I.简介
在全球范围内，乳腺癌是影响女性的最常见癌症(沃尔夫等。1996年). 如果寿命足够长，大约八分之一的女性会被诊断出患有这种疾病，在过去十年中，发病率每年增加2%(Feuer公司等。, 1993;沃尔夫等。1996年). 已确定的乳腺癌发展的危险因素包括月经初潮早期和更年期晚期(Kelsey和Berkowitz，1988年;斯内德克和迪亚古斯丁，1996年). 胎儿期大胎盘也与成年期乳腺癌的高风险相关(埃克波姆等。, 1995). 相反，青少年之后、35岁之前怀孕以及相关的哺乳期已被确定为预防因素(Kelsey和Berkowitz，1988年;斯内德克和迪亚古斯丁，1996年). 由于泌乳状态代表了人类乳腺分化的最终水平，因此重复的组织特异性分化期构成了一种生理机制，可以抑制一生中致癌和致癌事件的积累(俄罗斯等。, 1982;Snedeker和Diagustine，1996年). 如果这是真的，那么很容易推测，负责成熟、结构形成和组织特异性功能的信号可以整合起来，以抵消肿瘤的生长和进展，即使是在肿瘤细胞通常被认为超出正常细胞调节的晚期。换句话说，尽管肿瘤的发生被认为是多步骤遗传变异积累的结果(Klein和Klein，1985年;Bishop，1987年;温伯格，1989年)突变是公认的癌症研究范式(Bishop，1991年)，即使在肿瘤完全发育后，通过控制微环境向正常乳腺分化，是否仍有可能恢复表型？如果我们将分化视为受控行为、生长停滞、细胞运动极小、寿命有限和结构完整性的同义词，那么正如皮尔斯、比塞尔和其他人所假设的那样，这与癌症正好相反(比塞尔，1981年;皮尔斯和斯皮尔斯，1988年;祖特等。1995年;坎皮西，1996年). 当然，分化癌细胞的努力已经在实验和治疗层面上进行，并尽可能进行化学预防(野田，1993年;洛坦，1996年)，在血液肿瘤（如白血病）方面取得了合理的成功，对其造血成熟途径进行了详尽的研究(萨克斯，1996年以及本文中的参考文献）。
致癌基因和抑癌基因的突破性发现以及对乳腺癌生物学的总体新认识并没有同样好地转化为治疗(Sledge，1996年). 乳腺癌在组织学和生物学方面具有如此多样的表型，从大多数间变性到分化的管状癌，往往很难与良性病变区分开来，这一事实表明，乳腺癌具有固有的能力，表现出相当成熟的表型。在这里，我们认为微环境不仅是正常分化的积极参与者（参见)也是在癌症诱导和进展期间，以期找到治疗实体肿瘤的新途径(比塞尔，1981年;彼得森等。, 1992,1995;Rønnov Jessen，1996年;勒诺夫·杰森等。1996年;织布工等。, 1997).
图示细胞在生长、死亡和分化之间的三角形中的正常表型。细胞外基质（ECM）被认为通过整合素介导的信号传导发挥重要作用。
与低分化肿瘤相比，高分化肿瘤的预后显著好于低分化肿瘤，这一事实支持了分化状态确实是治疗的相关终点(塔瓦尔等。1996年). 这本身并不是一个新颖或令人惊讶的发现。多年来，人们经常发表这些声明。因此，这一领域有什么新特点？首先，肿瘤的可塑性得到了更好的证明。现在有证据表明，在外源性因子（如肝细胞生长因子）的刺激下，原本具有凝聚力的分化肿瘤细胞会暂时变得更具攻击性(伯奇梅尔和贝伦斯，1994年)另一方面，非黏附性侵袭性细胞可能会被胰岛素样生长因子I、橘红蛋白、维甲酸和三苯氧胺等逆转(布拉克等。1996年). 换句话说，即使对上皮性癌来说，侵袭和转移也不是单向发展阶梯上不可逆转的下一步。第二，粘附分子和细胞外基质通常被认为是正常和恶性表型的重要调节剂(彼得森等。, 1992;布拉克等。1996年;琼斯等。1996年;Varner和Cheresh，1996年;织布工等。, 1997). 第三，我们现在知道，随着肿瘤的发展，周围的基质细胞被广泛招募，以传递类似于慢性伤口的微环境条件的形成，其含义才刚刚开始被了解(克拉克等。, 1995;勒诺夫·杰森等。1995年,1996以及其中的参考文献）。因此，基质细胞被认为是没有基因型畸变的（尽管这在未来可能需要进一步研究），积极促进肿瘤的发展和进展，因此，瘤周成纤维细胞可能在未来调控肿瘤行为的尝试中发挥作用。
二、。乳房分化标志
A.形态学
人类的乳房纵向分为主要导管（乳管），其中有10至12个，每个导管的末端都在乳头、分叉的小叶间导管和末端导管小叶单位，也称为肺泡（有关综述，请参阅勒诺夫·杰森等。1996年). 每个肺泡是妊娠和哺乳期间进一步形成腺泡的来源(巴特斯比和安德森，1988年). 因此，人类腺泡不是像老鼠一样在每次怀孕时从出芽的导管重新形成的，而是通过现有肺泡的扩张和增殖而形成的(弗格森和安德森，1983年). 与小鼠相比，这使得在人类中寻找“干细胞”的可行性降低（见下文）。然而，通过人类或小鼠乳腺导管或肺泡的横切面显示出相同的基本结构，即内层连续的腔上皮（腺）细胞和外层或多或少连续的肌上皮细胞(勒诺夫·杰森等。1996年). 这种基本模式的存在与腺体的泌乳状态无关(梅村等。1996年). 管腔上皮细胞和肌上皮细胞之间的相互关系仍然是一个谜。基本上，它们起源于同一发育起源——外胚层。然而，假设由于其基质样表型，肌上皮细胞来源于间充质细胞是一种误解。与真正的基质细胞相反，这些细胞总是位于基底膜的上皮侧，迄今为止，很少有公开的证据表明基质细胞向上皮细胞的转化可以解释它们的发生体内(Deugner公司等。, 1995).
我们建议，乳腺作为双层管的精确结构组成必须被视为组织的最终层次。到目前为止，还不可能在生物体外建立这种结构的模型，因此我们不知道这对于癌症发展过程中维持功能或缺乏功能有多重要。有证据表明，肌上皮细胞在组织重塑和静息状态下可能具有两种相反的功能。在前者中，它们为基质中出现的小管铺平了道路，这与它们表达多种蛋白酶的事实一致(尼兰扬等。, 1995). 在静息状态下，肌上皮细胞或其产物可能有助于维持管腔细胞或管腔衍生癌细胞的分化，因此可能引发“抑瘤”功能(巴尼等。, 1994;线路接口单元等。1996年).
显然，肌上皮细胞在大多数物种的浸润性乳腺癌中完全缺失或分化程度较低(拉德兰等。, 1995). 这里基底膜丢失，癌细胞表达管腔上皮细胞而不是肌上皮细胞的标记物（有关综述，请参阅勒诺夫·杰森等。1996年). 那么，即使从理论上来说，如果癌细胞可能是由预先确定的管腔上皮细胞产生的单克隆癌细胞，那么相信癌细胞及其后代可以一直还原为双层管，这有意义吗？
在寻找任何组织中癌症的细胞起源时，了解谱系的进化被认为是重要的。如上所述，问题在于，由于我们对管腔上皮细胞和肌上皮细胞之间的精确相互关系知之甚少，因此很难找到“预先确定的”管腔上皮细胞，假设这种细胞存在(勒诺夫·杰森等。1996年). 在小鼠乳腺中，人们认为，导管中出芽的上皮索端芽含有干细胞(威廉姆斯和丹尼尔，1983年). 端芽由两种上皮细胞组成：外层为帽细胞，内部为实体细胞团。通过延时视频显微镜和胸腺嘧啶核苷标记观察生长终芽的动力学，有报道称，基底帽细胞通过沿对向导管的成熟产生肌上皮细胞以及体细胞，它们通过迁移到上皮细胞的中央索而组成后期管腔上皮细胞(威廉姆斯和丹尼尔，1983年;杜尔贝科等。, 1982). 因此，帽细胞被认为具有干细胞样的特性，这与它们的低分化水平非常吻合。因此，在小鼠中，导管的完全发育的肌上皮细胞可能来源于末端芽中的帽细胞，尽管这里也缺乏确切的证据。过渡性表型位于小叶间导管，被称为具有中等分化水平的基底细胞(Sonnenberg公司等。, 1986). 人们曾多次尝试将这些结果外推到人类乳房上，但没有确凿证据表明人类乳腺中存在终芽或帽细胞。假定的细胞等效物，即所谓的透明细胞，已经在整个腺树中发现（综述见勒诺夫·杰森等。1996年). 新的数据表明，人类乳腺癌实际上广泛表达了最专属性的肌上皮标记物，即催产素受体，这表明癌细胞可能比以前认为的更具有沿着这一谱系分化的能力(布索拉蒂等。1996年). 此外，乳腺癌细胞通过分化和生长抑制对催产素产生反应，这表明在检测乳腺癌分化时也应考虑肌上皮表型(卡索尼等。1996年).
为了澄清关于人类乳房中假定干细胞的形态和存在的讨论，净化不同谱系和再生双层导管/肺泡的措施将非常有用。
B.雌激素受体
如果要了解癌细胞的起源以及它们与正常细胞的关系，另一个需要解决的特征是雌激素受体（ER）状态。根据标准组织培养分析，提取正常和恶性条件下内质网功能的敏感信息一直是一项艰巨的任务(Bissell和Werb，1995年). 事实是，如果用生化方法测量，雌激素受体在大约60%的乳腺癌中表达，但在正常乳腺组织中几乎无法测量(里基茨等。, 1991;汗，1995年). 根据这个定义，ER阴性癌应该是分化程度最高的肿瘤，在这方面，它们与正常组织最相似！当然，情况并非如此。相反，组织病理学和临床试验的所有证据都指向相反的情况：ER的适度表达与形态分化肿瘤和更好的生存率相关(塔瓦索利和曼，1995年;乔斯林等。1996年). 因此，ER阳性乳腺癌细胞似乎是一个相对分化的细胞。此外，如果人们接受正常乳腺组织基本上没有雌激素受体，那么雌激素受体阳性癌就必须来自类似于畸胎瘤的多能干细胞(Sell和Pierce，1994年). 然而，一旦免疫细胞化学分析可用，人们发现原始生化ER分析的灵敏度太低，无法测量正常乳腺组织中ER的表达水平(彼得森等。, 1987;汗，1995年). 通过该分析，发现还原乳房成形术后正常乳腺组织中的表达水平平均为腔上皮细胞的7%，基质中没有受体表达(彼得森等。, 1987;汗，1995年). 基于对小鼠的研究，先前曾假设基质中的ER向上皮发出信号。然而，这些研究是用背景过高的标记配体进行的(安德伍德，1983年). 最近关于小鼠的数据与人类研究的数据一致，因为目前已知基质确实为ER阴性或弱ER阳性(哈斯拉姆和希亚马拉，1981年;哈斯拉姆和努米，1992年;萨皮诺等。, 1993).
如果乳腺癌是以随机方式在上皮内发生的，初始ER水平约为7%，那么令人困惑的是，多达60%的肿瘤是ER阳性的。一种可能性是，如果由一种可能在恶性肿瘤早期起作用的未知机制“激活”，则至少60%的乳腺上皮细胞可以启动ER。7%也可能是所有乳腺上皮的平均值(彼得森等。, 1987). 因此，里基茨等。（1991年）据报道，整个细胞池可分为非表达型或低表达型和高表达型。因此，另一种可能性是，尽管高表达蛋白仅占正常细胞总数（16%）的一小部分，但它们可能具有明显更高的患乳腺癌的风险，因此占ER阳性肿瘤的60%。在这方面，有趣的是，ER阳性率高达80%就地而ER在与浸润性癌相关的病变中表达最高。然而，一旦出现ER阳性肿瘤，由于选择了“分化程度较低”的ER阴性细胞，ER的表达会随着进展而逐渐消失(罗伯逊，1996年).
从裸鼠实验性癌症中收集到的大量信息，让人对ER表达作为一种分化特征的认识有些困惑。这里，雌激素的作用类似于肿瘤促进剂，因为雌激素受体阳性的肿瘤细胞不会发展成肿瘤，除非雌激素由小鼠或通过饮食外源性提供(Soule和McGrath，1980年). 这一点，以及雌二醇增加小鼠和大鼠乳腺肿瘤发病率的事实(斯内德克和迪亚古斯丁，1996年)，提出了一个有趣的问题，即雌激素是否对正常细胞起致癌作用(汗，1995年). 这个问题在生理环境中很难回答，因为正常乳腺上皮细胞——如上所述——在ER表达方面绝对不应被视为均质群体。这张图片仍然令人困惑，因为到目前为止，还没有人在实验条件下成功地保持ER表达(勒诺夫·杰森等。1996年). 因此，了解如何在培养的“正常”细胞中维持ER仍然是未来的主要挑战。
克服在短期培养中维持ER阳性正常细胞困难的一种方法是将ER转染到已建立的正常乳腺上皮细胞系中(扎乔夫斯基等。, 1993). 令人惊讶的是，在这些细胞系中，对雌激素的反应与短期培养中观察到的肿瘤细胞和正常细胞的反应正好相反；事实上，它们的生长受到抑制(扎乔夫斯基等。, 1993). 我们的一个实验室用ER构建体转染了一个自发永生化的、本质上ER阴性的乳腺上皮细胞系，并获得了相同的实验结果，即细胞确实受到了生长抑制(伦多尔特等。1996年).
从这些实验中，我们面临的问题是，正常转染细胞中的反常反应是由于这些细胞与ER-阳性肿瘤细胞本质上不同，还是转染受体缺乏通常提供生长信号的额外序列。不幸的是，后者可能是正确的答案，因为如果以类似的方式转染明显恶性、ER阴性的乳腺癌细胞，它们的行为也与正常转染细胞相似，也就是说，它们的生长受到雌激素的抑制(利文森和乔丹，1994年;彼得兰杰利等。, 1994). 因此，似乎可以合理地得出这样的结论：转染一个明显有功能的内质网，引发所有可以用生物化学方法测量的下游事件(伦多尔特等。1996年)与未转染细胞系相比，不会引起相同的基本生长反应。因此，在肿瘤发展过程中，关于正常内质网功能和谱系进化还需要了解更多。这意味着我们还必须了解如何在正常乳房中维持组织特异性基因表达，即我们必须解剖微环境控制的要素(Bissell和Barcellos-Hoff，1987年).
C.整合素
上皮细胞组织成分支导管和肺泡取决于各种可溶性因子的作用、细胞与细胞、细胞与ECM的相互作用以及上皮极性的建立。上皮细胞膜被分离成由紧密连接分隔的特殊顶端和基底外侧结构域，细胞骨架被组织成终止于连接复合物的纤维和面向基底膜的跨膜整合素异二聚体(泰勒-帕帕迪米特里奥等。, 1983;伊顿和西蒙斯，1995年). ECM受体中最大的一类，即整合素，是目前已知的细胞天线，它可以感知ECM的细微之处，并将微环境的化学物质转化为亚细胞信号，然后将其转化为形式和功能。正常人乳腺上皮细胞至少表达两种β-整合素（β1和β4）和四种α-整合酶（αl，α2，α3，α6）(Bergstraesser和Weitzman，1994年;格鲁霍瓦等。, 1995). 乳腺癌中整合素的表达通常在数量和/或质量上发生改变(祖特等。1990年;梅赫特斯海默等。, 1993). 根据它们在正常和恶性条件下的配对和假定功能，整合素将被描述为（1）正常乳腺中的α6β4，（2）乳腺癌中的α5β4，以及（3）正常乳腺和乳腺癌中β1整合素。
1.正常乳房中的α6β4
由于缺乏相关抗体，α6β4整合素作为二聚体在人类乳腺中的表达直到最近才被详细分析。然而，当在正常乳腺中单独研究时，β4和α6主要由肌上皮细胞表达(伯迪切夫斯基等。, 1994). 这并不奇怪，因为α6β4通常由基底细胞表达，例如皮肤或支气管树中的基底细胞(卡特等。, 1990;Sheppard，1996年). 对于管腔上皮细胞，通常认为β4整合素在细胞膜的基底外侧表面表达体内试验。然而，在光镜水平上，很难确定观察到的β4整合素染色是来自肌上皮细胞还是管腔细胞(库库利斯等。, 1991;娜妲莉的情人等。, 1992). 关于α6-整合素，对于管腔上皮的表达模式还没有明确的共识。它被描述为严格限制在基底细胞表面(娜妲莉的情人等。, 1992)侧膜也有不同表达(梅赫特斯海默等。, 1993)或在整个细胞表面均匀表达(弗里德里希斯等。, 1995). 除了β4整合素外，α6还与β1整合素配对，因此α6整合素的亚细胞分布明显更广(Sonnenberg公司等。1990年). 然而，重要的是要认识到，如果β4整合素存在，α6整合素将优先与β4整合素配对(克雷斯等。, 1995;斯科恩伯格等。, 1994). α6β4配对导致基底膜形成稳定的锚定接触或半桥粒，这是典型的极化静息细胞，很少或没有运动行为(卡特等。, 1990;克雷斯等。, 1995). 细胞的静止状态很可能是通过β4介导的p21/WAFl/CIPl的诱导发出的，p21/WAFl/CIPl是细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂(克拉克等。, 1995). 这与正常情况下的肌上皮细胞实际上是非循环的这一事实很吻合(勒诺夫·杰森等。1996年). 正如这些研究所预期的那样，p21/WAFl/CIPl在正常条件下至少偶尔在一些肌上皮细胞中表达(巴尔巴雷斯基等。1996年).
3.正常乳腺和乳腺癌中的β1-整合素
ECM及其受体具有信息和直接组织特异性形式和功能的假设是在十五年前提出的(比塞尔等。, 1982). 这一点在许多组织中都得到了充分的证明，尤其是啮齿动物的乳腺和最近的人类（有关综述，请参阅亚当斯和瓦特，1993年;Lin和Bissell，1993年;Hay，1995年;罗斯凯利和比塞尔，1995年;勒诺夫·杰森等。1996年;比斯尔，1997年). β1-整合素已被证明参与调节乳蛋白基因表达(斯特雷利等。, 1991)以及细胞凋亡(霍利特等。, 1995;布德劳等。, 1995). β1-整合素敲除对胚胎具有致死性(Fassler和Meyer，1995年;斯蒂芬斯等。, 1995). 1994年，Matlin和合作者(斯科恩伯格等。, 1994)提出了一个富有想象力的假设，即如果表型，在法庭上形态发生只应定性地依赖于细胞表面整合素的表达，那么微小的变化就不重要了。另一方面，如果一个正确的表型取决于各种整合素在质膜上的精确平衡，那么单个整合素的相对数量的变化将是相当显著的(斯科恩伯格等。, 1994). 由于α6整合素可能与β4以及β1配对，并且α6和β4之间的比率似乎随着癌症的发展而增加，因此了解癌细胞中β1的水平和位置发生了什么变化就变得至关重要(织布工等。, 1997). 该方程还需要包括α2和α3，这两个整合素亚基与β1相容。
在细胞表面的β1伙伴竞争中，有报道称α2战胜α3，α3反过来又战胜α6，但非转化细胞的细胞表面通常有过量的β1(斯科恩伯格等。, 1994). 在正常人乳腺中，α2-整合素在管腔和肌上皮细胞的基底外侧细胞表面均表达良好，而α3在管腔上皮细胞中稍弱(库库利斯等。, 1991;格鲁霍瓦等。, 1995;Taylor-Papadimitriou和Alford，1995年). 观察mRNA表达（信息量不大）和至少一种蛋白质染色情况，α2显示出与α3相同的趋势，即与管腔上皮细胞相比，肌上皮细胞的表达略高(库库利斯等。, 1991;祖特等。, 1993). α2和α3在细胞-细胞连接处以及细胞-ECM连接处的表达反映了它们在指导形态发生和维持细胞生存方面的假定功能(伯迪切夫斯基等。, 1994;霍利特等。, 1995).
据报道，在大约50%的乳腺癌中，α2-整合素缺失或接近缺失(梅赫特斯海默等。, 1993;Taylor-Papadimitriou和Alford，1995年). 此外，约40%的乳腺癌显示α3水平降低或缺失(梅赫特斯海默等。, 1993). 相比之下，β1-整合素在蛋白水平上的下调幅度并不相同，在一份报告中，大多数癌症中未发现下调(梅赫特斯海默等。, 1993;祖特等。, 1993). 因此，方程式可以得出如下结论：与正常细胞相比，乳腺癌中的α6与β1有配对的空间，β4很少或没有，α2和α3显著减少，可用β1。这与报道的α2β1与α6β1在约50%的乳腺癌中的相互表达非常吻合(奥达等。, 1994). α6β1表型是乳腺癌一种组织学变体的特征，即浸润性小叶癌，其形态分化很小(库库利斯等。, 1993). 该方程的结论与前列腺癌的观察结果相一致，前列腺癌的α6β4通路基本上被绕过，而α6β1通路被绕过(克雷斯等。, 1995). 这一观察的生物学意义应该与细胞迁移和转移的能力有关。α6β4与稳定的锚定接触有关，而α6β1与细胞突起处的焦点接触共定位(Cress公司等。, 1995;库库利斯等。, 1991,1993). 在这方面，有趣的是，非恶性HBL-100乳腺上皮细胞虽然明显不正常，但几乎只表达α6β4，而高度恶性乳腺癌细胞系MDA-MB435则显示相反的结构。事实上，α6β1显性阴性敲除可显著降低后者的侵袭表型[比较Sonnenberg公司等。(1990)具有肖等。(1996)]. 据报道，结肠癌细胞系中存在一种相关现象，即从致瘤性较差的变异发展为侵袭性更强的变异，主要与β1的增加和β4整合素表达的平行减少有关(Lopez-Conejo公司等。1996年). 然而，重要的是要认识到，β1相对于β4整合素本身的变化可能不足以触发异常表型。在这方面，很有趣的是，在大多数癌症患者的非受累乳腺组织水平上，β1和β4整合素比率的肿瘤样改变已经非常明显(琼斯等。, 1992). 细胞表面整合素相对比率在确定正常和恶性细胞表型中的重要性最近在我们的实验室进行了测试，下面将进行更详细的讨论(织布工等。, 1997).
III、 乳腺分化的培养模型
所有癌症生物学，实际上所有生物学，都依赖于特征鲜明的模型系统。当处理人类细胞时，唯一的选择是移植相关细胞，并开发旨在回答特定问题的培养分析。经典癌症研究得益于单层培养对永生、转化和进展的检测(内特斯海姆和巴雷特，1985年;哈里斯，1987年). 然而，对于上皮细胞，这些检测并不能测量鳞状化生水平以外的分化(比塞尔，1981年;马苏等。, 1986). 形态分化似乎需要更精细的模型系统。
A.基底膜（EHS）分析
我们已经寻找了一套标准来定义培养的人类乳腺上皮细胞的安全“正常”或“接近正常”，而不考虑肌上皮细胞的复杂性，直到我们对它们有了更多的了解。类似于小鼠乳腺上皮细胞(Barcellos-关闭等。, 1989;阿格勒等。, 1991)当正常的腔上皮细胞与生理相关的重建基底膜（EHS；Matrigel，Collaborative Research）接触时，显示出与肌上皮细胞基底层的存在无关的许多正常特征。首先，他们迅速（在7-10天内）形成一个近乎完美的腺泡状球体(彼得森等。, 1992). 其中一些结构很可能是克隆的，因为它们之前有一个初始生长爆发，一旦达到最终尺寸（<50µm），生长爆发几乎为零。生长停滞不是次优培养条件的结果，因为相同的培养基很容易支持单层培养中类似细胞的生长或EHS中肿瘤细胞的生长(彼得森等。, 1992). 第二，切片时，这些结构包含真正的腺泡，中央管腔由顶端细胞膜和细胞核位于基底的细胞形成。生长停滞与腺泡形成同步。我们确定球体赤道部分的平均细胞数约为8个，因此与腺泡中的细胞数相似体内由于乳腺分化的一个重要指标是以正确的方式极化细胞轴的能力，我们对细胞进行染色，以获得完整的顶端特异性蛋白唾液酸，以及基底膜成分IV型胶原。这两种蛋白的定位与腺泡中的定位相似体内，即细胞-ECM连接处唾液酸的顶端沉积和IV型胶原的基底沉积(彼得森等。, 1992). 有趣的是，之前在胶原培养物中发现Madin–Darby犬肾（MDCK）细胞的最终球体尺寸（50µm）、聚集细胞数量（~8）、初始生长爆发、生长停滞前的时间（7天）以及顶端腔形成和基底外侧IV型胶原沉积，这意味着这些是相关三维结构存在时的基本上皮和腺体行为(王等。, 1990). ER-阴性上皮细胞在基底膜基质中培养时能够形成几乎正常的腺泡，这一事实表明，在培养中发生这种现象既不需要ER表达，也不需要肌上皮细胞，而且EHS基质和培养的管腔乳腺细胞的特性正在补偿对于存在的其他单元格类型体内(彼得森等。, 1992;勒诺夫·杰森等。1996年).
类似啮齿动物模型(麦地那等。, 1987;施密达用户等。, 1990;Lin和Bissell，1993年)ECM对人类乳腺上皮分化的影响并不局限于寿命有限的新鲜移植原代培养物。相反，来自良性乳腺病变的两种非恶性但永生的细胞系（MCF-10A和HMT-3522）基本上以相同的方式反应，即腺泡样形成和生长停滞。虽然我们的检测是在无血清培养基中进行的，以获得正常行为，但其他人也报告了使用MCF-10A的类似数据，即使在培养基中含有血清(巴索洛等。1996年). 一种相关的检测方法也基于三维培养，但在I型胶原而不是重建的基底膜中，已用于检测人类乳腺上皮细胞(贝尔迪切夫斯基和泰勒-帕帕迪米特里奥，1991年;希勒等。, 1992). 然而，与MDCK细胞的研究结果相反，该试验没有足够的线索正确极化乳腺上皮细胞，也没有足够的证据表明乳腺上皮细胞沉积内源性基底膜(霍利特等。, 1995;卢等。, 1995). 因此，基底膜（EHS）检测似乎是第一种能够在培养中重现正常乳房关键方面的检测。
随着人类乳腺细胞EHS检测方法的建立，为快速识别差异行为的细微偏差铺平了道路。因此，在7至12天的同一时间段内，“正常”细胞形成腺泡，HBL-100细胞形成分散的小集落，活检或已建立的细胞系中的肿瘤细胞形成不规则的大细胞簇，没有生长停滞，沉积基底膜，或正确极化以应对EHS(彼得森等。, 1992,1995;霍利特等。, 1994,1995). 因此，正如预测的那样，肿瘤细胞无法正确地感知ECM，这与我们的假设一致，即正确响应ECM的能力是一类新的“抑制基因”的功能，当细胞变为恶性时，这些基因会丢失或改变(彼得森等。, 1992). 这种对ECM的反应差异巨大的原因可能在于ECM、整合素、细胞骨架、核基质以及基因本身的缺陷(Bissell公司等。, 1982)并且不需要依赖于不同肿瘤细胞中的相同基因缺陷。我们对EHS中“正常”和“恶性”人类乳腺癌细胞的不同行为的初步观察得到了其他人的证实(希勒等。, 1992;Bergstraesser和Weitzman，1993年). 自那时以来，人们观察到EHS对正常细胞和癌细胞的形态发生作用，使EHS成为一种比软琼脂分析更敏感的分析方法，用于预测裸鼠体内细胞是否致瘤(巴索洛等。1996年). 此外，EHS试验不仅有助于揭示正常行为，而且比软琼脂试验更好地支持癌细胞的生长(原始数据等。1996年).
为了验证该试验能够揭示可能的抑癌基因的假设，我们测试了稳定转染抑癌基因NM-23H1/NDP-激酶的高度恶性MDA-MB435乳腺癌细胞的行为(塞拉利昂等。, 1993). 在EHS检测中，新转染的对照细胞表现出与其他乳腺癌细胞相似的行为，而NM-23转染的细胞表现出改变的形态和生长以及基底膜的极化沉积(霍利特等。1994年). 特别是，与继续生长的新转染细胞相比，它们的最终尺寸约为50µm。将这些发现归因于这种特定肿瘤抑制基因的特定功能太天真了，因为在EHS试验中，同样的细胞系转染了另一种基因，即新型H-钙粘蛋白，获得了类似的数据(Lee，1996年)根据我们的定义，它也可能被视为肿瘤抑制因子。相反，这些数据共同表明了这样一个事实，即只要表型的某些方面可以得到补偿，导致初始损失的确切错误就不需要纠正。数据还表明，结构重组如果成功施加在细胞上，是一种非常强大的表型调节器，可以导致基底膜和极性的重建，即使没有角蛋白和钙粘蛋白等关键上皮标记物，这些标记物在MDA-MB435细胞中永久丢失(皮尔塞尔等。, 1995).
B.HMT-3522乳腺癌发展的上皮细胞系
多年来，我们对早期恶性病变的所有理解都依赖于SV-40转染或苯并[一]芘处理正常人培养细胞(张等。, 1982;斯坦普弗和巴特利，1985年)（有关审查，请参阅勒诺夫·杰森等。1996年;织布工等。1996年). 一般来说，人类细胞在培养物中不会发生啮齿动物细胞常见的自发转化。人工生成的恶性细胞从一开始就具有很强的侵袭性，因此不能被视为代表癌症的早期阶段。克服正常人类细胞自发转化问题的尝试包括从良性病变中可能产生的已建立的细胞系，这些良性病变假定在移植前已经发生并永生(保利等。, 1993). 在两个案例中，成功地从人类乳房中建立了这种“自发”的不朽细胞系。最初，我们的一个实验室在化学定义的培养条件下生成HMT-3522 S1细胞系(布赖恩等。, 1987)来自一个患有纤维囊性疾病的人。后来，从类似来源制备了不同的分离物，但培养基中含有血清（MCF-10A）(索勒等。1990年). 这两种细胞系具有相似的特征，即在很高的传代数下是非恶性的，并且在早期传代中很少出现染色体畸变。显然，它们为生成恶性进展的模型系统奠定了良好的基础。我们主要关注HMT-3522细胞系。首先要解决的问题是，它们是否会自发发展为恶性状态。细胞在明确的培养条件下保存10年以上，传代500代以上。这里值得一提的是，大多数SV-40-永生化细胞在第100代左右变为恶性细胞(勒诺夫·杰森等。1996年). 然而，在这些非外源性暴露细胞中没有记录到致瘤性迹象。有趣的是，这些细胞的核型发生了很大变化，以至于后来的传代都是非整倍体。然而，它们仍然不会致癌(Vang Nielsen公司等。, 1994). 这与最近的研究结果相关，即早在乳腺肿瘤明显恶性之前，就已经在其中发现了非整倍体(里尔等。, 1995;泰西拉等。, 1995). 值得注意的是，另一种自发永生的人类乳腺上皮细胞系MCF-10A与HMT-3522相似，即使在高代也缺乏致瘤性。
人们普遍认为，生长自主性是癌症发展多步骤过程中定义明确的癌前步骤。在合理的时间范围内没有自发转化的情况下，HMT-3522细胞通过从第120代化学定义的培养基中删除该细胞因子而被迫成为EGF/两性调节蛋白的自主细胞(马德森等。, 1992). 经过这种处理，细胞在培养瓶上相对不受影响，但在几周内没有进一步生长(布赖恩等。1996年). 在这个潜伏期之后，在一到两段时间内，增长以一种集体的方式开始，从缓慢增长到更常见的速度。除了EGF自主外，这些生长在组织培养塑料上的品系（称为S2）没有进一步转化的明显迹象，因为它们在裸鼠中仍然不致肿瘤。然而，在无EGF培养基中培养118代后，这些细胞突然产生肿瘤，从其中一个肿瘤中移植的细胞命名为HMT-3522 T4-2。这种表型的自发变化与7号染色体的超短臂（7p三体）的获得相吻合，这是唯一明显的可检测到的核型变化。然而，最近通过比较基因组杂交（与Joe Gray和Dan Pinkel实验室的合作研究；织布工等。, 1998). 通过解冻早期传代的冻存物，并通过裸鼠接种，密切跟踪其通过关键传代，显示出该转化在第238代中是可复制的(布赖恩等。1996年). 换言之，我们现在已经成功地在同一细胞系内形成了一个可控的进展序列，并且没有施加任何额外的破坏稳定的外源性转化步骤。其他在单个细胞系内进行进展系列的尝试包括至少一种促进转化的额外措施(保利等。, 1993). HMT-3522系列为我们提供了一个独特的机会，在没有正常和恶性细胞系之间巨大差异引起的常见“噪音”的情况下，专注于转化相关表型。
首先需要立即澄清的一个问题是，从S1、EGF依赖性到S2、EGF-非依赖性到致瘤性T4-2的序列是否可以在我们的重组基底膜内的分化分析中得到充分解决。事实上，所有S1传代都表现正常，如上所述，形成了小的腺泡状结构(彼得森等。, 1992;织布工等。, 1998). 然而，更有趣的是，不仅T4-2，S2也偏离了这种行为，并表现出自己特有的异常表型。如中所示S2中至少有一个群体形成了比S1细胞形成的细胞大很多倍的大细胞球。另一方面，T4-2形成了具有不规则边界的中等大小的集群，并扩散到基质中(). 此外，在凝胶切片和内源性基底膜染色中，S1细胞在细胞与ECM交界处按预期染色成一条连续线，S2细胞几乎呈阴性，T4-2簇通常没有极化或相反极化，但染色为IV型胶原().
EHS分析中HMT-3522系列的形态特征。S1细胞（A）、S2细胞（B）和T4-2细胞（C）在EHS内电镀并在无血清条件下培养12天的相控显微照片。“正常”S1细胞形成典型的腺泡状球体，而“良性”S2细胞的一个亚群形成类似增生的大簇，T4-2细胞形成较小的不规则集落，部分细胞渗入EHS，类似于入侵（C中的箭头）。放大倍率，×90。棒材=100µm。
HMT-3522系列基底膜沉积特性。S1细胞（A）、S2细胞（B）和T4-2细胞（C）的冷冻切片的显微照片，免疫过氧化物酶染色人类IV型胶原并用苏木精复染。请注意，尽管S1细胞沉积了几乎连续的基底膜，但S2细胞却没有沉积基底膜。T4-2细胞沉积了一层杂乱的无极基膜。放大倍数，×150。棒材=100µm。
S2细胞显然不形成自己的基底膜，而是不断增殖，这一事实与它们被归类为良性增生相一致。因此，S2细胞类似于角蛋白K19阴性的良性增生上皮(勒诺夫·杰森等。1996年). T4-2细胞明显地重新表达IV型胶原，尽管是以一种不协调的方式，这是乳腺癌的先例体内，如前所述。因此，一些浸润性癌实际上会在细胞质中染色基底膜（BM）成分，或作为形成BM的失败尝试。乳腺癌中的BM染色被认为是一种分化特征，与更好的预后相关(阿尔布雷希森等。, 1981;娜妲莉的情人等。, 1992). 此外，BM染色是早期就地因此，将衍生的T4-2细胞系归类为早期癌细胞系或分化癌并非不合理。因此，与现有的乳腺癌细胞系相比，T4-2可能更受调节性微环境线索的影响，因此是进一步探索可能的分化治疗或逆转研究的极好模型。
C.恶性HMT-3522-T4表型的逆转
将T4-2细胞系与我们先前测试的乳腺癌细胞系明确区分开来的一个显著特征是T4-2的细胞表面β1-整合素的明显表达[比较霍利特等。(1995)和织布工等。(1997)]. 因此，我们在先前描述的试验中使用了这种新细胞系，旨在确定β1-整合素在正常细胞与肿瘤细胞形态发生中的作用。这无法在之前测试的肿瘤细胞系中进行测试，因为它们不含太多β1(霍利特等。, 1995). T4-2系对β1-整合素抑制抗体的反应令人惊讶，它形成了规则的球状结构，偶尔有中央管腔(织布工等。, 1997)：他们在实验期内表现出生长停滞，与我们在无抗体的非恶性S1系中记录的情况类似(彼得森等。, 1992;霍利特等。, 1995;韦弗，等。, 1997). 腺泡数量的量化显示，几乎所有的细胞实际上都被处理后恢复了，在培养10-12天后基本上没有留下不规则的细胞簇。胸腺嘧啶掺入和细胞周期蛋白D1表达也证实了生长停滞的真实性。此外，内源性IV型胶原的切片和染色显示，与我们在S1细胞中观察到的情况类似，细胞-ECM连接处的BM具有明显的组织化和极化。形态、增殖和极化逆转也与细胞骨架的重组有关。因此，尽管未处理或模拟处理的T4-2细胞显示肌动蛋白、E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的扩散染色，但β1-整合素抗体处理的细胞将这些分子极化到细胞-细胞连接处(; 见色板）(织布工等。, 1997). 事实上，S1细胞和经β1-整合素处理的T4-2细胞的差异仅在于后者除了在细胞-细胞连接处染色外，在细胞-ECM连接处还染色了β-catenin和E-cadherin(). 此外，与S1细胞相比，在根尖表面观察到的管腔很少。最后，我们在我们的培养观察结果和裸鼠的传统致瘤性之间建立了联系，β1整合素处理的T4-2细胞比模拟处理的对照细胞产生的肿瘤明显更少和更小(织布工等。, 1997).
β1-抑制性抗体治疗肿瘤细胞可导致腺泡回复。（A–A〃）F-actin的共焦荧光显微镜图像。S1（A）和T4-β1回复的腺泡（A〃）均显示出基础定位的细胞核（碘化丙啶）和有组织的丝状F-actin（FITC），而T4-2模拟处理的菌落（T4-2 IgG）则有无组织的、孵化的肌动蛋白束和多形核（A′）。（B–B〃）E-钙粘蛋白（FITC）和β-连环蛋白（德克萨斯红）的共焦免疫荧光显微镜图像：在S1（B）和T4-β1回复的腺泡（B〃。复制自织布工等。, (1997).《细胞生物学杂志》。
137第231-245页，经洛克菲勒大学出版社许可。
由于T4-2细胞的行为几乎可以通过β1-整合素的抑制性抗体完全纠正，因此与S1细胞相比，很容易将此系统中的恶性表型转化为β1-整合素在细胞表面的过度表达。因此，在总蛋白和生物素标记的表面蛋白的免疫印迹上测量β1-整合素的表达水平。在这两种情况下，T4-2细胞中的β1-整合素水平均高于S1细胞。因此，如果β1-整合素抗体的作用可以真正归因于信号通路的特异性阻断，并且没有选择细胞，那么我们有确凿的证据证明这种整合素在戏剧性逆转中的作用。
使用其他抗β1整合素的抑制性抗体和一种β1整合素刺激性抗体进一步测试功能阻断的特异性。后者没有抑制。此外，还生成Fab片段来区分受体聚集和信号抑制。Fab片段和完整抗体都受到抑制。最后，我们可以排除对可能污染的S1细胞的选择，因为用抗β1整合素处理的和模拟处理的细胞重新移植到单层并重新嵌入EHS的重复周期表明，“恶性”和“正常”表型是可逆的(织布工等。, 1997).
先前研究表明，中和β1-整合素可以减少侵袭性和致瘤性方面的恶性行为体内(葛田等。, 1992;席勒和比特纳，1995年). 然而，这种降低致瘤性的机制既没有被探索，也没有被理解。因此，下调肿瘤细胞中β1整合素的显著分化作用不仅是β1整合素对肿瘤细胞作用的一个新发现，而且揭示了腺体功能的一个非常重要的原理。为了用整合素平衡理论解释这一发现（见第二节，C），我们推测，校正的表型不仅是β1-整合素信号本身减少的结果，而且也是恢复一个或多个其他整合素的信号的结果。换句话说，恶性行为是通过细胞表面可用整合素阵列的不平衡来传递的。细胞表面标记显示，与非恶性S1细胞相比，T4-2细胞上的β4-整合素更少。S1和T4-2细胞中β1和β4的比值分别为1.85和5.18。进一步支持失衡假设的事实是，T4-2细胞中的细胞表面β4-整合素水平在使用β1-整合素抗体治疗时基本上是正常的，相反，用β4-或α6-整合素功能改变抗体治疗S1细胞，导致表型紊乱，这与恶性细胞中的表型有些相似(织布工等。, 1997).
正如引言中所讨论的，尽管尚未提出机制，但来自微环境的信号转导可能会逆转明显的恶性表型这一概念并非史无前例。例如，有报道称，纯血小板反应蛋白所传递的信息可能会将恶性血管瘤转化为分化的非肿瘤性毛细血管样细胞，并且血小板反应蛋白的表达与黑色素瘤、肺癌和乳腺癌细胞系的恶性行为呈负相关(扎布雷内茨基等。, 1994;Sheibani和Frazier，1995年).
同样重要的是，我们在三维重建基底膜分析中对乳腺上皮系列进行的集体观察，为正常组织的功能提供了一个新的综合视角体内我们的结果可能指向一个迄今为止未知的开关，该开关可能被拉动，其三维分析的净效应是覆盖与恶性行为相关的几个基因型异常。我们的数据也应该在整合素信号的背景下进行观察，因为整合素的明显冗余一直是一个需要解决的难题。可以从以下概念中获得进一步的理解，即多重性并不表示冗余，而是有助于维持来自不同路径的信号平衡，以响应微环境，从而在必要时保持适当的体内平衡和生长。
四、 结论
最近，人们发现和克隆多种癌症易感基因的惊人能力引起了极大的兴奋，也对迅速了解和治疗乳腺癌和其他上皮癌寄予了厚望。
这篇简短综述的中心论点主要集中在我们当前的工作上，即除非我们了解正常的上皮生物学，否则我们将无法了解乳腺癌。我们认为，乳腺癌的一个简单的遗传模型，即使是多步骤的，也不能解释很多文献和我们目前的数据。恶性行为可以通过操纵单一ECM信号通路而逆转（即使在单一模型系统中迄今为止），这一事实表明，导致这种行为的许多变化（生长不受调控、形态异常、基底膜缺失、细胞与细胞相互作用的丧失、细胞周期蛋白水平等）不是由于突变，而是由于组织结构整体紊乱导致的水平或定位的变化。因为我们可以在表型发生巨大变化时来回穿梭这些细胞，并保留相同的恶性基因型，所以很明显，组织表型比细胞基因型占优势。
因此，我们认为乳腺癌不仅是基因改变、发育调节或生长调节丧失的结果，而且是所有这些因素交织在一起的结果。这将有助于我们揭示分子机制，使基因和微环境结合起来创造组织和特异性。要理解这些特殊线索是如何随着细胞恶性化而丢失的，可能需要肿瘤学家、分子和细胞生物学家，以及病理学家、生理学家、计算生物学家和生物工程师的合作。
