小鼠年龄依赖性术后认知障碍和阿尔茨海默病相关神经病理学

老年WT小鼠无全麻外周手术致认知功能障碍

恐惧调节系统（FCS）是最常用的行为测试之一，用于检测麻醉引起的认知障碍^5,6麻醉加手术^7,8因此，我们首先评估并比较了使用FCS的成年（9月龄）和老年（18月龄）WT小鼠在不使用全身麻醉剂的情况下进行的外周手术（局部麻醉下）对认知功能的影响。我们发现，在没有全身麻醉的情况下进行的外周手术会损害认知功能，这一点可以通过在术后72小时、7天、30天和60天（但不是24小时）对18个月大但不是9个月大的WT小鼠进行的上下文和语气测试中的冷冻时间缩短来证明(图2). 双向方差分析显示年龄增加了外周手术诱导的认知功能障碍(图2). 9个月大的WT小鼠在FCS环境试验中表现出相对较短的冷冻时间，这可能是由于小鼠在FCS室中的过度反应所致。

在单独的窗口中打开

图2

外周手术损害了18只（而非9只）月龄WT小鼠的关联认知功能。

在18个月大的野生型小鼠手术后72小时（B）、7（C）、30（D）和60（E）天，但不是24小时（A），但不是9个月大的野生型小鼠手术后，外周手术减少了FCS上下文测试中的冷冻时间（*P<0.05或**P<0.01）。双向方差分析表明，年龄增加了外周手术诱导的认知损伤（上下文测试，^∧术后72小时（B）和7天（C）时（P<0.05）。在术后72小时（G）、7天（H）、30天（I）和60天（J），外周手术降低了FCS张力测试的冻结时间（*P<0.05或**P<0.01），但18个月龄WT小鼠术后24小时（F）没有降低，而9个月龄的WT小鼠则没有。双向方差分析表明，年龄增加了外周手术导致的认知障碍（音调测试，^∧术后7（H）天和30（I）天，P<0.05）。N=10。FCS，恐惧调节系统；野生型，WT；方差分析。

此外，在18年的莫里斯水迷宫探测试验中，外围手术减少了小鼠穿越平台的次数(图3E)，但不是9(图3B)，月龄WT小鼠。外周手术没有显著改变逃避潜伏期(图3A和3D)和游泳速度(图3C和3F)MWM试验中的小鼠。

在单独的窗口中打开

图3

外周手术会损害18个月龄WT小鼠的空间认知能力。

在没有全身麻醉剂的情况下，在MWM试验中，9个月大的WT小鼠（a和B）的外周手术既不会增加逃避潜伏期，也不会减少平台穿越时间。然而，在18个月大的WT小鼠中，外周手术减少了平台穿越时间：MWM测试中为4，3–5.25（中位数，四分位数范围），而为2，3–1（中位数、四分位范围），**P=0.0052（E）。在MWM研究中，外周手术不会增加18个月大的WT小鼠的逃避潜伏期（D）。9个月龄WT（C）和18个月龄的WT小鼠（F）的游泳速度在对照组和手术组之间没有显著差异。莫里斯水迷宫，MWM；野生型，WT.值表示为平均值±SEM.N=10。

总的来说，这些数据表明，不受全身麻醉药影响的外周手术诱导了联合^7,8和空间¹⁶老年小鼠认知功能受损。

外周手术增加了老龄WT小鼠海马Aβ水平

据报道，手术后的神经炎可能与动物的认知功能障碍有关^7,8和患者¹⁷然而，即使所有患者的外周手术可能导致血液中促炎细胞因子增加（这可能导致神经炎症¹⁸)，并非所有患者都会发生POCD。因此，似乎患有POCD的患者大脑中存在其他促进认知障碍的变化。我们假设其中一个变化是大脑Aβ水平升高，因此评估了周边手术对小鼠海马体Aβ水平的影响。

Aβ的酶联免疫吸附试验（ELISA）显示外周手术（黑条）没有显著增加Aβ40的水平(图4A)和Aβ42(图4B)与对照条件（白条）相比，在9个月大的WT小鼠的海马中。然而，在18个月大的WT小鼠中，外周手术显著增加了术后12小时小鼠海马中的Aβ水平(图4C和图4D). 最后，ELISA显示，18个月龄WT小鼠海马中Aβ的基线水平高于9个月龄的WT小鼠(图4E和4F). 这些数据表明，外周手术增加了老龄WT小鼠海马中Aβ40和Aβ42的水平，但未增加成年WT小鼠的水平。这些结果与之前的研究结果一致，即衰老与大脑Aβ水平升高有关¹⁹.

在单独的窗口中打开

图4

外周手术增加了18个月龄WT小鼠海马中的Aβ水平。

ELISA显示，外周手术不会增加9月龄WT小鼠海马中Aβ40（A）和Aβ42（B）的水平。外周手术显著增加了18个月龄WT小鼠海马中Aβ40（C）和Aβ42（D）的水平。ELISA显示，18个月龄WT小鼠海马中Aβ40（E）和Aβ42（F）的基线水平高于9个月龄的WT小鼠。β-淀粉样蛋白，Aβ；野生型，WT.N=6–8。

外周手术诱导成年AD Tg小鼠认知功能障碍及海马Aβ水平升高

接下来，我们使用AD Tg小鼠进一步验证了以下假设，即外围手术只会导致认知障碍，并提高基线脑Aβ水平升高的小鼠的脑Aβ含量。我们发现外周手术导致认知障碍(图5A和5B)和Aβ积累(图5C)9个月龄AD Tg小鼠[B6.Cg-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/J]，但9个月大WT小鼠术后7天和12小时未出现。AD Tg小鼠[B6.Cg-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/J]的Aβ水平升高^12,13]. 综上所述，这些数据进一步表明，外围手术只会增强大脑Aβ的积累，并导致基线大脑Aβ水平升高的小鼠出现认知障碍。注意，在本实验中，当在手术后7天对小鼠进行一次测试时，FCS张力测试中小鼠的冷冻时间(图5A)在术后24小时、72小时、7天、30天和60天在FCS中重复测试时，其值高于实验中的值(图2). 目前，这种差异的确切原因尚不清楚。我们假设，当小鼠在手术后的FCS中重复测试时，FCS色调测试的冷冻时间可能会缩短。未来的研究将验证这一假设。

在单独的窗口中打开

图5

外周手术会损害9个月大的AD Tg小鼠的认知功能并增加海马Aβ水平，但9个月龄的WT小鼠没有。

在没有全身麻醉剂的情况下，在9个月龄AD Tg小鼠术后7天进行的FCS上下文测试（A）和张力测试（B）中，外周手术可减少冷冻时间，但在9个月龄WT小鼠中则没有。双向方差分析表明AD基因突变(应用程序和PSEN1公司)增强术后7天外周手术诱导的认知功能障碍：情境测试，^∧∧P=0.002；音调测试：^∧P=0.021。N=10。（C） ●●●●。9月龄AD Tg小鼠海马的基线Aβ水平高于9月龄WT小鼠，外周手术增加了9月龄AD-Tg小鼠海马Aβ水平，但9月龄WD小鼠没有增加。阿尔茨海默病；β-淀粉样蛋白，Aβ；转基因，Tg；野生型，WT；方差分析；淀粉样蛋白前体；早老素1，PSEN1。N=10（行为测试），N=6（生物化学研究，但仅使用一个样本来代表研究结果）。全长印迹/凝胶见补充图1.

外周手术增加老龄WT小鼠海马BACE1和P-eIF2α水平

据报道，细胞应激可增强e（电子）乌克兰语翻译我初始化（f）actor（eIF）2α，从而导致BACE1水平增加，从而导致Aβ积累¹⁴因此，我们评估了不受全身麻醉药影响的外周手术对小鼠脑内BACE1和磷酸化eIF2α（P-eIF2）水平的影响。定量Western blot显示，外周手术增加了18个月龄WT小鼠术后12小时海马中BACE1和P-eIF2α的水平(图6A、6B和6C). 这些数据表明，外周手术可能通过增加P-eIF2α和BACE1的水平来诱导Aβ的产生。

在单独的窗口中打开

图6

外周手术增加小鼠海马BACE1和P-eIF2α的水平。

（A） ●●●●。与对照组相比，外周手术（带4至6）在术后12小时增加了18个月大小鼠海马中BACE1和P-eIF2α的水平（带1至3）。Western blot定量显示，与对照组相比，外周手术（黑条）在术后12小时增加了18个月大WT小鼠海马中BACE1（B）和P-eIF2α（C）的水平。β位点淀粉样前体蛋白裂解酶BACE1；磷酸化真核生物翻译起始因子2α，P-eIF2α。全长印迹/凝胶见补充图2.

小鼠接受外周手术后生理变化的测量

使用鼠尾血压袖带（肯特科学合作公司，托林顿，CT）测量血压。血气分析仪测定血气和血糖水平（Trupoint，ITC，Edison，NJ）。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国研究产品公司，马萨诸塞州贝尔蒙特）测定血液中的肾上腺素水平。通过记录的小鼠视频计算运动活动。疼痛阈值由Von Frey纤维（North Coast Medical，Inc.，Gilroy，CA）确定，如先前的研究所述³⁷将Von Frey纤维应用于腹部伤口，以评估疼痛阈值。

恐惧调节系统（FCS）

FCS研究按照我们之前的研究所述进行⁶经过修改。具体来说，FCS（Stoelting Co.，Wood Dale，IL）中的配对是在手术后24小时进行的，模拟了患者在手术后可能难以学习新东西的情况。配对时，允许每只小鼠在FCT室中探索180秒，然后发出持续60秒的2-Hz脉动音（80 dB，3600 Hz）。声音响起后立即发生轻微的足部电击（0.8 mA持续0.5秒）。配对进行了两次，其间两分钟。第一次FCT上下文测试是在配对结束后30分钟进行的。每只老鼠被允许在同一个房间内总共停留390秒。通过测量小鼠表现出“冻结行为”（冻结时间）的时间来评估上下文测试中的认知功能（例如学习和记忆），这是指在第二个180秒期间，除呼吸外，小鼠完全静止的姿势。配对结束后90分钟进行第一次音调测试。每只老鼠被允许在不同的房间内停留390秒。在没有脚电击的情况下，在第二个180秒中也出现了相同的音调。声调测试中的认知功能也通过测量冻结时间进行评估。在术后24小时和72小时、7天、30天和60天，在FCT中对相同的9个月龄和18个月龄小鼠队列进行重复测试，无需额外配对。该设计与患者术后较长时间内可能存在特定认知障碍的观察结果相一致。为了控制相同小鼠的连续测试，我们在术后7天观察到手术诱导的认知功能障碍，与重复FCT测试无关(图7). 我们使用了双重配对方法来说明外周手术可能会在术后很长一段时间（例如60天）内损害认知。然而，这种方法使9个月大的小鼠在FCS的上下文测试中表现出相对多动，从而缩短了冷冻时间，这是该方法的一个警告。

莫里斯水迷宫（MWM）

如前所述，从外周手术后第二天开始，在MWM（Stoelting Co.）对来自外周手术组和对照组的9个月龄和18个月龄小鼠（不同于FCS研究中的小鼠）进行测试²²手术后一天，将小鼠置于MWM中。每次进行MWM试验后，我们立即干燥小鼠的伤口，研究中未发现小鼠有感染迹象。我们没有包括FCS和MWM研究的培训期，因为我们想明确确定手术是否会损害小鼠学习新事物的认知功能。其他研究也采用了类似的方法^5,22.

脑组织溶解和蛋白质定量

手术后12小时采集小鼠脑组织（海马）。使用免疫沉淀缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，0.5%Nonide P-40）和蛋白酶抑制剂（1μg/ml抑肽酶，1μg/ml亮氨酸蛋白酶，1μg/ml胃蛋白酶抑制素A）将采集的脑组织在冰上均质。收集裂解产物，在12000 rpm下离心15分钟，并使用双钦酸（BCA）蛋白检测试剂盒（Pierce，Iselin，NJ）定量总蛋白。然后对脑组织进行Xie等人所述的Western blot分析。³⁸.

蛋白质印迹分析

使用6E10抗体（1:200稀释；新泽西州普林斯顿市Covance，分类号：SIG-39320）识别Aβ（4kDa）。使用β-位点淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1）抗体（1:1000稀释；Abcam，Cambridge，MA，分类号：ab2077）识别BACE1（65 kDa）。磷化氢-e（电子）乌克兰语翻译我初始化（f）actor（eIF）2α抗体（Ser51，119A11）（1:1000稀释，细胞信号，分类号：3597）用于识别磷酸化（eIF2α）2α，（P-eIF2β）（38 kDa）。使用抗β-肌动蛋白抗体（1:10000，Sigma，St.Louis，MO）检测β-肌动蛋白（42kDa）水平。Western blot定量按照Xie等人的描述进行。³⁸100%的蛋白质水平变化是指对照水平，以便与实验条件进行比较。

酶联免疫吸附试验（ELISA）Aβ测定

如我们之前的研究所述，使用ELISA（Invitrogen，加州旧金山）测定Aβ40和Aβ42的水平³⁹用小鼠Aβ40和Aβ42免疫测定试剂盒（Invitrogen，目录号：KMB3481和KMB 3441）分别测定9月龄和18月龄WT小鼠海马中Aβ40及Aβ42的水平。

Aβ的免疫印迹检测

如之前的研究所述，对海马中的Aβ进行免疫印迹检测^38,40,41具体而言，将大脑样本均质（150 mM NaCl与蛋白酶抑制剂鸡尾酒在50 mM Tris中，pH值8.0）并离心（65000 rpm×45 min），然后去除上清液。然后在含有1%十二烷基硫酸钠的均质缓冲液中通过超声波使颗粒重新悬浮。在不溶性物质造粒（18000 rpm×15分钟）后，在SDS-PAGE上电泳SDS-提取物（来自Invitrogen的4–12%Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶），印迹到PVDF膜上，并用1:200稀释的6E10抗体（Covance）进行探测。

本研究由美国国立卫生研究院资助（马里兰州贝塞斯达）（R21 AG029856、R21 AG038994、R01 GM088801和R01 AG041274）；研究员发起了阿尔茨海默病协会（伊利诺伊州芝加哥）和治愈阿尔茨海默氏病基金会（马萨诸塞州韦尔斯利）向谢忠聪博士提供的研究拨款。Edward Marcantonio博士获得了国家老龄研究所颁发的面向患者研究的职业中期研究员奖[K24 AG035075]。作者感谢西奈山医学院的Mark Baxter博士进行的建设性讨论，马萨诸塞州总医院的Hui Zheng博士对数据进行统计分析的帮助，以及马萨诸塞总医院的Joshua J.Busscher和Xin Xin博士提供的技术帮助。