过程来生成可测试的假设。已经创建了许多工具，以便于根据分配给基因的GO术语（例如GO:：TermFinder）对基因列表进行分组和统计分析[42]; GO苗条映射器，http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/GO/goSlimMapper.pl; 以及许多其他列在http://www.geneontology.org/GO.tools.shtml网站).

CGD处的手动GO注释

在CGD，GO注释白色念珠菌基因产物由CGD馆长从科学文献中手动提取，并添加到数据库中，为每个注释使用适当的证据代码和参考。科学文献通常不表示特定的GO术语；相反，馆长使用出版物中的实验数据来确定适当的GO术语，以用于注释基因产品。因此，手工管理需要生物学专业知识、GO本身的工作知识以及一套管理标准的一致应用。截至2009年4月，CGD包括5860份手工管理的GO注释，这些注释是从1176份不同的公开参考文献中收集的。

GO的早期发展集中在大体上无致病性的模式生物上，例如酿酒酵母和黑腹果蝇从2004年开始，一组研究人员成立了一个名为植物相关微生物基因本体论小组（PAMGO）的兴趣小组，以改善GO中与微生物和宿主之间的相互作用有关的部分，这些相互作用可能对伴侣生物中的任何一个都是有益的、中性的或有害的(http://pamgo.vbi.vt.edu/[43,44]). GO的这些改进在白色念珠菌基因。例如，在CGD中，目前有200多个基因被注释为术语“共生，包括通过寄生实现的互惠”及其在PAMGO合作者开发的生物过程本体论分支中的子术语。

这个白色念珠菌基因目录包含许多与致病性有关的基因家族，例如与宿主细胞粘附有关的凝集素样序列（ALS）基因，以及编码铁还原酶、分泌型天冬氨酸蛋白酶和分泌型脂肪酶的基因[45-48]. 这些基因家族的扩张可能是由于进化压力的驱使，进化压力使负责执行对宿主生存重要功能的基因多样化。例如，宿主生物严格限制任何病原体可利用的铁的数量，以此作为抵抗感染的先天防御策略[49]. 微生物铁还原酶是铁获取途径的重要组成部分，在宿主的铁盐环境中对生存至关重要[50]. 作为病原体和宿主之间这种进化军备竞赛的一个明显结果，已经观察到白色念珠菌与非致病性表亲相比，该基因组包含铁还原酶基因的扩增互补物，酿酒酵母[48]. 截至2009年1月，共有15个基因被证实或预测编码铁还原酶白色念珠菌，但只有8英寸酿酒酵母（参见http://www.candidagenome.org/cgi-bin/GO/GO.pl？goid=293和http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/GO/goTerm.pl？goid=293）。这15个白色念珠菌基因，只有两个通过直接实验获得功能特征[51-53]; 其余的基因功能已经通过基于相似性的计算方法推断出来，对这些预测的实验跟踪是在实验室进行进一步研究的机会。例如，已注意到基因orf19.7077与铁还原酶基因的相似性，但该基因的实际功能和作用尚未实验探索(http://www.candidagenome.org/cgi-bin/locise.pl？locise=orf19.7077，2009年4月6日访问）。

这些家族中基因的特征表明，单个家族成员可以扮演特殊角色，不同的家族成员在不同条件下表现出不同的表达调控[54]. 例如，由ALS基因编码的细胞表面糖蛋白家族的个别成员优先介导对不同范围的宿主细胞和细胞外基质底物的粘附，甚至观察到一对等位基因的产物也显示出与宿主细胞的差异关联，通过差异调节或蛋白质序列[55].

然而，总的来说，并不是所有这些重要基因家族的成员都经过了实验表征，因此，通常从家族成员中推断，所有密切相关的成员都具有相同的功能和作用。（目前，我们仅在科学文献中发表这些推论时才进行策划；我们不进行推论从头开始。未来，我们计划结合基于特征蛋白质结构域的预测。）GO注释提供了一种简洁的方式来表达这种推断，方法是指定一个表示共同功能的共享项，然后使用GO证据码来清楚地表明推理是基于实验表征还是序列相似性。然而，基于家族成员关系的这些预测应被视为关于基因家族中相对未特征化基因产物的可测试假设，因为序列相似性并不能保证相同的行为；事实上，家庭成员表现出差异的情况在生物学上很有趣，并且与白色念珠菌'发病机制。

GO术语转移自酿酒酵母到白色念珠菌

因为GO赋值是注释基因组中基因的一个非常有用的“句柄”，并且因为只有白色念珠菌基因已经被直接表征，预测未表征或表征较少的基因的功能是有利的，也是必要的。可以使用GO注释结合一组传递性术语分配标准进行预测，并使用适当的证据代码为CGD用户社区提供如何进行这些分配的一目了然的指示。

缺乏减数分裂周期、单倍体阶段和稳定的低拷贝外显子白色念珠菌使进行基因筛查和表型分析比酿酒酵母.直接实验表征白色念珠菌因此，基因产物主要集中在与毒力相关的特性领域，如形态转换、感染性和耐药性。相反，酿酒酵母可能是最具特征的模式生物，对许多不太可能直接在白色念珠菌。此外酿酒酵母基因组及其科学文献的管理多年来一直由酵母菌属基因组数据库（SGD）；事实上，SGD的基因本体管理被认为是该领域的“金标准”，90%的已知酿酒酵母基因产品至少有一个手动指定的GO注释（不包括“未知”术语的注释）。因此，通过物种间GO术语从酿酒酵母，以圆整白色念珠菌基因目录（参见图3).

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图3

的比较白色念珠菌和酿酒酵母基因组注释。如果有功能基因产品的实验证据，ORF被归类为“已验证”基于序列分析预测未表征的ORF，但目前缺乏实验表征。标记为“可疑”的ORF没有实验特征，与随机非编码序列似乎无法区分。

为了在CGD中进行传递注释，我们首先确定了白色念珠菌和酿酒酵母使用InParanoid算法的基因，该算法可识别物种间相互最佳BLAST命中[56]. 从转移的候选GO注释酿酒酵母到白色念珠菌只有那些在SGD中有实验证据，证据代码为直接分析推断（IDA）、物理交互推断（IPI）、遗传交互推断（IGI）或突变表型推断（IMP）的人，因为这些被认为是最可靠的注释。在中推断出的任何批注酿酒酵母为了避免传播预测，基于序列相似性或其他算法，都被排除在该组之外。从这个候选集酿酒酵母删除了注释，这些注释要么与CGD中现有的手动管理的GO注释冗余，要么与其他待传输的SGD注释冗余。例如，如果“激酶活性”和“蛋白激酶活性”的注释是特定基因产品转移的候选注释，则只转移“蛋白激酶活动”的更具体注释，因为不太具体的注释（“激酶活动”）可以从其子术语（“蛋白激酶活性”）的注释中推断。通过该程序传输到CGD的所有注释都被赋予了证据代码IEA（从电子注释推断），因此被确定为是通过计算得出的。2008年4月，共有11191个新注释被转移，影响了3113个基因。CGD中GO注释的概述，突出显示从酿酒酵母SGD的注释，如所示图4。此过程定期重复，以利用SGD的新GO注释，以便白色念珠菌研究人员可以继续从这种传递性转移中获得最大利益。

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图4

GO术语转移至的统计白色念珠菌基于酿酒酵母注释。红色条表示白色念珠菌CGD中的基因通过转移来自同源特征的注释注释到选定的GO术语（直接注释到每个术语本身，或注释到其更具体的子术语之一）酿酒酵母SGD基因。蓝色条表示根据已发表的文献在CGD上注释的基因。

这种传递性注释的方法并非没有内在的偏见。首先，重要的是要考虑到可用于转移的注释库将显示出对术语转移起始的有机体的依赖性，并且在任何给定的模型有机体中典型研究的过程类型将影响任何一组转移术语的全面性。此外，一些生物体只是缺少基因，甚至是整个过程，而这些基因或过程在其他生物体中可能非常重要，即使是在关系相当密切的生物体中也是如此。例如，酿酒酵母完全缺乏呼吸复合物I的NADH脱氢酶亚单位和替代氧化酶（AOX），后者存在于白色念珠菌和其他真菌，表明白色念珠菌在这方面更能代表其他真菌[57-61]. 作为酿酒酵母在一般情况下是非致病性的，与毒力过程相关的GO术语分配在该生物体中没有很好的表示。例如，酿酒酵母完全缺乏编码分泌脂肪酶的基因的同源序列白色念珠菌，一个可能在宿主定植和毒力中起作用的基因家族已被提出，但尚未得到最终证明[47,62,63].

另一个需要考虑的警告是，这些注释的转移准确性取决于正确的矫形学名称。我们只使用了来自白色念珠菌和酿酒酵母推断正畸（用秀丽隐杆线虫用作外群，以消除一些假阳性预测），而更全面的正畸学绘图可能使用许多相关生物的序列，如TreeFam项目中的序列[64]，用于构建动物基因家族的树。未来，我们将扩展我们的程序，以根据裂变酵母的同源性预测GO术语分配葡萄裂殖酵母以及更为远近相关的真核生物，针对这些真核生物已经策划了一套基于实验证据的全面GO注释。最重要的是，基于直系遗传的转移是基于自直系遗传最后一个共同祖先以来其功能和角色的保存。在许多情况下，如果不是大多数情况下，这种假设可能是正确的，特别是当生物体最近发生分化时。然而，我们强调，这些基于正统的转移注释是预测，并且后续的实验分析是必要的，以做出结论性声明。对基于序列的预测进行实验性跟进可以产生令人激动和惊讶的结果，其中一些将在下文中详细讨论。

进化过程中的重新布线

白色念珠菌非常类似于酿酒酵母在许多方面，以及对白色念珠菌分子生物学经常强调共性：许多白色念珠菌基因首先通过补体克隆酿酒酵母突变或通过与酿酒酵母基因。然而，最近的研究表明白色念珠菌不是碰巧拥有额外能力的面包酵母，它可以与哺乳动物宿主建立共生和致病性相互作用。相反，自从这两种生物进化分离以来，在大约1.40-8.5亿年的时间里，它们之间一些最基本和最基本的过程的分子细节发生了分歧[36]. 对几个转录网络“重组”案例的解释突出了转录网络快速进化的能力。“重写”或“重编程”包括通过添加或删除上游转录因子结合基序和/或替换参与特定过程调控的转录因子的身份来实现的共调控基因组之间成员关系的变化。因此，两个不同的物种可能对特定的环境刺激表现出相似的反应，但用于实现这种反应的特征的分子类型可能截然不同[65]. 由于重新布线的现象，可以认为白色念珠菌应该修改(方框1).

也许最引人注目的例子是，编码核糖体蛋白的基因的转录调控网络在酿酒酵母和/或白色念珠菌自从他们的上一个共同祖先以来，这是令人惊讶的，因为核糖体蛋白表达的本质。在酿酒酵母，Rap1p与提供特异性的辅因子一起结合核糖体蛋白基因上游并激活其转录。相比之下白色念珠菌的正交酿酒酵母Rap1p不参与此过程；相反，两者都在白色念珠菌在许多其他子囊菌中，这项任务是由酿酒酵母蛋白Tbf1p，可能是祖先状态[66]. 在这种情况下，受调控基因集上游的转录因子和调控基序在酿酒酵母血统。在另一个显著的例子中，在两个物种中，交配类型控制下的基因以相反的方式进行调节，但在“a”和“alpha”交配类型中的基因表达方面具有相同的结果；此外，白色念珠菌在这个过程中使用了一个转录激活物Mtla2p，它已经从酿酒酵母血统[67]. 已经发现了调节回路中的几个其他分歧实例以及同源转录因子的不同作用[68-72].

转录调控并不是发生重组的唯一领域。长期以来，一个明显的悖论是，尽管白色念珠菌基因组包括许多酿酒酵母减数分裂基因[73]，尚未观察到减数分裂。最近的工作已经证实，基因重组发生在副性周期中，并由白色念珠菌Spo11p，其酿酒酵母减数分裂重组中的正交函数[14]. 这就增加了另一种可能性白色念珠菌减数分裂基因的直向同源物也可能在通过异性周期中的重组产生遗传多样性中发挥作用[14].

虽然这些重新布线的例子并没有减损物种间GO注释转移的整体效用，但它们说明了该方法的一些局限性。该策略取决于两个物种中是否存在可识别的同源基因，因此它仅适用于共同的一组基因；例如，如果其中一个物种的直系祖先丢失了MTLA2型中不存在的酿酒酵母，则无法传输GO注释。此外，由于重组比其生物化学活性更有可能改变基因产物的作用，因此转移的生物过程注释可能不如分子功能或细胞成分注释可靠。与任何基于自动分析的GO注释一样，它们应被视为预测，可用于制定实验室中要进行的可测试假设。

结束语和未来方向

真菌病原菌完整基因目录的表征白色念珠菌虽然具有挑战性，但这一目标很可能会为真菌生物学和发病机制带来令人兴奋的新见解。GO注释的种间转移提供了快速进行大量推断的机会。能够完善注释基因的目录，特别是能够推断不太可能在感兴趣的生物体中看到实验特征的基因注释，这对大规模实验的分析非常有帮助。重要的是要记住，基于正形学传输的GO注释是预测，需要进一步进行实验验证。然而，在实验结果与基于序列的预测不一致的情况下，还有一些有趣的生物学有待探索。与的比较酿酒酵母基因只是第一步：可能会有未被识别的as-yet白色念珠菌基因，可能尚未被注释为开放阅读框，或被注释但与任何当前特征基因没有相似性，随着基因组序列的细化和其他生物体的基因，特别是其他真菌病原体的基因的实验特征化，这些基因将被揭示[74]. 此外，最近的微阵列和转录组测序研究已经揭示了大约1000个以前未知的转录物酿酒酵母[75-78]几乎什么都不知道，其中许多在密切相关的物种中几乎没有或几乎没有与相应的共张力区保持一致[76,79]. 预计这些研究将揭示白色念珠菌其中许多可能处于白色念珠菌进化与宿主军备竞赛，并与发病机制密切相关。正在进行的注释白色念珠菌基因组为促进真菌发病机制的实验室研究提供了机会(方框2)新的发现可能会揭开分子秘密，使我们能够更好地驯服该生物体的致病方式，以造福患有念珠菌疾病。

致谢

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