自然医学。作者手稿；PMC 2014年7月1日发布。
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肿瘤糖酵解的超极化磁共振成像13C-标记葡萄糖
英国剑桥大学癌症研究所、剑桥大学李嘉诚中心、剑桥大学罗宾逊路、CB2 0RE和剑桥大学生物化学系、剑桥大学网球场路、剑桥CB2 1GA
*作为联合高级作者平等参与。
- 补充资料
1.
GUID:F5145B5E-CDD4-45E5-A5CA-B902D0F0347F
摘要
通过测量超极化[U-2H、 U型-13C] 使用葡萄糖转化为乳酸盐13磁共振波谱和光谱成像。标记的乳酸仅在肿瘤中观察到，而在周围正常组织或体内其他组织中未观察到，并且在化疗药物治疗后24小时显著降低。还检测到戊糖磷酸途径中6-磷酸葡萄糖酸的生成。该技术可为临床检测肿瘤治疗反应的早期证据和监测肿瘤戊糖磷酸途径活性提供一种新的方法。
关键词：乳酸、治疗反应、淋巴瘤、肺、代谢
简介
肿瘤细胞经常表现出高有氧糖酵解率1虽然缺氧肿瘤微环境可能会选择糖酵解细胞，从而在缺氧的情况下生成ATP，但很明显，肿瘤细胞中观察到的这种和其他代谢变化是由癌基因激活和肿瘤抑制基因功能丧失驱动的2此外，虽然这些代谢变化对于在厌氧条件下生成ATP很重要，但它们还具有其他重要功能，例如为生物合成途径生成代谢中间产物三例如，糖酵解通量被转移到戊糖磷酸途径（PPP），以生成NAPDH用于脂质生物合成，并对抗许多肿瘤所经历的氧化负荷增加4.
肿瘤细胞显示的异常代谢为使用代谢成像监测肿瘤检测和治疗反应提供了机会5.正电子发射断层扫描（PET）测量18氟脱氧葡萄糖(18FDG）已被用于检测肿瘤及其转移，FDG摄取减少也被用于检测某些肿瘤类型的治疗反应6.
13C磁共振波谱（MRS），可检测给药后多种细胞代谢物的信号13C标记基板，包括13C-标记葡萄糖7广泛用于跟踪代谢过程体内然而，其相对较低的灵敏度是一个主要限制。动态核极化（DNP）的最新发展，极大地提高了13C MRS实验（>10000次）8，可以实时成像几种底物及其生成的代谢物体内
9。迄今为止使用最广泛的底物已经超极化[1-13C] 丙酮酸盐10其中，肿瘤中标记的丙酮酸和内源性乳酸之间的标记交换减少已被证明是治疗反应的标志11-13.
该技术的主要缺点是超极化半衰期短，这对于[1-13C] 丙酮酸约为30秒体内这意味着成像必须在注射极化材料2–3分钟后完成，其随后的新陈代谢应相对较快10这似乎排除了超极化的使用13C-标记葡萄糖，因为葡萄糖碳非常短T型1秒（<1秒）。然而，质子化碳的氘化可以显著延长其T型1秒14.以往超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖显示超极化13C-标记的乳酸可以在大肠杆菌细胞15，酵母16在肿瘤细胞中在体外
17.超极化13C标记葡萄糖在大鼠体内成像体内
18，尽管没有检测到葡萄糖代谢。我们在这里显示超极化[U的注入-2H、 U型-13C] 葡萄糖可实时成像两种小鼠肿瘤模型的糖酵解通量体内化疗药物足叶乙甙治疗24小时后，淋巴瘤模型的这种流量减少。我们还表明，可以检测到PPP活性产生的6-磷酸葡萄糖酸盐（6PG）。自超极化以来[1-13C] 丙酮酸已经转移到诊所19在前列腺癌的研究中，超极化葡萄糖及其代谢产物乳酸的成像设备可能为临床肿瘤治疗反应的成像提供了更灵敏的方法。
结果
体内测量
静脉注射超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖（100 mM，0.35 mL）注入EL4荷瘤小鼠(n个=6）导致所有六个肿瘤信号13两种异倍体形式的C核（60–100 ppm）(). 极化随表观自旋晶格弛豫时间衰减，T型1，对于组合谐振，为8.9±0.6 s(n个=12，所有动物治疗前后的平均值）(). 注射后15秒，在肿瘤光谱中也观察到来自标记的乳酸C1碳的信号。乳酸检测对EL4肿瘤没有特异性，因为从Lewis肺腺癌肿瘤（LL2）中获得了类似的光谱(). 当表面线圈接收器放置在这些组织上时，在大脑、心脏、肝脏或肾脏中未观察到标记的乳酸()表明乳酸信号来自肿瘤本身，而不是通过循环来自其他组织。A典型13注射超极化[U后约15秒获得的C化学位移图像（CSI）-2H、 U型-13C] 葡萄糖，来自未经治疗的EL4荷瘤小鼠()，表明超极化乳酸信号主要位于肿瘤内部，与局部光谱一致(). 乳酸在CSI中的分布与注射超极化药物后观察到的分布相似-13C] 丙酮酸盐(图1S，补充信息).
[美]-2H、 U型-13C] 葡萄糖信号是可检测的体内（a）
13[U的C核磁共振谱-2H、 U型-13C] 葡萄糖在体外下午65点的共振来自葡萄糖C6α，β；下午72-79之间的共振来自葡萄糖C2-5α，β；94和98 p.p.m.时的共振分别来自葡萄糖C1α和C1β。由于J型-联轴器之间13C-13C和13C-2H。（b）代表13静脉注射0.35 mL 100 mM超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖。为了清楚起见，只显示了每隔一个时间点。叠加图中的顶部频谱是前20秒数据采集的总和。[U-2H、 U型-13C] 肿瘤中的葡萄糖信号随明显的自旋晶格弛豫时间衰减，T型1，约9秒AU，任意单位。
13C光谱成像显示标记的葡萄糖和乳酸盐的空间分布（a）代表13注射0.35 mL 100 mM超极化后15 s，从皮下EL4和LL2肿瘤、大脑、心脏、肝脏和肾脏获得的C MR光谱-2H、 U型-13C] 葡萄糖。乳酸谱是在1s内收集到的4个瞬态的总和，而葡萄糖谱只获得了一个瞬态。超极化通量13C标签仅在[U-2H、 U型-13C] EL4和LL2肿瘤中的葡萄糖（63-99 p.p.m.）和乳酸C1（185 p.p.m..时加倍）。（b）静脉注射0.4 mL 200 mM超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖注入EL4荷瘤小鼠。葡萄糖、尿素和乳酸的空间分布显示为相对于各自最大值的体素强度。这个1使用以灰度显示的核磁共振图像来确定肿瘤的解剖位置（用白色轮廓表示）。包括尿素模型作为参考。色标表示超极化图像的任意线性分布强度。
低水平的磷酸二羟丙酮（DHAP）、6PG和碳酸氢盐（HCO三−)在肿瘤光谱中观察到(). 这些共振是根据它们的化学位移来确定的，以前在超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖大肠杆菌和酵母15,16.6PG是PPP中的一种中间体，与糖酵解中间体1,3-二磷酸甘油酸（1,3PG）、3-磷酸甘油酸（3PG。然而，我们将观察到的共振归因于6PG，因为葡萄糖和6PG之间只有三个酶催化步骤，而葡萄糖和2PG之间最多有八个，因此极化更有可能被保留。此外，尽管DHAP的浓度高于肿瘤细胞中磷酸甘油酯的浓度，但糖酵解途径中的上游中间产物DHAP的含量高于磷酸甘油酯20，DHAP信号与分配给6PG的信号相当，因此来自磷酸甘油酸的贡献预计很小。
13未经治疗的皮下EL4淋巴瘤的C MR波谱光谱是静脉注射0.4 mL 200 mM超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖。总频谱中葡萄糖和乳酸区域之间的信噪比差异很小，这是从葡萄糖和乳酸区交叉采集信号的结果，同时对乳酸区进行更多采样（见方法）。插图显示了160–220 p.p.m.区域的放大倍数为40倍。这表明碳酸氢盐C1（~164 p.p.m.，HCO三−)、6-磷酸葡萄糖酸盐C1（~182 p.p.m，6PG）、乳酸C1（~185 p.p.m）和磷酸二羟丙酮C2（~214 p.p.m、DHAP）。超极化信号[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖位于下午63点到99点之间。。
流量13超极化的C标签[U-2H、 U型-13C] 用足叶乙甙治疗EL4荷瘤动物24小时后，葡萄糖与乳酸的比值降低。用足叶乙甙治疗24小时后，乳酸/葡萄糖信号比下降了62%（未治疗肿瘤为1.82±0.42%，治疗肿瘤为0.69±0.11%，P（P）= 0.026,n个= 6).
在这些肿瘤的TCA循环中没有明显的丙酮酸氧化迹象。在注射超极化药物的动物中[1-13C] 丙酮酸（0.2 mL 75 mM静脉注射）13一氧化碳三−信号为[1]的0.01±0.006%-13C] 乳酸信号(n个=2）切片选择性光谱和0.8±0.1%(n个=2）在非切片选择性光谱中，其中有一些来自底层组织的贡献。二氯乙酸酯（150 mg kg−1丙酮酸盐注射前3min静脉注射对该比率没有显著影响。
肿瘤提取物的高分辨率MRS测量
足叶乙甙治疗对未标记和13C标记的葡萄糖和乳酸通过高分辨率测定13C类(图2S，补充信息)和1注射[U后20和150秒时动物EL4肿瘤、肝脏和血液提取物的核磁共振氢谱-13C] 葡萄糖，注射浓度与超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖。标记材料与未标记材料有区别，其中13C仅在自然丰度（1.1%）时存在13C-13C标记材料中的自旋耦合。根据天然丰度测定未标记葡萄糖和乳酸的浓度13C信号与根据1H核磁共振波谱（数据未显示）。血液中没有检测到标记的乳酸，证实超极化13肿瘤中观察到C-标记的乳酸体内不太可能被其他组织洗掉。药物治疗后和注射标记葡萄糖后150秒，标记乳酸浓度下降50%，与稳态未标记乳酸浓度减少39%相当(;图2S，补充信息). 通过注射[1,2-13C] 葡萄糖与乳酸2位和3位标签掺入分析21.乳酸C3单线态强度的比值（来自[3-13C] 乳酸）（根据背景天然丰度信号的贡献进行校正）到C3双链体的贡献（来自[2,3-13C] 乳酸）为7±1%(n个=5），表明通过PPP的通量约为糖酵解通量的7%，假设乳酸盐C3产生的单线态是PPP氧化分支的产物21未经治疗和治疗的肿瘤之间没有差异，肝脏中的相应值为38±9%(n个= 5).
表1
| |
自然丰度信号
|
[美]-13C] 葡萄糖信号
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|---|
| | 葡萄糖 | 乳酸 | 葡萄糖 | 乳酸 |
|---|
|
注射后20秒
|
EL4级
(μmol克−1
重量) |
未经处理
| 0.42±0.06 | 20.7±3.0 | 0.13±0.02 | 0.49±0.10 |
|
治疗
| 0.46±0.13 | 12.7±1.9一 | 0.16±0.04 | 0.50±0.13 |
血液
（μmol毫升−
1)
|
未经处理
| 3.3±0.1 | 3.3±0.4 | 1.8±0.1 | 未注明日期。 |
|
治疗
| 3.2±1.0 | 3.3±0.6 | 3.8±0.9 | 未注明日期。 |
肝脏
（μmol克−1
重量）
|
未经处理
| 11.4±1.1 | 7.2±1.3 | 1.7±0.4 | 0.20±0.06 |
|
治疗
| 10.6±1.5 | 5.4±0.6 | 1.4±0.3 | 0.06±0.02一 |
|
注入后150秒
|
EL4级
（μmol克−1
重量）
|
未经处理
| 1.4±0.3 | 20.0±1.0 | 0.40±0.07 | 1.9±0.4 |
|
治疗
| 1.5±0.3 | 12.0±0.5一 | 0.49±0.10 | 1.2±0.2 |
肝脏
（μmol克−1
重量）
|
未经处理
| 9.2±3.2 | 6.0±0.3 | 1.1±0.1 | 0.31±0.01 |
|
治疗
| 9.8±3.0 | 5.3±0.7 | 1.3±0.2 | 0.29±0.04 |
讨论
以前的研究表明，在小鼠肿瘤模型中，可以从肿瘤的减少中检测到治疗反应13注射C-标记的乳酸在动物体内的浓度13C-标记葡萄糖22,23然而，在这些研究中，对于非极化葡萄糖，使用了更高的葡萄糖浓度22,23数据采集时间较长（80–120分钟），成像信号不足。我们在这里展示了超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖具有足够长的T型1和极化程度，以便检测和成像小鼠肿瘤中的糖酵解通量体内此外，该实验检测到肿瘤治疗反应，用足叶乙甙治疗淋巴瘤肿瘤24小时后乳酸/葡萄糖信号比率下降62%。这一下降幅度大于稳态乳酸浓度下降39%和标记乳酸浓度下降50%（通过对肿瘤提取物的测量确定）()部分原因可能是药物治疗动物的血糖浓度稍高。
只有肿瘤组织显示出可检测到的标记乳酸水平；在大脑、心脏、肝脏或肾脏中未检测到信号()血液中未检测到标记的乳酸(). 肿瘤提取物中标记乳酸浓度的测量()乳酸产生率为~0.8μmol min−1克−1与其他类型肿瘤细胞的比率相似1并与大鼠大脑中测得的葡萄糖消耗率（0.75μmol min−1克−1)24和心肌（~1μmol分钟−1克−1)25可能这些组织没有信号，因为与肿瘤相比，它们的稳态乳酸浓度更低24,25.
超极化[U的MR检测灵敏度-2H、 U型-13C] 葡萄糖和由此产生的乳酸远低于PET检测18FDG也低于MR检测的超极化13[1之间的C标签交换-13C] 丙酮酸和内源性乳酸。超极化[U产生的乳酸信号的信噪比-2H、 U型-13C] 葡萄糖注射量为0.3g/kg时，葡萄糖为~10−10.7 g kg时为~60−1注射，并使用优化的信号采集方案，相比之下，超极化[1产生的乳酸盐约为400-13C] 丙酮酸（注射量约0.07 g kg−1)11(图S1，补充信息). 然而，超极化[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖在检测肿瘤治疗反应方面具有潜在的优势。首先，它不使用电离辐射。第二，检测13C标记的乳酸应该有利于检测那些肿瘤的反应18FDG-PET可以显示较差的对比度，例如脑肿瘤和前列腺。另一方面，脑肿瘤中的乳酸浓度远高于周围脑组织中的浓度，本研究中肾脏中缺乏标记的乳酸，这表明检测前列腺癌的治疗反应也是可能的，因为邻近膀胱中几乎没有标记的乳酸。
极化丙酮酸和18FDG-PET实验只研究了葡萄糖代谢的几个步骤；糖转运与己糖激酶活性18极化丙酮酸的FDG-PET和单羧酸转运体（MCT）和LDH活性。然而，原则上，超极化测量13葡萄糖和乳酸之间的C标记通量可用于评估整个糖酵解途径的通量。这取决于两个假设。首先，标签从葡萄糖到丙酮酸存在单向通量。由于在葡萄糖和丙酮酸之间的糖酵解途径中有三个有效的不可逆步骤，因此糖酵化中间产物浓度相对较低，并且没有可测量的糖异生通量，例如，在超极化实验中，我们从未在该肿瘤模型中检测到标记葡萄糖[1-13C] 丙酮酸或[1-13C] 乳酸11,26，那么这个假设似乎是合理的。其次，我们假设大多数超极化13C标签到达丙酮酸交换到更大的乳酸池中，这已被证明27线粒体中的丙酮酸被氧化。超极化实验-13C] 丙酮酸盐表明，与交换丙酮酸相比，肿瘤中丙酮酸的氧化作用最小13含有内源性乳酸的C标记，H中仅出现0.01±006%的乳酸超极化标记13一氧化碳三−在非切片选择性光谱中，包括来自下层组织的一些贡献，该数字增加到0.8±0.14%。二氯乙酸盐，已被证明可增加丙酮酸盐的氧化28，对该比率没有显著影响。在大鼠脑胶质瘤模型中，来自超极化H的信号13一氧化碳三−是[1中的4%-13C] 正常大脑中乳酸与16%28因此，我们得出结论：超极化测量13丙酮酸氧化速率低的组织（如肿瘤）中葡萄糖和乳酸之间的C标记通量可用于评估通过糖酵解途径的净通量。测量的流量应该对抑制路径中任何步骤或将流量转移到其他路径的药物敏感。原则上，丙酮酸极化实验提供了关于糖酵解通量的类似信息，因为它对乳酸浓度的变化很敏感；乳酸浓度增加导致标签交换增加11然而，情况并非如此。在使用MEK抑制剂治疗的人乳腺癌细胞（MCF7）中，尽管乳酸浓度增加，但乳酸标记降低。乳酸浓度的增加归因于糖酵解通量的增加和MCT抑制导致的标记减少29极化葡萄糖实验的另一个优点是，葡萄糖可以在生理浓度下使用，而丙酮酸则在超生理浓度下。在第一次超极化临床试验中[1-13C] 丙酮酸，以0.43 mL kg的剂量注射丙酮酸−1250 mM溶液（Clinical-Trials.gov标识符：NCT01229618），相当于约1.5 mM的全血浓度，而生理浓度约为0.060 mM。在临床静脉葡萄糖耐量测试中，葡萄糖注射量最高为0.5 g kg−1相当于约40 mM的全血浓度。
生产13一氧化碳2在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化的不可逆氧化脱羧反应中，可能提供进入PPP的净流量的测量。使用[1,2进行测量-13C] 葡萄糖表明，约7%的标记乳酸是通过PPP产生的，这与测量的超极化H相当13一氧化碳三−/6-磷酸葡萄糖酸盐13C类1比率约为10%。然而，如果存在显著的13一氧化碳2丙酮酸脱氢酶催化反应中丙酮酸脱羧产生的产物。在注射超极化药物的动物的非片段选择性光谱中[1-13C] 丙酮酸-超极化H13一氧化碳三−信号为[1]的0.8%-13C] 与注射超极化[U的动物的~2%相比，乳酸信号-2H、 U型-13C] 葡萄糖。因为进入途径的流量由葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性控制30标记6PG可以提供更可靠的PPP流量测量。
使用超极化[U的主要限制-2H、 U型-13C] 葡萄糖的极化寿命很短。降低13分子中的C取代，以及由此产生的同核偶极弛豫，将延长寿命，尽管影响相对较小。这个T型1[U的α和β异构体中C4碳的s-2H、 U型-13C] [U中天然丰度C4碳中的葡萄糖增加了约30%-2H] 葡萄糖。使用[U-2H、 3、4-13C类2]或[U-2H、 3个-13C] 葡萄糖将具有其产生的额外优势[1-13C] 乳酸，如果通过糖酵解途径代谢，由于乳酸共振将是单峰的，这将改善检测，也可以提供PPP活性的另一个评估，因为它们也会产生[1,2-13C] 如果通过PPP代谢乳酸。通过增加极化水平（此处达到约15%）和注射更高的葡萄糖浓度也可以提高灵敏度，尽管这可能仅在临床前研究中可行。
在线方法
细胞培养
小鼠T细胞淋巴瘤（EL4）和Lewis肺癌（LL2）细胞来自美国型培养物收集（ATCC）。EL4细胞生长到最大细胞密度约为5×107细胞mL−1在RPMI 1640培养基（Invitrogen）中添加2 mM L-谷氨酰胺和10%FCS（胎牛血清，PAA实验室）。LL2细胞在补充了4.5 mg mL的DMEM（Invitrogen）中生长−1葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺和10%FBS（胎牛血清，PAA实验室）。
动物制剂
实验是根据1986年《动物（科学程序）法案》颁发的项目和个人许可证进行的，并参照英国癌症研究联合指导委员会关于实验性肿瘤动物福利的指导原则进行设计。当地道德审查委员会批准了这项工作。
EL4细胞（5×106)将其重新悬浮在冰镇PBS中，并植入雌性C57BL/6小鼠体内(n个=40，6-8周龄；Charles River Ltd.）皮下注射，位于下腹部。LL2细胞植入（6×106)在一只动物身上。在这个位置，MR图像中没有检测到呼吸运动。当肿瘤生长到约2 cm时进行MRS三对于EL4肿瘤，植入后通常为10天。用67 mg足叶乙甙kg治疗前和24 h后对动物进行成像−1体重（Eposin，20 mg mL；PCH Pharmachemie），并通过吸入1–空气/O中2%异氟烷（Isoflo，Abbotts Laboratories Ltd.）2（75/25%，最小2 L−1)通过向磁铁孔吹入热空气来维持体温。实验期间监测呼吸频率（~80 bpm）和体温（37°C）（Biotrig）。通过尾静脉导管静脉注射超极化剂。
未经处理的高氯酸提取物(n个=15）和依托泊苷处理(n个=14）注射0.35 mL 100 mM[U后制备EL4荷瘤小鼠-13C] 葡萄糖。质子化葡萄糖用于避免因13C-2H联轴器。小鼠在20秒后死于颈椎脱位(n个=5，治疗；n个=5，未处理）或150秒(n个=4，治疗；n个=4，未经治疗），肿瘤和肝脏在液氮冷却钳中快速冷冻。另一个队列也做了类似的准备(n个=3，未经处理；n个=3，依托泊苷治疗），20秒后通过心脏穿刺取血。第三组在注射0.35毫升100 mM[1,2-13C] 葡萄糖(n个=3，治疗；n个＝2，未经治疗）并且肿瘤和肝脏迅速冷冻夹紧。使用7%高氯酸（1:8 w/v）制备高氯酸提取物，然后用KOH中和、冷冻干燥并溶解在99.9%的氧化氘中。
[U的超极化-2H、 U型-13C] 葡萄糖
用于EL4肿瘤的治疗反应研究和获取13LL2肿瘤、大脑、心脏、肝脏和肾脏、三烷基自由基（25.8 mM，OX063；GE Healthcare）、钆螯合物（2.6 mM，Dotarem；Guerbet）和[U-2H、 U型-13C] 将葡萄糖（3.55 M；剑桥同位素）溶解在50μl氧化氘中。加入氘代二甲基亚砜（25μl）以确保在固态下形成玻璃。对于剩下的实验，葡萄糖制剂进行了轻微修改（25.8 mM三烷基自由基、1.3 mM钆螯合物和3.55 M[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖溶解在130μl氧化氘中）。样品使用超感测偏振器（牛津仪器）极化120分钟，然后在180°C下与3 mL氘化盐水溶解，以分别产生100 mM和200 mM最终葡萄糖浓度。静脉注射前将样品冷却至约37°C。溶解时极化水平为~15%。
[1的超极化-13C] 丙酮酸盐
[1-13C] 将丙酮酸（43.5 mg）（Sigma-Aldrich Company Ltd.）、0.7 mg三烷基自由基OX063和1.2 mg 1:10钆螯合溶液置于超极化器中。将冷冻样品辐照1 h，然后溶解在含有100 mg L的溶液中−1乙二胺四乙酸（EDTA）、30 mM NaCl、94 mM NaOH和40 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）2在~180°C和~1 MPa时为0。
体内磁共振成像和光谱学
实验在一个7.0-T水平孔磁铁（瓦里安）上进行，使用了一个主动解耦的双调谐13C类/1H体积传输线圈（Rapid Biomedical）和20毫米13C接收器表面线圈（快速生物医学）放置在感兴趣的组织上。超极化[U-2H、 U型-13C] 静脉注射葡萄糖（0.35 mL 100 mM或0.4 mL 200 mM；注射管线的死体积约为50μl），持续3 s，并将动物置于磁铁内。开始注射后15秒开始数据采集，溶解和数据采集之间的总时间约为30秒。一系列频率选择13收集C光谱，从乳酸区收集四个光谱（1 ms正弦脉冲，翻转角度20°），然后从葡萄糖区收集一个光谱（翻转角度10°），并在40 s内重复序列。光谱宽度为4 kHz，收集到768个复合点，重复时间为0.2 s，回波时间为0.8 ms。在两只动物中，获得9个乳酸谱，然后获得1个翻转角度为10°（0.75 ms正弦脉冲）、重复时间为0.1 s、回波时间为0.45 ms、谱宽为6 kHz的葡萄糖谱。三只动物，两只13收集C化学位移选择性图像（视场32×32mm，重复时间30ms，回波时间0.8ms，光谱宽度6kHz，数据矩阵16×16，翻转角度5度）；第一个来自葡萄糖共振（注射后15s），第二个来自乳酸共振（注射之后25s）。包括尿素模型作为参考。注射超极化丙酮酸25 s后，在相同的动物中获得相同的化学位移选择性图像。数据覆盖在1H自旋回波参考图像（视场32×32 mm，数据矩阵128×128，重复时间1.8 s，回波时间20 ms，切片厚度2 mm）。
使用Matlab（MathWorks）分别汇总乳酸和葡萄糖光谱，并进行相位和基线校正。光谱参考了98.66 p.p.m时的葡萄糖C1碳。计算了整个时间过程中乳酸（183–187 p.p.m）和葡萄糖（60–100 p.p.m.）峰值积分的比值。未针对不同数量的13葡萄糖（6）和乳酸（1）中的C核也不存在翻转角度的差异。为了进行比较，还分析了数据采集的第一秒总和（四个乳酸谱，一个葡萄糖谱），并获得了类似的结果。用于测定表观葡萄糖T型1，信号积分拟合为单指数衰减函数。为了解释葡萄糖注射时可能出现的极化变化，使用初始葡萄糖信号强度对光谱进行标准化。
用于[1]的实验-13C] 静脉注射0.2 mL丙酮酸超极化溶液（75 mM），并在注射后15 s开始采集数据。使用与葡萄糖实验相同的采集条件，在光谱之间100ms的时间内收集一系列交替的切片选择性和非切片选择性光谱。通过肿瘤选择影像切片。对于一些实验，二氯乙酸（150 mg kg−1)在丙酮酸超极化前3分钟静脉注射。
高分辨率13C和1核磁共振波谱
高分辨率1H和1H解耦13肿瘤、肝脏和全血提取物的C NMR谱在14.1 T（25°C，pH 7.2）下使用Bruker 600 MHz NMR光谱仪（Bruker）和5 mm探针获得。收购条件为：1H、 90°脉冲；7.3 kHz频谱宽度；4.5秒采集时间；32k个数据点；64次瞬态；和12.5s的循环时间；13C、 30°脉冲；36.0 kHz频谱宽度；0.9s采集时间；32k个数据点；2048次瞬态；循环时间为14s。化学位移参考3-（三甲基甲硅烷基）-2,2′，3,3′-十四过丙酸（TSP，0.0 p.p.m.）。使用基于PC（英特尔迅驰平台）的核磁共振程序ACDSpecManager（ACD/Labs）分析光谱反褶积和多重态结构。在傅里叶变换之前，数据被零填充两次并乘以指数函数。相对于5 mM TSP共振积分，对所有NMR共振区域进行归一化。为了便于参考，高分辨率13C核磁共振谱是从[U-2H、 U型-13C] 葡萄糖溶液，使用与上述相同的采集参数().
统计分析
除非另有说明，否则结果表示为平均值±标准误差。使用Excel（Microsoft）和双尾Student’st吨-测试。
致谢
这项工作得到了英国癌症研究计划拨款（C197/A3514）和白血病与淋巴瘤协会授予K.M.B.的转化研究计划奖的支持。T.B.R.获得了欧洲内部玛丽·居里（FP7-PEOPLE-2009-IEF，成像淋巴瘤）和长期EMBO（EMBO-ALT-1145-2009）研究金。E.M.S.是玛丽·居里初始培训网络（Marie Curie Initial Training Network）下欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）奖学金的获得者METAFLUX公司（项目编号264780）。E.M.S.感谢Calouste Gulbenkian基金会、Champalimaud基金会、Ministerio de Saude和Fundacao para a Ciencia E Tecnologia，葡萄牙高等医学教育项目的教育支持。偏振器和相关材料由GE-Healthcare提供。作者感谢Ferdia Gallagher对偏振器的帮助。这是剑桥-曼彻斯特癌症成像中心的贡献，该中心由EPSRC和英国癌症研究中心资助。
脚注
作者贡献T.B.R.和M.I.K.设计了这项研究；T.B.R.、E.M.S.、B.W.C.K.、D.-EH.和M.I.K.进行了研究；T.B.R.和M.I.K.分析数据；T.B.R.、M.I.K.和K.M.B.撰写了这篇论文。
竞争性财务利益声明超极化器是从GE Healthcare借出的，是剑桥大学、英国癌症研究院和GE Health之间的研究协议的主题。
参考文献
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