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细胞宿主微生物。作者手稿；PMC 2014年4月17日提供。
以最终编辑形式发布为：
细胞宿主微生物。2013年4月17日；13（4）：10.1016/j.chom.2013.03.005。
数字对象标识：10.1016/j.chom.2013.03.05
预防性维修识别码：项目经理3864637
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院469136
PMID：23601106

磷酸化调节SAMHD1的逆转录病毒限制能力，而不是其脱氧核苷酸三磷酸水解酶活性

汤米·E·怀特,1 阿尔贝托·布兰达利兹·努涅斯,1 何塞·卡洛斯·瓦莱·卡苏索,1 莎拉·艾米,2 劳拉·安·阮,2 贝克·金,2 玛丽娜·图佐娃,1和菲利佩·迪亚兹·格里夫罗1中，*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

SAMHD1是一种细胞酶，可消耗细胞内脱氧核苷三磷酸（dNTP）并抑制逆转录病毒（尤其是HIV-1）感染髓细胞的能力。虽然SAMHD1在循环和非循环细胞中都表达，但SAMHD1的抗病毒活性仅限于非循环细胞。我们确定SAMHD1在循环细胞中的残基T592上磷酸化，但当细胞处于非循环状态时，这种磷酸化丢失。反向遗传实验表明，磷酸化残基T592的SAMHD1不能阻止逆转录病毒感染，但这种修饰并不影响SAMHD11降低细胞dNTP水平的能力。SAMHD1包含细胞周期蛋白依赖性激酶1（cdk1）的靶基序(592TPQK公司595)，并且cdk1活性是SAMHD1磷酸化所必需的。总之，这些发现表明磷酸化调节SAMHD1阻止逆转录病毒感染的能力，而不影响其降低细胞dNTP水平的能力。

简介

人类原代巨噬细胞、树突状细胞和静止CD4的有效感染+猴免疫缺陷病毒（SIV）引起的T细胞雨衣)需要辅助蛋白Vpx(Arfi等人，2008年;Baldauf等人，2012年;Descours等人，2012年;Goujon等人，2003年,2007,2008). Vpx对SIV感染原代巨噬细胞和病毒在体内的发病机制都至关重要(Belshan等人，2006年;Fletcher等人，1996年;Gibbs等人，1995年;Hirsch等人，1998年). Vpx被整合到病毒颗粒中，表明它可能在病毒融合后立即起作用(Jin等人，2001年;Kappes等人，1993年;Park and Sodroski，1995年;Selig等人，1999年). 当细胞感染Vpx缺陷型SIV时，病毒逆转录在原代巨噬细胞中被阻止雨衣或HIV-2(Bergamaschi等人，2009年;Fujita等人，2008年;Goujon等人，2007年;Kaushik等人，2009年;Srivastava等人，2008年). 有趣的是，Vpx还增加了HIV-1有效感染巨噬细胞、树突状细胞和静止CD4的能力+当Vpx被纳入HIV-1颗粒或被提供给反式(Baldauf等人，2012年;Descours等人，2012年;Goujon等人，2008年;Sunseri等人，2011年). 最近的研究表明，SAMHD1是一种在巨噬细胞、树突状细胞和静息CD4细胞中逆转录之前阻断SIVΔVpx、HIV-2ΔVpx和HIV-1感染的蛋白质+T细胞(Baldauf等人，2012年;Berger等人，2011年;Descours等人，2012年;Hrecka等人，2011年;Laguette等人，2011年). 力学研究表明，Vpx诱导SAMHD1的蛋白酶体降解(Berger等人，2011年;Hrecka等人，2011年;Laguette等人，2011年). 与此一致的是，SAMHD1的C末端区域包含Vpx结合基序，这对Vpx降解SAMHD1的能力很重要(Ahn等人，2012年;Laguette等人，2012年;Lim等人，2012年;Zhang等人，2012年). SAMHD1是一种脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）调节的脱氧核苷酸三磷酸水解酶（dNTPase），可降低dNTPs的整体细胞水平(Goldstone等人，2011年;Kim等人，2012年;Lahouassa等人，2012年;Powell等人，2011年). 综上所述，这些结果表明，dNTPs水平的总体下降是导致慢病毒逆转录受阻的原因。

SAMHD1包含无菌α基序（SAM）和组氨酸天冬氨酸（HD）结构域。SAMHD1的HD域是一种dGTP调节的dNTP酶，可降低dNTP的细胞水平(Goldstone等人，2011年;Kim等人，2012年;Lahouassa等人，2012年;Powell等人，2011年). 与此一致，唯一的HD域足以有效限制不同病毒的感染(White等人，2013年). HD结构域对于SAMHD1寡聚和结合RNA的能力也是必要的(怀特等人，2013年). 髓系细胞中dNTP水平的降低与慢病毒不能进行逆转录相关。尽管已知SAMHD1通过耗尽dNTPs库来阻止慢病毒感染，但SAMHD1抗病毒活性的调节尚不清楚。

值得注意的是，循环和非循环细胞都能表达SAMHD1；然而，SAMHD1的抗病毒活性仅在非循环细胞中观察到。几个例子说明了SAMHD1在非循环细胞中具有抗病毒活性的事实。内源性表达SAMHD1的人单核细胞THP-1细胞通过使用佛波醇-12-氨基丁酸-13-乙酸酯（PMA）将细胞分化为非循环状态，从而限制HIV-1(Schwende等人，1996年). 类似地，稳定表达外源性FLAG标记SAMHD1蛋白的人单核细胞U937细胞仅在细胞与PMA分化为非循环状态时限制HIV-1。此外，巨噬细胞和树突状细胞等非循环细胞内源性表达SAMHD1显示出对HIV-1感染的有力限制。最近，人们发现非循环静止CD4+T细胞有效阻断HIV-1感染(Baldauf等人，2012年;Descours等人，2012年). 相比之下，内源性表达SAMHD1的周期性人类HeLa细胞和293T细胞即使在SAVHD1过度表达时也没有表现出抗HIV-1的活性。

这项工作探索了SAMHD1仅在非循环细胞中表达时阻断HIV-1感染的分子基础。我们的质谱测定结果显示，SAMHD1在非循环细胞中的T592位未磷酸化。相比之下，SAMHD1在这里研究的所有循环细胞中的T592位磷酸化。我们研究了T592磷酸化在SAMHD1阻止逆转录病毒感染的能力中的作用，方法是用拟磷酸或不可磷酸残基取代T592。在592位具有磷酸化残基的SAMHD1变体表明，磷酸化SAMHD1-不能阻止逆转录病毒感染，而不会影响SAMHD1/降低dNTPs细胞水平或蛋白质固有酶dNTPase活性的能力。我们还表明，磷酸化调节限制性的能力需要HD结构域和SAMHD1的C末端残基583–626。最后，我们探索了可能在循环细胞中磷酸化SAMHD1的激酶的性质。

结果

SAMHD1在比较循环细胞和非循环细胞时表现出差异磷酸化

SAMHD1在循环和非循环细胞中表达；然而，SAMHD1阻止不同逆转录病毒感染的能力仅在非循环细胞中观察到(Baldauf等人，2012年;Berger等人，2011年;Descours等人，2012年;Hrecka等人，2011年;Laguette等人，2011年;怀特等人，2013年). 为了找到这种表型的分子基础，我们利用质谱法研究了循环和非循环细胞中SAMHD1磷酸化的状态。用SDS-PAGE从循环细胞和非循环细胞中分离免疫沉淀SAMHD1蛋白并用质谱分析(图S1在线提供）。有趣的是，我们观察到SAMHD1在周期性THP-1细胞内生表达时在残基T592处磷酸化(图1A). 类似地，经工程稳定表达SAMHD1-FLAG（U937-SAMHD1-VLAG）的循环人单核细胞U937细胞（其内源性SAMHD1水平未检测到）在残基T592处发现磷酸化SAMHD1_FLAG蛋白(图1A). 相反，非循环细胞，如通过PMA分化为非循环状态的THP-1和U937-SAMHD1-FLAG细胞，在T592位置表现出未磷酸化的SAMHD1蛋白(图1A). 这些结果将SAMHD1的磷酸化状态与其抗病毒活性关联起来(图1A). 因为这些实验表明，未磷酸化的SAMHD1具有抗病毒活性，所以我们测试了人类原代单核细胞源性巨噬细胞（MDM）中SAVHD1的磷酸化状态。同样，我们通过质谱法分析了来自人类原发性MDM的免疫沉淀SAMHD1(图S1). 与我们的研究结果一致，人类主要MDM的T592位含有一个非磷酸化SAMHD1(图1A). 我们还发现一小部分SAMHD1在S33位磷酸化；然而，当比较循环细胞和非循环细胞时，这种磷酸化没有改变(图1).

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SAMHD1在循环和非循环细胞中的磷酸化状态

（A） 使用来自经PMA处理（非循环）或未经处理（循环）的人类单核细胞THP-1细胞的抗SAMHD1抗体免疫沉淀内源性表达的SAVHD1。蛋白质通过SDS-PAGE分离，含有SAMHD1蛋白的考马斯蓝染色带通过质谱进行磷酸肽图谱。显示了磷酸化肽与非磷酸化肽的比率。介绍了不同细胞抑制HIV-1的能力。进行类似的分析以确定人MDM中内源性表达的SAMHD1的磷酸化状态。同时，使用经PMA处理或未经处理的稳定表达SAMHD1-FLAG的人单核细胞U937细胞进行免疫沉淀并测定SAMHD1的磷酸化状态，如实验程序所述。进行了三次质谱分析，并显示了具有代表性的实验。另请参见图S1.

（B） 描述了野生型（WT）人类SAMHD1蛋白，显示了每个结构域边界处氨基酸残基的数量。残留物T592被描绘成共识图案592TPQK公司595通过cdk1识别和磷酸化。

我们的结果表明，非循环细胞T592上未磷酸化的SAMHD1具有抗病毒活性，而循环细胞T692上磷酸化的SAMHD1没有抗病毒活性(图1B).

SAMHD1在不同人细胞系和原代细胞中的磷酸化分析

为了分析SAMHD1在不同人类细胞系和原代细胞中的磷酸化状态，我们使用含有Phos-tag的SDS-PAGE凝胶通过western blotting研究了SAVHD1的磷酸化，Phos-tage是一种改变磷酸化蛋白流动性的配体(Kinoshita等人，2006年). 最初，我们分析了转染SAMHD1-FLAG的人293T细胞。如所示图2A，转染293T细胞的SAMHD1-FLAG显示出广泛的迁移模式，反映了SAMHD1-VLAG的不同磷酸化形式。相比之下，经λ蛋白磷酸酶（λPP）处理的SAMHD1显示出迁移更快、更紧密的条带，显示出SAMHD1.的非磷酸化形式。本实验表明，SAMHD1在人293T细胞中磷酸化，这与稳定表达SAMHD1-FLAG的293T肿瘤细胞不限制逆转录病毒感染的事实相一致。

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SAMHD1在不同人细胞系和原代细胞中的磷酸化状态

（A） 转染表达SAMHD1-FLAG或pLPCX的质粒转染293T或HeLa细胞24小时后进行裂解，并用λPP处理或不处理，λPP是一种对磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基具有活性的蛋白磷酸酶。蛋白质样品通过含有Phos-tag（+Phos-tab）的SDS-PAGE分离，Phos-tap是一种改变磷酸化蛋白质流动性的配体，并使用FLAG抗体进行蛋白质印迹分析。我们还使用抗SAMHD1抗体分析了不同细胞内内源性表达的SAMHD1蛋白的磷酸化状态：人类THP-1细胞、人类原代MDM、人类原发静止CD4+T细胞和复制CD4+T细胞。蛋白质样品也在SDS-PAGE凝胶中分离，没有Phos-tag（–Phos-ta格）。

（B） 同样，我们分析了在存在或不存在PMA的U937细胞中稳定表达的SAMHD1-FLAG的磷酸化状态。作为负荷控制，使用GAPDH抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。

（C） 静止和复制CD4中SAMHD1的磷酸化状态+通过使用识别T592位置磷酸化的SAMHD1的特异性抗体（抗磷酸-T592-SAMHD1）来分析来自两个供体的T细胞。作为对照，我们使用抗SAMHD1和抗GAPDH抗体通过免疫印迹分析样本。在三个独立的实验中也得到了类似的结果，并给出了一个具有代表性的实验。

接下来，我们分析了HeLa细胞中SAMHD1的磷酸化(图2A). 同样，转染或稳定表达在HeLa细胞中的SAMHD1-FLAG被磷酸化，这与HeLa电池本身或稳定表达SAMHD1不限制逆转录病毒感染的事实相一致（数据未显示）。

由于在THP-1细胞中内源性表达的SAMHD1仅在使用PMA将THP-1分化为非循环状态时才受到限制，因此我们比较了循环和非循环THP-1的SAMHD1磷酸化状态(图2A). 与我们的质谱分析一致，我们发现非循环细胞含有内源性表达的非磷酸化SAMHD1蛋白。相反，来自循环THP-1细胞的SAMHD1蛋白被磷酸化。这一证据表明，非循环THP-1细胞中未磷酸化的SAMHD1可以阻断逆转录病毒感染。

最近的证据表明，SAMHD1对静止的CD4施加的阻滞负责+T细胞对HIV-1感染的影响(Baldauf等人，2012年;Descours等人，2012年); 因此，我们在原代人静息和复制CD4中测试了SAMHD1的磷酸化状态+T细胞(图2A). 与非磷酸化SAMHD1负责逆转录病毒限制的假设一致，我们发现静止的CD4+T细胞表现出非磷酸化SAMHD1蛋白，而复制CD4+T细胞显示磷酸化SAMHD1蛋白(图2A). 进一步测试静止CD4中SAMHD1的磷酸化状态+T细胞，我们为SAMHD1衍生的肽开发了一种兔多克隆抗体，该肽含有磷酸化的T592（抗磷酸化T592-SAVHD1）。与Phos-tag结果一致，我们发现抗磷酸化T592-SAMHD1仅识别来自复制CD4+T细胞(图2C). 这些结果与我们的假设一致，即SAMHD1的非磷酸化形式负责限制。

我们还分析了人类主要MDM中SAMHD1的磷酸化状态。如我们的质谱结果所示，人类原代MDM中内源性表达的SAMHD1未磷酸化(图2A和2B).

最后，我们分析了稳定表达SAMHD1-FLAG的循环和非循环人单核细胞U937细胞中SAMHD1的磷酸化状态(图2B). 类似地，非周期性U937细胞稳定表达SAMHD1-FLAG，其阻止逆转录病毒复制且不磷酸化。总的来说，我们的分析表明，在所有限制逆转录病毒感染的非循环细胞中，SAMHD1是非磷酸化的，而循环细胞含有磷酸化的SAMHD1。

磷酸化对SAMHD1限制的调节

我们的生化分析表明，循环细胞中磷酸化的SAMHD1并不限制逆转录病毒感染。为了测试通过磷酸化对SAMHD1限制性的调节，我们生成了一系列SAVHD1磷酸化变体，其中T592被拟磷（D和E）或不可磷（V和a）残基取代(表1). 我们使用含有Phos-tag的SDS-PAGE凝胶，通过蛋白质印迹初步分析了人类293T细胞中不同变体的磷酸化状态(图3A). 有趣的是，与野生型SAMHD1相比，其中T592被磷酸化或不可磷酸化残基取代的SAMHD1-变体没有磷酸化，这表明T592是人类细胞中磷酸化的残基(图3A). 为了证实这些突变体在293T细胞中不再磷酸化，我们测试了这些蛋白是否被抗磷酸化T592-SAMHD1抗体识别。如所示图3B，野生型SAMHD1被抗磷酸-T592-SAMHD1-抗体识别。相比之下，T592被不同残基取代的所有变体均未被抗磷-T592-SAMHD1识别。

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SAMHD1磷酸化变体抑制HIV-1的能力

（A） 用野生型或指定的SAMHD1变异体转染人293T细胞。转染后24小时裂解细胞，并使用含有Phostag（+Phos标签）的SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品。使用抗FLAG抗体通过western blotting检测SAMHD1变体。用λPP处理指示样品，以检测未磷酸化SAMHD1的迁移。同时，我们使用空向量pLPCX进行了类似的分析。蛋白质样品也在SDS-PAGE凝胶中分离，没有Phos-tag（–Phos-ta格）。作为负荷控制，使用GAPDH抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。

（B） 293T细胞中表达的不同SAMHD1变异体也使用抗磷酸化T592-SAVHD1抗体进行免疫印迹分析，这些抗体只识别残基T592处的磷酸化SAMHD1-蛋白。

（C） 用野生型SAMHD1和所示SAMHD1-变异体稳定转导人单核细胞U937细胞。使用抗FLAG抗体，通过western blotting分析PMA处理的稳定细胞SAMHD1的表达。同样，用GAPDH的western blot分析作为负荷控制。

（D和E）PMA处理的稳定表达所示SAMHD1变体的人单核细胞U937细胞受到越来越多的HIV-1-GFP的挑战。感染显示为感染后48小时通过流式细胞仪测量的GFP阳性细胞百分比。作为对照，用空载体pLPCX稳定转导的U937细胞受到不断增加的HIV-1-GFP的攻击。另请参见图S2实验一式三份进行，并显示了具有代表性的结果。WT，野生型。

表1

SAMHD1磷酸化变体

SAMHD1变型HIV-1限制一齐聚作用b条RNA结合c（c）本地化d日细胞dATP水平e（电子）酶活性（f）
重量+++N个低的+
T592A型+++N个低的+
第592天——++N个低的+
T592E型——++N个低的+
T592伏+++N个低的+
第593A页+++N个低的+
S33A型+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）
S33D系列+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）
112-626+++C类低的+
112-626-T592D型——++C类低的+
S18A型+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）
S18D系列+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）
T21A型+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）
T21D型+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）
T25A型+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）
T25D型+ND（无损检测）ND（无损检测）N个ND（无损检测）ND（无损检测）

WT，野生型；ND，未确定。

一通过用HIV-1-GFP感染稳定表达所示SAMHD1变体的U937细胞来测定HIV-1限制性。48小时后，用流式细胞仪测定GFP阳性细胞（感染细胞）的百分比。
b条如实验程序所述，通过测量SAMHD1-FLAG变体与相应SAMHD1-HA变体相互作用的能力来确定不同SAMHD1变体的齐聚。“+”表示100%齐聚，对应于与野生型SAMHD1-FLAG相互作用的野生型SAVHD1-HA的量。
c（c）如实验程序所述，对SAMHD1-FLAG变体进行了结合dsRNA类似物ISD-PS的能力分析。“+”表示野生型SAMHD1实现的RNA结合。
d日按照实验程序所述，在HeLa细胞中对不同SAMHD1变异体进行亚细胞定位。“N”表示核定位；“C”表示细胞质定位。
e（电子）如实验程序所述，通过引物延伸测定PMA处理的稳定表达不同SAMHD1变体的U937细胞的细胞dATP水平。“低”表示与PMA处理的稳定表达野生型SAMHD1的U937细胞中观察到的dATP水平相似。
（f）如实验程序所述，通过dTTP水解反应测量不同SAMHD1变体的酶活性。“+”表示野生型活性水平。

为了测试SAMHD1变异体在非循环细胞中限制HIV-1感染的能力，我们在U937细胞中稳定表达了SAMHD11变异体(图3C)如前所述，并测试了这些细胞系限制表达GFP的HIV-1数量增加作为感染报告者（HIV-1-GFP）的能力(Brandarize-Nuñez等人，2012年;怀特等人，2013年). 如所示图3D和表1，含有磷酸化残基（如D或E）的SAMHD1失去了在非循环U937细胞中阻断逆转录病毒限制的能力，这表明在T592位磷酸化的SAMHD1无法阻止逆转录病毒感染。相比之下，T592被不可磷残基（如V或A）取代的SAMHD1变异体阻断HIV-1-GFP感染的能力不受影响(图3D和表1). 使用HIV-2、SIVDVpx、猫免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒、牛免疫缺陷病毒以及北回归和北回归小鼠白血病病毒时，观察到类似的限制模式，如怀特等人（2013）这些结果表明T592位磷酸化SAMHD1不能限制不同逆转录病毒的感染。

我们对THP-1细胞中内源性表达的SAMHD1的初步质谱分析显示，一小部分SAMHD1在S33位置被磷酸化，并且当将循环与非循环细胞进行比较时，这种模式没有改变(图1A). 为了了解S33磷酸化在SAMHD1限制HIV-1感染的能力中的作用，我们用磷酸模拟物（D）或不可磷酸化的（a）残基替换S33。SAMHD1变异体在U937细胞中稳定表达(图S2A)，并测量这些变异体限制HIV-1-GFP的能力(图S2B). 如所示图3ES33的改变并不影响SAMHD1阻断HIV-1感染的能力。

因为我们的结果表明，SAMHD1的非磷酸化形式可以阻止非循环细胞中的HIV-1感染，所以我们测试了SAMHD1-T592V（不能磷酸化）限制循环细胞中HIV-1的能力。如所示图S2C和S2D，SAMHD1-T592V在HeLa细胞中的表达并不能阻止HIV-1感染。然而，当SAMHD1-T592V在循环U937细胞中检测时，它对HIV-1感染的影响较小(图S2E).

最后，我们测试了来自HIV-2（Vpx）ROD株的Vpx的能力活塞杆)降解不同的SAMHD1磷酸化变体。如所示图S2F，像素活塞杆同等降解不同SAMHD1磷酸化变体，表明Vpx的能力活塞杆降解SAMHD1与SAMHD1.的磷酸化状态无关。

SAMHD1磷酸化变体的齐聚、RNA结合和定位

SAMHD1酶活性的变构调节发生在HD结构域的二聚化界面(Goldstone等人，2011年). 与此一致，我们发现SAMHD1变异体HD206AA的寡聚能力受到部分影响，这表明HD206AA限制HIV-1的能力缺陷也可能是由于寡聚不足(怀特等人，2013年). 为了评估SAMHD1的磷酸化变体因寡聚缺陷而失去限制的可能性，我们测试了不同SAMHD1-FLAG变体与SAMHD1-血凝素（HA）相应变体寡聚的能力(图S2G). 有趣的是，我们发现失去阻断逆转录病毒感染能力的SAMHD1变异体并没有失去寡聚能力，这表明SAMHD1-变异体无法限制逆转录病毒的感染并不是由于寡聚缺陷。

我们和其他人之前已经证明SAMHD1结合RNA的能力(Goncalves等人，2012年;怀特等人，2013年); 因此，我们测试了人类293T细胞产生的不同SAMHD1磷酸化变体结合RNA的能力(图S2H)，如前所述(怀特等人，2013年). 如所示图S2H所有研究的SAMHD1磷酸化变体都显示出与双链RNA（dsRNA）类似物硫代磷酸化干扰素刺激DNA（ISD-PS）结合的能力，其强度与野生型SAVHD1蛋白一样强。

最后，我们测试了人类HeLa细胞中不同SAMHD1磷酸化变体的细胞定位(图S2I)，如前所述(Brandarize-Nuñez等人，2012年;怀特等人，2013年). 这些结果表明，所有研究的SAMHD1磷酸化变体都定位于核室，类似于野生型SAVHD1蛋白(图S2I). 总的来说，这些结果表明，这些研究中使用的SAMHD1磷酸化变体在SAVHD1的不同属性中没有表现出重大缺陷。

SAMHD1 N-末端残基1-112在T592磷酸化调控逆转录病毒限制性反应中的作用

因为我们的观察表明T592的磷酸化状态调节SAMHD1阻断逆转录病毒限制的能力，所以我们测试了SAMHD11的N末端残基（1-112）的作用(图1B)T592磷酸化调节限制性的能力。我们之前的观察表明，含有SAMHD1残基112–626的构建物足以有效限制HIV-1(怀特等人，2013年). 为了测试残基1–112在SAMHD1磷酸化调控中的作用，我们创建了一个包含SAMHD1的残基112–626的构建物，其中T592被磷酸模拟残基D（112-626-T592D）取代。使用含有Phos-tag的SDS-PAGE凝胶，通过western blotting检测人类293T细胞中112-626和112-626-T592D的磷酸化水平(图4A). 与我们在全长SAMHD1中的发现一致，由112-626残基组成的蛋白质被磷酸化(图4A). 有趣的是，112-626-T592D揭示了一种非磷酸化蛋白，类似于非循环细胞中的全长SAMHD1-T592D(图4A). 为了测试112-626-T592D阻断HIV-1感染的能力，我们在U937细胞中稳定表达了它(图4B)并用不断增加的HIV-1-GFP刺激细胞(图4C). 有趣的是，与112-626或全长SAMHD1相比，112-626-T592D完全失去了阻止HIV-1感染的能力(图4C). 我们的结果表明，SAMHD1 N末端残基1–112对于T592磷酸化调节逆转录病毒限制性的能力是不必要的。

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N-末端残基1-112在磷酸化调节逆转录病毒限制性作用中的作用

（A） 用所示SAMHD1变异体转染人293T细胞。转染24小时后对细胞进行裂解，并使用含有Phos-tag（+Phos-tak）的SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品。使用抗FLAG抗体通过蛋白质印迹检测SAMHD1变体。蛋白质样品也在SDS-PAGE凝胶中分离，没有Phos-tag（–Phos-ta格）。作为负荷控制，使用GAPDH抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。

（B） 用野生型稳定转导人单核细胞U937细胞，并使用抗FLAG抗体通过western blotting分析所示SAMHD1变异体的SAVHD1表达。用GAPDH的Western blot分析作为负荷对照。

（C） 稳定表达不同SAMHD1变异体的人单核细胞U937细胞受到不断增加的HIV-1-GFP的攻击。感染显示为感染后48小时GFP阳性细胞的百分比，通过流式细胞仪进行测量。作为对照，用空载体pLPCX稳定转导的U937细胞受到不断增加的HIV-1-GFP的攻击。另请参见图S3实验共进行了三次，并显示了具有代表性的结果。

稳定表达不同SAMHD1磷酸化变体的U937细胞中细胞dNTPs水平

先前的观察表明，SAMHD1通过减少dNTPs的细胞内池来阻止HIV-1复制(Goldstone等人，2011年;Kim等人，2012年;Lahouassa等人，2012年;Powell等人，2011年;怀特等人，2013年). 细胞dNTPs的减少将阻止逆转录病毒的发生，这是一个需要dNTP的过程。鉴于SAMHD1磷酸化变体没有显示出SAMHD11已知属性的明显缺陷，我们决定测试SAMHD1磷酸化变体的限制性缺失是否与细胞dNTP水平的增加相关。为此，我们测量了稳定表达不同SAMHD1磷酸化变体的分化U937细胞中dNTPs的细胞内水平(图5A)，如前所述(怀特等人，2013年). 值得注意的是，稳定表达SAMHD1变异体的U937细胞（其中T592被磷酸化残基（D或E）取代）显示出dNTP水平与稳定表达野生型SAVHD1的U937-细胞相当。与此一致的是，稳定表达SAMHD1结构体112-626-T592D的U937细胞的细胞dNTP水平（失去了阻止HIV-1感染的能力）与稳定表达野生型SAMHD1(图S3和表1). 这些结果表明，SAMHD1-T592D、SAMHD1/T592E和112-626-T592D不能阻止HIV-1感染，并不是由于蛋白质的dNTPase活性缺陷所致。这些发现间接表明SAMHD1-T592D、SAMHD1-T592E和112-626-T592D的dNTPase活性是完整的。

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不同SAMHD1变异体的酶活性分析

（A） 根据实验程序中的描述，采用引物延伸分析法对PMA处理的U937细胞中表达所示SAMHD1变体的dATP、dTTP和dGTP水平进行定量。在三个单独的实验中获得了类似的结果，并显示了一个具有代表性的实验。

（B） 使用抗FLAG抗体，通过western blotting对来自人类293T细胞的免疫沉淀SAMHD1变体进行标准化。WT，野生型；WB、western blot；IP，免疫沉淀。

（C） 不同免疫沉淀SAMHD1变体的dTTP-三磷酸水解酶活性的薄层色谱分析。为此，我们培养了放射性标记的α-[32P] dTTP存在指定的SAMHD1变体。来自α的产品-[32P] 用聚乙烯亚胺纤维素薄层色谱法分离dTTP水解产物。α水解-[32P] dTTP产生dT和α-[32P] PP，使用磷化成像仪进行可视化。作为对照，我们还测量了在dsRNA类似物ISD-PS存在下dTTP-三磷酸水解酶的活性。每个处理的三个独立酶反应的结果如下所示。

（D） 从杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中纯化重组SAMHD1和SAMHD1-T592D蛋白。蛋白质通过SDS-PAGE凝胶分离并用考马斯蓝染色。

（E） 同样，杆状病毒重组SAMHD1和SAMHD1-T592D蛋白的dTTPase活性通过测定放射性标记α-[32P] 所示重组SAMHD1蛋白的dTTP。反应在指定时间停止，并使用聚乙烯亚胺纤维素通过薄层色谱分离，如实验程序所述。另请参见图S4给出了三个独立实验的代表性结果。

不同SAMHD1磷酸化变体的酶活性

为了直接分析SAMHD1磷酸化变异体的酶活性，我们测试了免疫沉淀SAVHD1变异体(图5B)水解α-32P标记的三磷酸胸苷（α-[32P] TTP）转化为脱氧胸苷（dT）和α-[32P] PP，在变构活化剂dGTP存在下(图5C). 为此，我们在放射性标记的α-[32P] TTP公司。使用薄层色谱分离反应产物，以确定水解α的量-[32P] 聚丙烯(图5C)，如前所示(怀特等人，2013年). 与野生型SAMHD1相比，免疫沉淀SAMHD1-T592D和SAMHD1/T592E表现出相似的酶活性，这一点是一致的(图5C). 作为对照，我们在dsRNA类似物的存在下测量了不同SAMHD1变异体的酶活性，dsRNA的类似物抑制了SAVHD1的酶活性(White等人，2013年). 这些实验表明SAMHD1磷酸化变体的酶活性不受影响。我们还通过高压液相色谱法（HPLC）测量核苷酸水解来确认这些结果(图S4A)，如实验程序所述。总的来说，这些发现表明SAMHD1的酶活性不足以限制HIV-1。同样，我们测量了从昆虫细胞中纯化的SAMHD1-T592D水解α-[32P] 变构激活剂dGTP存在下的TTP(图5D、5E S4B和S4C)，如前所示(怀特等人，2013年). 一致地，纯化的SAMHD1-T592D显示类似的α-[32P] 与野生型纯化蛋白相比，TTP水解活性(图5D、5E、和S4C系列). 以同样的方式，我们通过HPLC测量核苷酸水解来证实这些结果(图S4B).

细胞周期素依赖激酶1参与SAMHD1磷酸化

从HeLa总提取物中对激酶特异性磷酸肽的共价捕获表明，来自SAMHD1的含有T592的肽是人类cdk1复合物的底物(Bletrow等人，2008年). 这些实验表明，人cdk1可能是SAMHD1的细胞激酶。与Scansite软件对SAMHD1蛋白序列的分析一致(http://scansite.mit.edu)发现残留物592TPQK公司595构成cdk1识别和磷酸化的一致序列基序(Errico等人，2010年). 为了测试cdk1在SAMHD1磷酸化中的作用，我们检测了存在人类显性阴性cdk1突变cdk1-D146N（其活性位点上的cdk1缺陷变体）时SAMHD11磷酸化的水平(范登·胡维尔和哈洛，1993年). 如所示图6A，Cdk1-D146N的存在降低了磷酸化的SAMHD1的量，表明人类Cdk1在体内磷酸化SAMHD1。为了直接测试人cdk1磷酸化SAMHD1的能力，我们在体外激酶试验中用活性cdk1复合物培养细菌表达的重组谷胱甘肽S-转移酶（GST）-SAMHD1(图6B). 这些实验表明，cdk1磷酸化GST-SAMHD1，但不磷酸化GST控制蛋白。我们使用人类组蛋白H1（cdk1复合物的特定底物）作为阳性对照，进行了类似的体外激酶检测。这些结果，以及T592上SAMHD1变异体在体内未磷酸化的证据(图3A和3B)表明SAMHD1是激酶复合物cdk1的底物。结果也与cdk1识别基序中P593A突变的观察结果一致592TPQK公司595废除SAMHD1磷酸化(图3). SAMHD1-P593A蛋白的表现与SAMHD1-T592A/V相似，表明该突变体失去了磷酸化调节的能力(图3和​和55).

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cdk1参与SAMHD1的磷酸化

（A） Cdk1显性阴性突变体D146N（Cdk1-D146N）对SAMHD1磷酸化水平的影响。用含有Phostag（+Phos-tag）的SDS-PAGE分离转染表达SAMHD1-FLAG和Cdk1-D146N-HA蛋白质粒的人293T细胞的细胞裂解物。分别用抗FLAG抗体和抗HA抗体进行western blotting检测SAMHD1-FLAG和Cdk1-D146N-HA。作为对照，在空载体pCMV存在的情况下测定SAMHD1磷酸化水平。蛋白质样品也在SDS-PAGE凝胶中分离，没有Phos-tag（–Phos-ta格）。通过使用GAPDH抗体的western印迹对负荷进行标准化。在三个独立的实验中也得到了类似的结果，并给出了一个具有代表性的实验。

（B） 用cdk1复合物从细菌中纯化的重组GST-SAMHD1的体外磷酸化，该复合物是用γ--[32P] ATP作为磷酸盐供体。作为阳性对照，我们将cdk1激酶复合物与人类组蛋白H1孵育，人类组蛋白是该激酶复合物的已知底物。作为阴性对照，我们将类似数量的纯化GST蛋白与激酶复合物cdk1孵育。

讨论

循环和非循环细胞具有表达限制因子SAMHD1的潜力；然而，SAMHD1仅在非循环细胞中具有抗病毒活性，这表明循环细胞和非循环细胞之间存在差异，这可能调节SAMHD1阻断逆转录病毒感染的能力。第一种可能的解释是，当比较循环细胞和非循环细胞时，SAMHD1被翻译后修改。第二，非循环细胞可能表达限制所需的辅因子，第三种可能性是SAMHD1翻译后修饰和辅因子需要用于逆转录病毒限制。本研究表明，SAMHD1限制逆转录病毒感染的能力受T592磷酸化的调控。有趣的是，我们发现所有测试的循环细胞都表达了一种在T592残基磷酸化的SAMHD1蛋白。相比之下，所有测试的非循环细胞在T592位都显示出一个未磷酸化的SAMHD1蛋白。

用磷酸模拟氨基酸取代T592完全消除了SAMHD1阻止逆转录病毒感染的能力。SAMHD1磷酸化变异体T592D和T592E在不丧失RNA结合、dNTPase活性、寡聚和定位的情况下，完全丧失了阻止逆转录病毒感染的能力。事实上，这些变体没有失去大多数已知SAMHD1属性，这表明这些变体是正确折叠的。一种可能性是，在残基T592处SAMHD1的磷酸化诱导构象改变，从而消除SAVHD1阻止逆转录病毒感染的能力，而不影响SAMHD1的所有已知特性。第二种可能性是残基T592的磷酸化调节SAMHD1与逆转录病毒限制所需的未知辅因子相互作用的能力。

磷酸化调节SAMHD1限制能力的能力只需要HD结构域和C末端残基583–626(图1B). 先前的研究表明，仅包含HD结构域和C末端残基583–626（112–626）的SAMHD1构建足以有效限制逆转录病毒(White等人，2013年); 这项工作表明SAM域对于限制来说是不必要的。我们的研究表明，其中T592被磷酸化残基取代的SAMHD1结构体112-626失去了其限制能力，这表明通过磷酸化调节限制并不需要N-末端残基1-112。与此一致的是，112-626-T592D失去了阻止逆转录病毒感染的能力，而没有失去dNTPase活性。

一些证据表明，SAMHD1降低dNTPs水平的能力与SAVHD1阻止不同逆转录病毒感染的能力相关，这表明降低dNTP的细胞水平是限制病毒复制的原因(Goldstone等人，2011年;Kim等人，2012年;Lahouassa等人，2012年;Powell等人，2011年;怀特等人，2013年). 目前的研究发现SAMHD1变异体失去了阻止逆转录病毒感染的能力，但保留了降低细胞dNTP水平的能力。此外，当作为来自昆虫或哺乳动物细胞的纯化蛋白进行测试时，这些变体也被证明具有酶活性。这些结果表明，SAMHD1降低细胞dNTP水平不足以实现逆转录病毒限制。一种可能的解释是SAMHD1的酶活性和未知功能都需要限制。第二种可能性是SAMHD1的酶活性对于SAMHD1-阻止逆转录病毒感染的能力来说不是必需的。尽管靶向SAMHD1活性位点的变异体HD206AA失去了逆转录病毒限制(Hrecka等人，2011年;Laguette等人，2011年)，其齐聚能力也有缺陷，因此很难确定是哪个缺陷导致限制性缺失(怀特等人，2013年). 此外，这些结果表明，将细胞dNTP水平降低到野生型SAMHD1所达到的水平不足以阻止不同逆转录病毒的感染。

最近的观察表明，SAMHD1在体外对单链DNA和RNA具有3′至5′核酸外切酶活性(Beloglazova等人，2013年). 另一种可能性是T592位磷酸化SAMHD1表现出较低的外切酶活性，而不会丧失降低dNTPs细胞水平的能力。相比之下，去磷酸化的SAMHD1将表现出较高的核酸外切酶活性。这可能表明SAMHD1通过降解病毒的遗传物质来阻止病毒复制，这与SAVHD1限制慢病毒和γ-逆转录病毒等多种RNA病毒的能力一致(White等人，2013年). 未来的实验将试图了解SAMHD1的酶活性是否需要限制。

先前的观察表明，残基T592是HeLa细胞中人类cdk1复合物的底物(Bletrow等人，2008年). 与此一致，残留物592TPQK公司595是cdk1识别和磷酸化的一致序列基序(Errico等人，2010年)，并更换中的T592592TPQK公司595不可磷酸化残基的基序降低了SAMHD1在人类循环细胞中磷酸化的能力。同样，用丙氨酸替换同一基序中的P593降低了SAMHD1磷酸化。为了证实这一证据，我们在存在人类显性负性cdk1突变体（cdk1-D146N）的情况下检测了SAMHD1磷酸化水平，以表明cdk1显性负性突变体的表达降低了磷酸化野生型SAMHD11的水平。我们还证明了纯化的cdk1复合物磷酸化纯化的SAMHD1的能力。与这些发现一致，一些研究小组报告称，细胞向非循环状态的分化涉及cdk1表达的下调(Hass等人，1992年;Kim等人，2008年;Traore等人，2005年). 然而，磷酸酶也可能在T592位调节SAMHD1的磷酸化状态。尽管在大多数已知的情况下，磷酸化的调节是由激酶决定的，但也有一些例子表明，磷酸酶在调节特定蛋白质的磷酸化状态中起着重要作用(Cheng等人，2011年). 未来的实验将试图了解SAMHD1的磷酸化是否受细胞磷酸酶的调节。综上所述，这一证据表明SAMHD1是人类循环细胞中cdk1的底物，而非循环细胞中的cdk1下调导致存在抗病毒活性的非磷酸化SAMHD1蛋白。

实验程序

稳定表达SAMHD1变异体的U937细胞的制备

使用LPCX载体创建编码野生型或突变型SAMHD1蛋白的逆转录病毒载体。通过将LPCX质粒与pVPack-GP和pVPack-VSV-G包装质粒共转染，在293T细胞中产生重组病毒。在0.4μg/ml嘌呤霉素中选择转导的人单核细胞U937细胞。

表达GFP的逆转录病毒感染

表达GFP的重组逆转录病毒，用VSV-G糖蛋白假分型，如所述制备(Diaz-Griffero等人，2008年). 对于感染，6×104细胞接种在24孔板中并用PMA处理。随后，将细胞与指示的逆转录病毒孵育48小时。通过流式细胞术（Becton Dickinson）测定GFP阳性细胞的百分比。

SAMHD1齐聚分析

用编码FLAG和HA标记的SAMHD1变异体的质粒共同转染人293T细胞。含有SAMHD1蛋白的预清除裂解物与抗FLAG-琼脂糖珠孵育。将抗-FLAG-琼脂糖珠洗涤三次，并使用FLAG三肽洗脱免疫复合物。用抗HA或抗FLAG抗体对洗脱的样品进行免疫印迹分析。

核酸结合分析

如前所述进行核酸结合测定(Goncalves等人，2012年;怀特等人，2013年). 简而言之，使用了合成DNA ISD-PS，这是一种RNA类似物。预清除的裂解物（“输入”图S2)以小牛胸腺DNA作为竞争物，与固定化核酸孵育。通过连续三次洗涤去除未结合蛋白。用FLAG抗体洗脱结合蛋白和核酸（“结合”），并通过western blotting进行分析。

通过引物延伸分析对细胞dNTPs进行定量

细胞被造粒，重新悬浮在冰镇甲醇上，并使用SpeedVac进行干燥。如前所述，将干燥样品重新悬浮在水中，并分析dNTP含量(Kim等人，2012年;Lahouassa等人，2012年).

免疫沉淀和质谱

稳定表达SAMHD1-FLAG、THP-1细胞或原代MDM的U937细胞被裂解，并使用蛋白A-琼脂糖进行预筛选。在适当的情况下，用抗FLAG-琼脂糖珠或蛋白A-琼脂酶与抗SAMHD1抗体孵育预先清除的裂解产物。将含有免疫沉淀的珠子清洗三次。随后，洗脱免疫复合物并用SDS-PAGE分离样品。切除与SAMHD1分子量相对应的条带，并将其发送至Taplin质谱设备（哈佛医学院）进行磷酸肽图谱绘制。

含有磷标记的SDS-PAGE凝胶

如前所述制备磷标记凝胶(Kinoshita等人，2006年). 凝胶由含有Zn-Phos-tag的分离凝胶和堆积凝胶组成。丙烯酰胺类膦标记配体和两种锌（NO3）当量2在聚合之前加入到分离凝胶中。电泳后，使用iBlot凝胶转移系统将凝胶转移到硝化纤维素膜上。

体外cdk1复合激酶检测

重组GST-SAMHD1或GST与重组cdk1复合物（Sigma-Aldrich）在磷酸化缓冲液中孵育，该缓冲液补充5μCiγ-[32P] ATP。通过添加样品缓冲液停止磷酸化反应。蛋白质在10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE上进行解析。将所得凝胶在Bio-Rad凝胶干燥器上干燥，并使用磷化成像仪进行分析。

补充材料

1

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致谢

我们要感谢Nadine Laguette的有益讨论。这项工作由NIH向F.D.-G拨款R01 AI087390资助。

脚注

补充信息

补充信息包括四幅图和补充实验程序，可在以下网站上找到http://dx.doi.org/10.1016/j.chom.2013.03.005.

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