用于发育大脑皮层子宫内电穿孔研究的新工具和改进工具

摘要

介绍

为了研究大脑皮层的细胞和区域特异性特性，有必要进行实验，将特定细胞群在特定发育时间的功能丧失和获得结合起来。例如，皮质层之间和内部的不同神经元类型可能会迁移到适当的位置，并通过不同的共享机制形成细胞特异性连接。有选择地研究这些机制的唯一方法是在选定的发育时间点改变特定细胞群的表达。小鼠遗传方法已经发展到可以实现这种受控基因表达的程度，然而，它可能需要生产和维护多个系列的小鼠，而实验室的费用越来越高。在过去的几年里，子宫内电穿孔（IUE）已成为一种有效的转染和操纵大脑皮层前体细胞和神经元的方法。

2001年，有3篇论文证明通过电穿孔细胞成功转染小鼠和大鼠胚胎发育中的新皮质。(Fukuchi Shimogori和Grove 2001;Saito和Nakatsuji 2001;Tabata和Nakajima 2001)在迁移机制的研究中，这种方法的优势变得明显(Takahashi等人，2002年;Kawauchi等人，2003年)和区域格局(Fukuchi Shimogori和Grove 2001). 通过结合IUE和短发夹RNA（shRNA）质粒来产生RNA干扰（RNAi）(Bai等人，2003年)获得和失去功能的研究成为可能。此外，IUE适用于遗传操作不易实施的物种。在过去几年中，新的方法被应用于IUE，使其适合于需要细胞和时间控制转基因表达的日益复杂的实验。在这篇综述中，我们讨论了IUE的5个特征，这些特征使其成为一种合适的方法，用于靶向特定的细胞群体（根据位置、启动子或祖细胞类型定义），以操纵在不同发育阶段发挥作用的分子通路。最后，我们介绍了一种条件救援方法，该方法可用于解决皮层形成过程中可能发生的发育障碍和障碍的可逆性问题。

空间定向IUE

首次发表在发育中的皮层使用宫内节育器的报告(Fukuchi Shimogori和Grove 2001)利用空间定向电穿孔。通过视觉引导阳性电极的位置，将皮质表面的一个特定区域转染，并将FGF8表达的次级补丁定位于顶叶皮质。这反过来改变了体感皮层的位置，并在某些情况下导致桶场的重复(Fukuchi Shimogori和Grove 2001). 本研究中的区域化转染需要一个富有挑战性的手术，包括在年轻（E11–12）胚胎的子宫内插入2个电极。自那时以来，一些研究人员已经表明，通过调整外电极的位置，可以直接转染到侧脑室的不同区域。例如，海马体的定向电穿孔是可能的，方法是将正桨电极放置在注入质粒的脑室的对侧，从而将电穿孔驱动到胚胎端脑的内侧区域，从而产生海马体(Nakahira和Yuasa 2005;Navarro-Quiroga等人，2007年). 类似地，电穿孔可以直接作用于腹侧祖细胞，从而在小鼠皮层产生中间神经元(Borrell等人，2005年). 产生新皮质锥体神经元或梨状皮质和杏仁核的背侧或外侧大脑皮层(Remedios等人，2007年;Bai等人，2008年)可通过将正极分别置于背侧或侧腹侧位置进行转染(图1). 此外，尽管在空间上还不如将电极插入胚胎皮层那样精确，但我们发现，将正桨电极的直径减小到2–3 mm可以导致局部电穿孔斑块。未来，通过将电极位置与含有区域表达基因启动子的质粒载体相结合，可能实现更具空间限制的表达。

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图1。

转染的空间控制。(A类)示意图显示了如何在IUE期间定位桨叶电极来指导转染位置。(B类)在E13处递送并在P21处评估的背侧转染的实例。细胞主要是向丘脑投射轴突的新皮质锥体神经元（红色箭头）。(C类)E13侧腹侧转染导致主要内嗅皮层、梨状皮层和杏仁核转染的示例。注意，与B轴索相反，C轴索（红色箭头）主要位于海马体，而不是丘脑。

细胞类型-特异性表达

最近的研究表明，IUE可用于在心室区（VZ）表面不同亚群的祖细胞中优先表达转基因。这种祖细胞特异性转染的一种简单方法利用了皮层细胞生成的时间顺序和质粒转染国际能源联盟似乎在经历细胞分裂的细胞中丢失。因此，宫内节育器检查可以类似于有丝分裂出生日期测定。在IUE和BrdU对神经元出生的系统比较中，Langevin等人（2007年），证明IUE可以根据电穿孔的时间用于特异性标记占据不同皮层层的神经元(Langevin等人，2007年)。Hatanaka等人（2004年），有效地使用了不同电穿孔时间的方法来确定Cdk5在晚期生成的上层神经元迁移中的作用比早期生成的深层神经元更为关键(Hatanaka等人，2004年). 我们同样发现，改变电穿孔时间不仅可以转染不同层的锥体神经元，还可以转染星形胶质细胞祖细胞和星形胶质细胞。如所示图2，如果在大鼠E18处给IUE，则星形胶质细胞主要被转染(图2)。

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图2。

IUE对基因表达的时间和重组诱导控制。(A类)(A1–A3)胚胎第16天（E）转染GFP的大鼠新皮质冠状切片，出生后第21天（P）固定。(A1类)GFP标记的神经元存在于皮层深层和上层。(A2级)GFP标记的2/3层皮层锥体神经元的高倍显微照片。(第3页)GFP+深层锥体神经元显微图。(B类)在E18处转染GFP并固定在P21处的大鼠新皮质冠状切片。存在一条明显的标记上层2神经元带，以及跨越多个层的优势星形胶质细胞。位于软脑膜表面的GFP+浅层皮质锥体神经元的高倍图像(地下二层)GFP标记的实质性星形胶质细胞（B3）。(C类)在E17用pCAG mRFP+pCALNL-GFP电穿孔后，E19收获的大鼠胚胎仅显示mRFP表达。pCANLl-GFP质粒包含GFP序列上游的loxp-neostop-loxp序列（参见Matsuda和Cepko 2007). (D类)E17电穿孔后，E19收获的大鼠胚胎用pCAG mRFP+pNestin-CRE（巢蛋白增强子元件驱动CRE重组酶表达）+pCALNL-GFP在心室区祖细胞中显示出强劲的GFP和mRFP表达。比例尺：A1类和B1=100μm；A2级,第3页,地下二层、和地下三层=50微米；C1类——第3天=40微米。

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图3。

研究神经元迁移障碍可逆性的条件RNAi拯救策略。(A类,B类)显示有条件RNAi救援策略的示意图。(A类)由2个ER结合域组成的4-OHT可激活Cre重组酶在强大的普遍存在的CAG启动子或细胞特异性启动子的控制下表达。(B类)Cre依赖性诱导表达载体包含新霉素耐药基因（neo-stop和polyA）的序列，两侧有2个loxP位点。Cre介导的重组将移除新盒并允许转基因表达。(C类)条件DCX-eGFP表达式的示例。用编码mRFP、4-OHT可激活Cre重组酶、诱导型DCX-eGFP和抗DCX shRNAs的4种质粒转染神经元。在4-OHT处理的条件下（左面板），DCX-eGFP被表达，DCX被转染神经元中的抗体检测到。在车辆处理条件下（右侧面板），绿色通道或DCX抗体中未检测到信号。比例尺，50μm。(D类)提出了实验范式，用条件RNAi拯救策略研究重新激活迁移的可能性。(E类)一个条件RNAi拯救策略应用于宫内RNAi对抗DCX诱导的皮层下带异位症（sbh）模型的示例。在E14用无效（无畸形动物）或有效的针对Dcx的shRNA载体（患有sbh的动物）以及编码mRFP的载体对两组动物进行电穿孔。无畸形动物与诱导型eGFP表达载体共电穿孔，sbh动物与诱导的DCX-eGFP表示载体共电孔，以及编码4-OHT可激活Cre重组酶的载体。出生时，在无畸形动物中，转染的神经元通常位于上部皮质层，在sbh动物中，这些神经元在外周积聚在深部位置，形成带状异位。出生时，动物被注射4-OHT或其载体溶液以激活Cre并诱导Cre介导的重组。在P15，在用4-OHT在P0诱导Dcx重新表达的sbh动物中，先前位置错误的转染神经元被重新定位到上皮层，类似于接受诱导GFP表达的无畸形动物。与未接受诱导的sbh动物相比，sbh（灰色区域）的大小也大大减小。

细胞型特异性启动子也被用于IUE实验中选择性地驱动表达。转录因子的启动子ER81和NGN2被用来选择性地驱动新皮质神经元中荧光蛋白的表达(Langevin等人，2007年). 类似地，Wang等人使用双皮质素起始密码子上游3.7 kb的基因组片段作为启动子，以驱动绿色荧光蛋白（GFP）或DsRED的表达，重述了皮层未成熟、迁移神经元中双皮质素的表达。此外，作者使用不同结构的电穿孔来快速识别DCX启动子中的基本调控序列。作者表明，3.7 kb区域内的2 kb序列对DCX表达细胞中报告基因的表达至关重要(Wang等人，2007年). 因此，IUE不仅可以用于指导细胞特异性表达，还可以作为一种相对快速的筛选来识别启动子区域。

作为使用启动子标记新皮质祖细胞亚群的明确证明，Gal等人（2006），使用不同的启动子在心室区祖细胞中驱动GFP和DsRED2(Gal等人，2006年). 假定在神经元前体细胞（Tα1）和放射状胶质细胞（BLBP和GLAST）中具有特异性活性的启动子被用来在具有不同形态的VZ表面细胞中差异地驱动荧光蛋白的表达。质粒pTα1-EGFP标记的心室表面圆形细胞缺乏长的放射状突起，而pBLBP-EGFP和pGLAST-EGFP则标记具有典型放射状胶质形态的细胞(Gal等人，2006年). 通过共电穿孔实验，作者进一步表明，转染不同启动子结构的细胞之间缺乏重叠。尽管这些VZ启动子在产生不同细胞类型的祖细胞中是否具有活性仍有待确定，但结果表明，启动子活性的差异可用于标记VZ表面的细胞亚群。总的来说，使用转染时间和不同的启动子将非常有助于确定不同新皮质祖细胞之间潜在的机制异质性。例如，此类启动子可用于驱动RNAi或显性负性蛋白的shRNAs差异表达，以确定在调节迁移或增殖的机制中，祖细胞类型之间是否存在差异。

交叉救援和组合RNAi

除了细胞特异性表达外，IUE还用于识别基因之间的功能相互作用。由于至少有4种质粒以80%以上的速度共转染，因此有可能在同一细胞群中结合多个RNA和多个转基因表达。通过结合针对不同靶点的RNA，可以测试击倒基因靶点组合的协同、拮抗或饱和效应。同样，交叉拯救实验（即用不同的转基因表达拯救RNAi表型）可用于测试另一个基因是否是特定RNAi靶的下游基因。允许组合RNAi和交叉救援的结果Young-Pearse等人（2007）显示App在神经元迁移中发挥作用，尽管与Dab1相互作用，但至少部分如此。App和Dab1的RNAi协同损害迁移，而Dab1过度表达部分缓解了针对App的RNAi导致的迁移障碍(Young-Pearse等人，2007年). 同样，Tsai等人（2007年）将抗Lis1的RNAi与动力蛋白突变体的表达结合起来，表明Lis1和动力蛋白在径向迁移中发挥双重作用(Tsai等人，2007年). RNAi表型的拯救也可以用于快速定义神经元迁移所必需和足够的蛋白质结构域。例如，Wang等人（2006年）转染了靶向Dyx1c1的shRNA表达质粒以及Dyx1c编码序列的不同截断(Wang等人，2006年). 该方法用于将神经元迁移中Dyx1c1的功能必要和充分区域缩小到C末端的120个氨基酸(Wang等人，2006年)。

条件表达与条件RNAi

条件表达系统已经开发出来并应用于IUE实验，以诱导转基因的细胞和时间特异性表达(Matsuda和Cepko 2007). 在这种方法中，从转染质粒中表达的重组酶可用于以细胞和时间特异性的方式对RNAi或任何其他转基因shRNAs的表达进行筛选。这个2质粒系统使用一个质粒来驱动Cre-regusise的表达，另一个质粒包含loxp序列侧翼的新多肽a序列，在表达第二个转基因产物之前必须通过重组去除这些序列(Matsuda和Cepko 2007). 如果cre重组酶的表达受细胞类型特异性启动子的控制，那么第二个转基因的表达仅在那些能够激活细胞特异性启动子的细胞中被门控。如所示图2这种方法可以有效地驱动皮层VZ祖细胞中荧光蛋白的表达。如所示图2当条件报告质粒（pCALNL-GFP）与Cre表达质粒（pNestin-Cre）共转染eGFP报告质粒时，系统几乎没有泄漏。这种方法也可用于在祖细胞亚群中筛选RNAi，或对启动子瞬时激活的祖细胞进行命运图绘制。由于重组构建物具有普遍存在的启动子，即使在细胞成熟时祖细胞启动子不再活跃后，细胞仍将继续表达普遍存在启动子的报告蛋白。此外，与病毒或基于遗传的命运定位不同，由于IUE质粒是外显体的，并且在连续的细胞分裂后丢失，因此这种方法的命运定位可能仅限于新的有丝分裂后细胞，而不是谱系的所有后续成员。如果目标是追踪几乎在同一时间点经历最终分裂的细胞的命运，这可能是一个优势。

为了设计实验，确定特定基因在发育过程中任意选择的时间的作用，有必要通过添加一些药物来有条件地激活转基因的表达。在转基因动物中广泛使用的一个这样的系统是基于Cre重组酶与三苯氧胺结合位点的融合蛋白。Matsuda和Cepko（2007年）基于三苯氧胺受体-核心融合的改良版本，开发并证明了一种适用于视网膜和皮层IUE的优雅条件表达系统。在他们的系统中，他们表明，重要的是使用与位于N和C末端的三苯氧胺受体融合的Cre版本，以防止在没有三苯氧酚的情况下活性Cre的泄漏。产生的蛋白质ER^t2时间-Cre急诊室^t2时间只有当它与三苯氧胺结合时，才会通过受体介导的转运转运到细胞核。一旦进入细胞核，它可以在loxp位点诱导定向重组。Matsuda和Cepko表明，在没有三苯氧胺的情况下，没有重组，这可以通过报告质粒的表达来证明。他们进一步表明，诱导系统可用于RNAi实验中shRNAs表达的闸门。在演示该方法的威力和多功能性时，他们表明通过表达ER^t2时间-Cre急诊室^t2时间通过特异性激活杆状光感受器祖细胞的启动子，可以产生细胞型特异性的、暂时诱导的转基因表达。该系统开发的另一个重要和显著的特点是，通过单次注射三苯氧胺可实现诱导表达，这允许shRNA或其他转基因在时间上精确表达。随着这套工具被添加到IUE中，理论上现在几乎可以在任何发育阶段的任何时候控制shRNAs或其他转基因在几乎任何类型的皮层神经元中的表达。

有条件RNAi救援

条件表达系统使测试新的发展可能性和特性成为可能。例如，我们最近将条件表达与RNAi相结合，以探讨皮层神经元迁移过程中是否存在一个关键时期，即停滞的迁移可以重新激活。更具体地说，我们将这种方法应用于我们之前开发的由子宫内针对Dcx的RNAi产生的皮质下带异位模型(Bai等人，2003年). 我们使用ER有条件地重新表达Dcx^t2时间-Cre急诊室^t2时间上述系统旨在研究即使在围产期大脑皮层形成皮质畸形后，Dcx RNAi后延迟再导入Dcx是否可以重新启动向正常位置的迁移（图3）。我们的结果表明，即使在长时间的延迟之后，迁移确实可以成功地重新开始，导致先前位置错误的神经元定居到适当的上层皮层中(Manent等人，2009年). 此外，在P5岁以下的儿童中，有显著的再迁移现象，这表明发育可塑性可以在较长的时间内得到控制，以改善皮质畸形。此外，甚至在P10晚期，Dcx的重新表达也可以使神经元向适当的迁移靶点转移。具有潜在临床意义的是，这项研究还表明，在迁移重新激活后，功能性损伤，即癫痫敏感性增加，恢复到控制水平。条件救援方法是一类实验的一般示例，这些实验可以用来确定发育中皮层的发育可逆性和脆弱性。我们预计，未来的实验将用于确定显示不同程度可逆性的中断类型，并确定激活后可能改善与皮质发育畸形相关的功能缺陷的信号通路。

未来展望

IUE的一个潜在局限性，类似于疱疹病毒等DNA病毒，是IUE引入的转基因似乎仍然存在于胞外，并且在连续的细胞分裂后从细胞中丢失。我们和其他人发现，在有丝分裂后的细胞中，外体转基因在转染后的数月内保持活性(Ramos等人，2006年). 然而，通过IUE传递整合到基因组中的转基因可能是可取的。一种可能的策略是piggyBac转座酶，该酶已被证明在哺乳动物细胞中有效整合转基因(Ding等人，2005年;Shinohara等人，2007年). IUE的另一个潜在改进领域是增加可转染细胞的数量。目前，数千个细胞可以被转染，但VZ表面仍有许多细胞未被转染。提高转染率的可能性包括电穿孔与转染试剂、超声脉冲或短激光脉冲相结合(Wells 2004年). 此外，IUE越来越多地与鼠标敲除模型结合使用。IUE和条件性小鼠敲除的一个特别强大的组合是电穿孔条件性活性cre质粒pCAGGS-ER^t2时间-Cre急诊室^t2时间，进入携带条件敲除等位基因的小鼠。这种镶嵌分析在区分细胞自主和非细胞自主迁移和分化机制方面非常有用。

致谢

参考文献