J自动免疫。作者手稿；PMC 2013年12月7日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院534809
CXCL10通过预防NK细胞介导的肝星状细胞失活促进肝纤维化
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伊迪丝·欣特曼
一法兰克福制药公司/ZAFES，德国法兰克福约翰·沃尔夫冈·歌德大学
莫妮卡·拜耳
一法兰克福制药公司/ZAFES，德国法兰克福约翰·沃尔夫冈·歌德大学
Josef M.Pfeilschifter
一法兰克福制药公司/ZAFES，德国法兰克福约翰·沃尔夫冈·歌德大学
安德鲁·卢斯特
b条美国马萨诸塞州查尔斯敦哈佛医学院马萨诸塞总医院
乌尔斯·克里斯滕
一法兰克福制药公司/ZAFES，德国法兰克福约翰·沃尔夫冈·歌德大学
一法兰克福制药公司/ZAFES，德国法兰克福约翰·沃尔夫冈·歌德大学
b条美国马萨诸塞州查尔斯敦哈佛医学院马萨诸塞总医院
摘要
趋化因子，如CXCL10，通过向肝实质募集白细胞，在慢性或急性肝损伤中促进肝脏炎症。CXCL10受体CXCR3在白细胞亚群上表达，在Th1依赖性炎症反应中起重要作用。在这里，我们研究了CXCL10在化学诱导肝纤维化中的作用。我们使用四氯化碳（CCl4)引发野生型C57BL/6和CXCL10-缺陷小鼠的慢性肝损伤。用天狼星红染色评估纤维化程度，用免疫组织化学方法检测肝内白细胞亚群。我们进一步分析了肝星状细胞（HSC）的分布和活化，并研究了CXCL10对HSC运动和增殖的影响。为了证明可能的治疗干预策略，我们检测了中和抗CXCL10抗体的抗纤维化潜力。CCl时4与野生型小鼠相比，CXCL10-缺陷小鼠的肝纤维化显著减轻。CXCL10缺陷小鼠肝脏内的B、T淋巴细胞和树突状细胞浸润较少，HSC的数量和活性降低。相反，CXCL10缺陷小鼠的自然杀伤（NK）细胞更为丰富，NK细胞数量多的区域颗粒酶B表达增加。进一步的详细分析表明，HSC表达CXCR3，对CXCL10产生反应，并在IFNγ刺激下分泌CXCL10。用中和抗体阻断CXCL10显示出显著的抗纤维化作用。我们的数据表明CXCL10是一种促纤维化因子，参与肝细胞、HSC和免疫细胞之间的串扰。NK细胞似乎在控制HSC活性和纤维化方面发挥着重要作用。CXCL10阻断可能构成肝纤维化的治疗干预。
关键词：肝纤维化、炎症、细胞贩运、肝炎、趋化因子
1.简介
肝纤维化是大多数慢性肝损伤常见的瘢痕反应，可由病原体（肝炎病毒、，杜氏利什曼原虫、曼氏血吸虫)酒精滥用、化学毒素、代谢综合征（非酒精性脂肪性肝炎，NASH）的副作用或自身免疫性肝病，如自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）或原发性硬化性胆管炎（PSC）[1–8]. 肝纤维化的特征是细胞外基质（ECM）蛋白的积聚，以及ECM类型从正常基底膜样基质转变为富含纤维胶原的基质。ECM成分异常会破坏所有常驻肝细胞分化功能的持续，导致肝硬化、门脉高压，最终导致肝衰竭[1–三,9]. 在细胞水平上，有害物质破坏肝细胞，诱导炎性细胞的募集和枯否细胞的激活，导致细胞因子、趋化因子和生长因子的释放[6,10,11]. 这种炎症环境中的主要靶细胞是HSC，它从静止的类视网膜存储间充质细胞转变为活化的肌成纤维细胞，表达α-平滑肌肌动蛋白（αSMA），主要负责加速纤维化组织中ECM的生成[1,三,9–11]. 然而，HSC本身表达多种可溶性因子，抗原呈递细胞参与复杂的细胞串扰[6,10,12].
负责炎症细胞募集和定位到组织损伤或感染部位的一种重要趋化因子是CXCL10（IP10，IFN-诱导蛋白10）[13–19]. 它与CXCL4（PF4，血小板因子4；一种非常弱的配体）、CXCL9（Mig，由IFNγ诱导的单因子）和CXCL11（I-TAC，IFN诱导的T细胞α-趋化剂）共有的受体CXCR3结合[20]在CD4和CD8 T细胞、NK细胞、B细胞和树突状细胞（DC）上表达[21–23]. 一些研究表明CXCL10在肝内炎症和纤维化的发展中发挥作用。首先，在慢性乙型和丙型肝炎患者中，编码CXCL10和CXCR3的基因表达上调，表达水平与疾病严重程度相关[24–27]. CXCL10由靠近CXCR3的小叶炎症区的肝细胞分泌+CD8 T细胞[25,27]. 其次，发现AIH患者血清CXCL10水平升高[26]. 第三，在PBC患者及其亲属中，CXCL10的血浆水平和CXCR3的频率+细胞被上调[26,28]. 有趣的是，CXCL10在门脉区表达明显，其中CXCR3+发现了主要是CD4 T细胞的细胞[28].
小鼠胆道结扎、伴刀豆球蛋白A治疗和CCl中毒损伤4，D-半乳糖胺或亚甲基二苯胺导致CXCL10 mRNA合成增加[29,30]. 在三分之二肝切除术后也观察到CXCL10的诱导，这是一种强烈的再生反应。CXCL10对肝细胞的直接促有丝分裂作用无法证明[30]. 然而，经CXCL10治疗后，人成纤维细胞系分泌出有效的肝丝裂原肝细胞生长因子，注射CXCL10的小鼠表现出CXCR2表达增加，CXCR2是一种已知的肝保护受体[30–32]. 这些发现表明CXCL10在肝脏再生中具有间接刺激作用。相反，Yoneyama等人报道了CXCL10对肝细胞增殖的抑制作用[33].
在本研究中，我们试图研究细胞因子在肝纤维化中的作用。由于刀豆球蛋白A或LPS诱导的肝损伤取决于T细胞或B细胞/巨噬细胞的激活[34,35]，我们决定使用CCl4-介导的肝损伤，以避免特定淋巴细胞亚群的活化，但诱导一般的肝毒性。CCl炎症因子的初步筛选4-我们检测到CXCL10的表达显著增加。因此，我们使用CXCL10缺陷型（CXCL10–/–)小鼠，并观察到缺乏CXCL10会导致更温和的纤维化形式，肝浸润的B和T淋巴细胞数量减少，但NK细胞增加，这突出了CXCL10在化学诱导肝损伤中的促纤维化作用。
2.材料和方法
2.1. 小鼠，CCl4给药和抗体治疗
CXCL10系列–/–小鼠处于C57BL/6背景[16]. 野生型C57BL/6小鼠购自荷兰哈兰（荷兰霍斯特）。四氯化碳（CCl4)来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。CCl公司4通过腹腔注射5μl CCl，每周对6-8周龄的动物进行两次治疗4在玉米油中稀释1:20。每组和每种情况使用五只动物。实验至少进行了3次。仓鼠抗鼠CXCL10单克隆抗体（1F11[17])从第一次CCl前6小时开始，每只小鼠每周三次，每次50μg或100μg，在100μl PBS中4注入。作为对照，使用同型匹配的仓鼠IgG Ab（美国亚利桑那州伯明翰市南方生物技术公司）。所有动物实验均已获得德国达姆施塔特当地动物伦理审查委员会的批准。
2.2. HSC隔离
HSC通过蛋白酶-胶原酶法和12%Nycodenz梯度（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）从小鼠肝脏中分离，如[36]. 将分离的细胞培养在37°C下补充有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%抗生素溶液的DMEM中。HSC纯度通过油红O染色测定，显示典型的脂滴光镜外观(，左侧面板）。
慢性CCl后HSC富集细胞池表达CXCL104治疗或IFNγ刺激在体外（A）使用从CCl处理的C57BL/6小鼠HSC中分离的总RNA进行核糖核酸酶保护试验4用于指示的时间点。为了制备富含HSC的细胞池，每个时间点对5只动物的肝脏进行胶原酶/蛋白酶消化，然后进行密度梯度细胞分离。条形图表示CXCL10 mRNA相对数量的量化，这些相对数量标准化为每个细胞池中GAPDH mRNA的信号强度。描述的是时间点d0设置为1的折叠诱导。（B和C）HSC池已与6个CXCL10隔离–/–或6只野生型C57BL/6小鼠。（B） 左面板：油红O染色显示我们的制备物的HSC纯度>90%。中央面板：在IFNγ刺激（10 ng/ml）24小时后，CXCL10–/–HSC未生产CXCL10。右图：野生型HSC在IFNγ刺激下分泌CXCL10。比例尺=20μm。（C） 培养的HSC未经处理，或在纯化总RNA之前用IFNγ以10 ng/ml或100 ng/ml刺激指定的时间点。用RPA分析CXCL10或GAPDH编码mRNA。信号已经被标准化为未刺激的野生型对照。的代表n个= 3.
2.3. 核糖核酸酶保护试验（RPA）
使用新鲜分离的HSC或将HSC接种在补充有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%抗生素溶液的DMEM中的6孔板中。第二天，用PBS清洗细胞，并在补充有1%牛血清白蛋白和1%抗生素溶液的DMEM中饥饿血清24小时。然后，用IFNγ（PeproTech，英国伦敦）刺激细胞指定时间。根据制造商的方案，使用Trizol（Invitrogen，Karlsruhe，Germany）分离总RNA。使用8微克总RNA与32含有各种趋化因子特异探针的P-UTP标记多模板集（Riboquant，mCK-5，BD Biosciences，San Diego，CA，USA）。根据制造商指南进行RPA。使用Pharos成像系统（德国慕尼黑Bio-Rad）对产生的分析性丙烯酰胺凝胶进行扫描。使用Quantity One Software（德国慕尼黑Bio-Rad）量化与受保护mRNA相对应的条带强度，GAPDH是一个参考基因。
2.4. 免疫组织化学
在指定的时间收获肝脏，将其浸泡在Tissue-Tek O.C.T.（荷兰佐特沃德Sakura Finetek）中，然后在干冰上速冻。在-20°C的EtOH中切割并固定7μm切片，在PBS中清洗后，包括鸟-生物素阻断步骤（Vector laboratories，Burlingame，CA，USA）。初级抗体和生物素化二级抗体（Vector laboratories，Burlingame，CA，USA）分别与各切片孵育60分钟，通过与鸟苷过氧化物酶结合物（Vectors laborators，Burling ame，CA和USA）和二氨基苯扎定-过氧化氢连续孵育获得显色反应。使用的主要抗体有：大鼠抗小鼠CD4、大鼠抗鼠CD8α、大鼠抗鼠CD19和大鼠抗老鼠CD45R/B220 mAbs（均来自BD Biosciences，San Diego，CA，USA）、大鼠抗体F4/80 mAb（AbD Serotec，Raleigh，NC，USA，美国）、多克隆兔抗人结蛋白抗体（abcam，Cambridge，UK）、，兔抗颗粒酶B抗体（abcam，Cambridge，UK）、兔抗Ki67抗体（abcam，Cambridge，UK）、生物素化仓鼠抗小鼠CD11cmAb（eBioscience，San Diego，CA，USA）、山羊抗NKp46抗体（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）和兔抗小鼠胶原I抗体（Chemicon，Temecula，USA）。为了观察HSC中CXCL10的生成，将饥饿的细胞在含有0.5%FCS和10 ng/ml IFNγ的培养基中培养8 h，然后更换培养基，用10 ng/ml IFNγ和2μg/ml Brefeldin A处理细胞15 h。将细胞固定在4%多聚甲醛中，并用多克隆兔抗小鼠CXCL10抗体（PeproTech，London，UK）对CXCL10进行染色，如上所述。用小鼠抗人αSMA单克隆抗体（1A4，DakoCytomation，Glostrup，Denmark）和载体MOM试剂盒（Vector laboratories，Burlingame，CA，USA）对αSMA进行染色。天狼星红染色是通过在含有0.1%饱和苦味酸的天狼星红色溶液中孵育含乙醇的冰冻切片1小时来完成的（美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德电子显微镜科学公司）。切片在2次更换的0.01 N HCl中清洗2 min，在水中漂洗，在3次更换的无水乙醇中脱水，每次干燥1 min，在2次更改的二甲苯中培养并安装在Roti-Histokitt（德国卡尔斯鲁厄州罗斯）。通过分析每只动物的7个肝脏切片来评估相对纤维化面积，以占肝脏总面积的%表示。在×10倍放大下获取视野，然后使用计算机形态测量系统Quantity One（德国慕尼黑Bio-Rad）进行分析。结果为平均值±SEM(n个= 7).
2.5. 流式细胞术
从6只幼年小鼠或6只接受CCl治疗的小鼠分离出的HSC4培养4周后，分离并清洗。对细胞进行CXCR3表面表达染色，然后进行固定、渗透和细胞内GFAP染色，如前所述[37]. APC结合的大鼠抗鼠CXCR3单抗来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国），Alexa488-结合的抗GFAP单抗来自Chemicon（特梅库拉，美国）。使用FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences，德国海德堡）采集样本。
2.6. Transwell迁移分析
在完整培养基中，以200000个细胞/孔的速度将新分离的HSC接种在Transwell插入物（8μM孔径，Corning Costar，Chorges，France）的上腔中。下室中充满补充有20 ng/ml重组小鼠CXCL10（英国伦敦PeproTech）的培养基。分析在37°C下培养长达3天。每天更换下腔中的培养基±CXCL10。为了阻止细胞迁移，将细胞固定在甲醇中并用结晶紫染色。用棉签擦拭膜上侧的细胞，并对通过孔迁移到膜下侧的细胞进行量化。在每个过滤器中，拍摄10个单独区域的照片，并对细胞进行计数。检测重复进行三次。结果为平均值±标准偏差(n个=3）。
2.7. 蛋白质免疫印迹
总蛋白提取物在含有1%Triton X-100和完整EDTA无蛋白酶抑制剂混合物的PBS中制备（德国曼海姆罗氏诊断公司）。蛋白质（100μg/lane）在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上溶解。免疫印迹与多克隆兔抗人结蛋白抗体（abcam，英国剑桥）或兔抗GFAP抗体（DakoCytomation，Glostrup，丹麦）在4°C下孵育过夜，然后与小鼠抗HSP70单克隆抗体（abcasm，英国坎布里奇）依次孵育。用ECF底物Vistra（英国白金汉郡Amersham Biosciences）和Pharos FX Plus成像系统（德国慕尼黑Bio-Rad）观察碱性磷酸酶结合二级抗体（德国慕尼黑Bio-Rad）。2个野生型和2个CXCL10的寿命–/–对动物进行分析。
2.8. 血清转氨酶测定
使用RANDOX ALT/AST试剂盒（RANDOX，Crumlin，UK）进行丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶活性测定。测试每组5只小鼠的血清。结果为平均值±标准偏差(n个=5）每种情况。
2.9. 统计分析
Student对参数数据进行了分析t吨测试。的值P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
3.结果
3.1. CXCL10促进肝纤维化
我们在C57BL/6小鼠中的初步研究表明，暴露于慢性CCl的小鼠肝脏中CXCL10 mRNA上调4治疗。从5例CCl肝池中获得的HSC富集组分中CXCL10 mRNA表达的动力学分析4-每次给药的小鼠在表达高峰时（给药第4周）CXCL10的表达上调了10倍(). 接下来，我们确定是否隔离HSC()有潜力生产CXCL10在体外为此，我们处理了从野生型或CXCL10分离的血清缺乏细胞–/–用10 ng/ml重组IFNγ对小鼠进行细胞内CXCL10染色。与CXCL10隔离的HSC相反–/–小鼠，野生型HSC在刺激24小时内容易产生CXCL10(). 核糖核酸酶保护试验显示野生型HSC组成性表达少量CXCL10 mRNA，而CXCL10中未检测到CXCL10信号–/–高速列车(). 在IFNγ刺激下，野生型HSC随时间增加CXCL10 mRNA的生成，导致CXCL10信息增加80倍以上。当使用100 ng/ml IFNγ时，信号强度没有进一步增加().
为了测试CXCL10在肝纤维化中的重要性，我们将野生型小鼠与CXCL10进行了比较–/–用CCl处理的小鼠4持续4周。天狼星红染色显示，野生型小鼠肝脏门脉周围胶原沉积明显，桥接性纤维化明显(). 相反，CXCL10的肝脏–/–小鼠只是偶尔表现出胶原纤维从门周区域深入肝实质，没有出现桥接纤维化的迹象(). 更具体地说，形态计量分析显示，野生型肝脏的肝纤维化从5.03±0.69%（平均值±SEM）下降到CXCL10的1.68±0.32%–/–肝脏。为了定位这些组织中的HSC，我们使用结蛋白抗体对连续切片进行免疫组化染色，以观察静止和活化的HSC以及αSMA抗体对活化的HSCs进行染色。从CCl获得的肝脏4-经处理的CXCL10–/–在小鼠中，HSC主要分布在血管周围，只有少量显示实质定位。αSMA染色很弱，表明几乎所有HSC都处于非活性状态(). 在野生型小鼠的肝脏中，结蛋白染色更强，大多数结蛋白阳性细胞也呈αSMA阳性(). 在血管周围区域发现活化的HSC，并广泛渗透到薄壁组织中，这解释了这些区域中天狼星红染色纤维的高含量(). 因此，我们的数据表明CCl4治疗触发肝脏中CXCL10的上调，CXCL10在化学诱导的肝纤维化中起着重要作用。在没有CXCL10的情况下，纤维化不那么严重。
CXCL10系列–/–小鼠受到CCl的保护4-诱导纤维化。（A） CXCL10的生平–/–CCl 4周后收获野生型小鼠4治疗。冰冻切片用天狼星红染色以显示胶原纤维（显示了两种不同的放大倍数）。请注意，桥接性纤维化仅在野生型肝脏中可见，而在CXCL10中不可见–/–老鼠。为了定位HSC，相同肝脏的连续切片也用（B）结蛋白和（C）αSMA抗体染色。在没有CXCL10的情况下，HSC总染色（结蛋白，B）和活化HSC染色（αSMA，C）比野生型动物的肝脏弱得多。比例尺=100μm。的代表n个= 8.
3.2. 幼稚野生型和CXCL10的生活–/–小鼠HSC水平和分布没有差异。CCl公司4-野生型和CXCL10诱导的肝细胞损伤相似–/–老鼠
接下来，我们分析了幼稚野生型和CXCL10的肝脏–/–小鼠在HSC定位和/或内容上表现出差异。结蛋白染色显示相似的细胞数量和可比较的HSC分布()免疫印迹显示这些肝脏中表达的GFAP（静止HSC的标志物）和结蛋白数量相等(). 因此，幼稚野生型和CXCL10的肝脏–/–小鼠表现出类似的HSC连接特征。此外，CCl引起的急性肝损伤4在野生型和CXCL10中具有可比性–/–小鼠：第一次CCl后4小时，丙氨酸和天冬氨酸转氨酶（ALT/AST）活性同样增加4注射并在第4天，即下一次CCI前恢复到控制水平4进行注射(). 慢性治疗4周后，野生型和CXCL10的ALT和AST水平仍然相似–/–肝脏(). 因此，减少CCl的纤维化4-经处理的CXCL10–/–肝脏不能用较低的初始HSC数或较高的肝细胞对化学损伤的抵抗力来解释。
Wildtype和CXCL10–/–肝脏在初始HSC数量和CCl对肝细胞的损伤方面相似4HSC表达CXCR3，刺激后CXCR3+HSC的频率增加。（A） 原始野生型和CXCL10肝切片的Desmin染色–/–老鼠。比例尺=50μm。（B） 用GFAP、结蛋白和HSP70抗体对等量的总肝匀浆进行免疫印迹。每组分析两只幼稚动物。（C） 野生型和CXCL10血清中的ALT和AST活性–/–老鼠。首次CCl后4小时或4天收集血清4注射或最后一次CCl后4天（*4d）4治疗。数据表示平均值±SD，n个= 5. （D） 从野生型控制（幼稚）或CCl分离的HSC的FACS分析4-治疗（激活）动物。用CXCR3抗体对每种情况下从6个肝脏分离的细胞池进行表面染色。同时，通过细胞内GFAP染色鉴定HSC。数字表示GFAP的百分比+CXCR3细胞+.
3.3. 静态HSC表达CXCR3和CXCR3+HSC在活化人群中很常见
如果HSC表达CXCL10-特异性受体CXCR3，则HSC可能直接对CXCL10浓度的变化作出反应。利用流式细胞术，我们检测了CXCR3在从原始对照肝或CCl肝分离的HSC中的细胞表面表达4-治疗野生型小鼠。在分析之前，将HSC保存在培养基中20 h。根据油红O染色测定，HSC纯度>90%(，左侧面板）。通过HSC标记物GFAP的细胞内表达染色鉴定HSC[38].显示8.6%的分析的GFAP阳性对照HSC是CXCR3+有趣的是，GFAP的数量+CXCR3型+CCl 4周后纯化的肝脏细胞制剂中的HSC增加到42.4%4处理(). 这些发现表明CXCR3表达细胞在活化的HSC中的频率高于静止的HSC。
3.4. CXCL10刺激HSC迁移，但对HSC增殖无影响
为了测试CXCR3表达是否对HSC迁移有影响，我们进行了趋化性分析。为此，来自控制或CCl的HSC4-在没有或存在20 ng/ml重组CXCL10的情况下，将处理过的小鼠分离并接种在Transwell迁移室中。每24小时更换一次下室培养基。孵育1天或3天后停止迁移，并对迁移到Transwell膜下侧的细胞进行染色和计数。显然，CXCL10在对照组HSC中触发了迁移增加，而CCl的运动性增加4-CXCL10没有进一步扩增暴露的HSC().
CXCL10刺激HSC趋化性，但不刺激增殖。（A） 刚从控制或CCl隔离的HSC4-暴露的动物在Transwell室中播种。用20 ng/ml CXCL10刺激细胞或不处理细胞（无）。培养基每天更新。在指定的时间点停止迁移，并在10个显微镜下对通过Transwell插入物迁移的细胞进行计数。检测重复进行三次。数据为平均折叠感应±SD(n个=3）未经处理的细胞设置为1*P（P）<0.05（CXCL10与未治疗组相比）。CCl的连续肝脏切片4-经处理的野生型或CXCL10–/–用增殖标记物Ki67（B）抗体或天狼星红（C）对小鼠进行染色。Ki67染色见于肝细胞和浸润细胞（箭头）较多的区域。Ki67在高纤维化但低浸润的区域中表达较低（箭头）。野生型和CXCL10的增殖强度相似–/–肝脏。比例尺=100μm。
除迁移外，CXCL10还可能影响HSC的增长。然而，如迁移试验中所述，当用CXCL10处理新分离的野生型HSC时，与未处理的HSC相比，可测量的增殖没有差异（数据未显示）。因此，CXCL10可以刺激HSC的迁移，但不能刺激HSC增殖在体外.分析扩散体内，我们将CCl中的Ki67染色4-野生型和CXCL10治疗过的肝脏–/–老鼠。CXCL10的肝脏–/–小鼠，Ki67染色主要见于肝细胞，在纤维化区域没有明显的增殖增加(，左侧面板）。在野生型小鼠的肝脏中，Ki67阳性细胞又是肝细胞，但也浸润白细胞(，右侧面板，箭头）。然而，Ki67信号在纤维化区域较低，在两种野生型中都有少量浸润细胞(，右侧面板，箭头）和CXCL10–/–老鼠。这表明CXCL10的纤维化减轻–/–肝脏并不是因为缺乏CXCL10时HSC的增殖能力降低，因为CXCL10影响的是HSC的迁移，而不是HSC的生长。
3.5. CXCL10促进淋巴细胞向肝脏迁移
接下来，我们研究了敲除动物中CXCL10的缺失是否会影响CXCR3表达免疫细胞的募集，如活化的T细胞、DC或B淋巴细胞。事实上，组织学检查显示出大量B220+CCl肝细胞4-治疗野生型小鼠()，而只有少数B220集团+CXCL10的肝脏中可见细胞–/–老鼠(). 总的来说，CCl后CD4 T细胞不太显著4B220以外的管理+但CXCL10患者肝脏中浸润的CD4 T细胞数量显著减少–/–小鼠与野生动物肝脏的比较(). CCl后几乎没有检测到任何浸润性CD8 T淋巴细胞4在CXCL10中的治疗–/–和野生型小鼠（数据未显示）。此外，F4/80的频率没有差异+CXCL10之间的单元格–/–和野生型小鼠，这可能是由于F4/80的相对丰度+肝脏库普弗细胞（数据未显示）。对染色切片的定量分析表明，CCl患者的肝脏中4-经处理的CXCL10–/–鼠标B220的数量+和CD4+与野生型小鼠的肝脏相比，细胞分别减少到约37%和51%(). 由于B220既由B淋巴细胞也由DC表达，因此我们也用单克隆抗体对CD19（B细胞标记物）和CD11c（DC标记物）进行染色。CXCL10中这两种细胞类型都不太丰富–/–动物比野生型小鼠(). 这些结果表明，CXCL10是有效吸引B细胞、DC和CD4 T细胞所必需的。
CCl患者肝脏免疫细胞的定位4-经处理的CXCL10–/–和野生型小鼠。用CCl治疗小鼠44周后进行肝脏免疫组织化学染色。野生型（A和C）和CXCL10的组织切片–/–（B和D）小鼠已被B220染色+细胞（A和B）、CD4 T细胞（C和D）、CD19+单元格（未显示）和CD11c+单元格（未显示）。方框区域在原始显微照片下方以较大的放大倍数显示。比例尺=100μm。（E） 从5个独立实验中，每组10只不同动物的10个切片中计算细胞数。相对单元数已归一化为相应的B220数量+，CD19+，CD4+和CD11c+CCl患者肝脏中发现细胞浸润4-治疗野生型小鼠。数据表示平均值±SEM*P（P）<0.05（CXCL10–/–与野生型相比）。
3.6. 抗CXCL10治疗可防止CCl4-诱导性肝纤维化
然后，我们提出了使用中和抗CXCL10单克隆抗体对CXCL10进行治疗性阻断是否可以预防CCl引起的肝纤维化的问题4因此，我们每周向野生型动物注射50 mg或100 mg抗CXCL10 mAb或同型对照IgG三次，从CCI开始前6小时开始4给药4周。当分析胶原蛋白沉积时，CXCL10阻断剂明显降低了肝纤维化(). 形态计量学分析显示，肝纤维化从对照肝的5.02±0.19%（平均值±SEM）降至抗CXCL10 mAb治疗肝的1.05±0.13%。此外，在抗CXCL10单克隆抗体处理的小鼠肝脏中可见较低数量的活化HSC(). 此外，渗透B220的数量+细胞和CD4 T细胞以抗CXCL10单克隆抗体浓度依赖性的方式强烈减少(). 事实上，每只小鼠100μg单克隆抗体在阻断淋巴细胞浸润方面与完全敲除CXCL10基因一样有效。我们的数据提供了证据，表明通过适当的抗体阻断CXCL10可以减少肝细胞浸润，从而可以减少纤维化的形成。
阻断抗CXCL10抗体可减少肝纤维化和浸润B220的数量+细胞和CD4 T细胞。每周腹腔注射野生型小鼠三次50μg或100μg阻断性抗CXCL10 mAb，每周两次CCl44周后，收集肝脏并用（A）天狼星红（显示两种不同的放大倍数；标尺=100μm）、（B）抗αSMA抗体或（C）B220或CD4抗体（未显示染色）对冰冻切片进行染色。左图（A和B）显示了用100μg抗CXCL10 mAb处理的小鼠的肝脏切片。对照组小鼠接受100μg同型匹配的对照抗体（右图A和B）。B220型+从2个独立实验中，每组5只不同动物的10个切片中计数细胞和CD4 T细胞。数据表示平均值±SEM*P（P）<0.05（CXCL10–/–或抗CXCL10抗体治疗与同种对照）。
3.7. 在缺乏CXCL10的情况下增加NK的存在可防止肝纤维化
由于CXCR3在NK细胞上显著表达，我们进一步想研究CXCL10在慢性CCl期间如何影响NK细胞4暴露。有趣的是，用NK标记物NKp46抗体对肝脏切片进行染色显示，在没有CXCL10的情况下，可能是由于基因缺失（CXCL10–/–老鼠；，中间面板）或抗体中和（阻断抗CXCL10 mAb；，右侧面板）浸润NK细胞的数量增加了7倍以上()与野生型肝脏相比，CCl 4周后4处理(，左侧面板）。众所周知，NK细胞可以杀死活化的HSC[39,40]接下来，我们测定了αSMA在连续切片中的表达水平。事实上，激活的HSC在CCl中仅为数众多4-在NKp46染色较弱的区域治疗对照肝脏(，左侧面板）。然而，在CCl中4-CXCL10的暴露肝脏–/–用阻断性抗CXCL10 IgG、αSMA抗体治疗的小鼠或野生型小鼠的αSMA水平较低(，中间和右侧面板），与此类肝脏中观察到的纤维化减少相关(和). 这些发现表明CXCL10–/–小鼠受到CCl的保护4-NK细胞浸润率较高导致肝纤维化，这可能是HSC活化频率降低的原因。NK细胞通过涉及穿孔素和颗粒酶B的经典机制杀死活化的HSC[41]. 分析CCl的连续部分4-对野生型肝脏进行治疗后，我们检测到NK存在区域中颗粒酶B表达适度，但αSMA水平较高(，上部面板）。然而，在CXCL10中–/–肝脏中，颗粒酶B在NK细胞含量升高和αSMA阳性HSC数量较少的区域高表达。(，下部面板）。总之，我们的研究结果表明，在CXCL10中观察到的活化HSC的频率较低–/–肝脏是由于NK触发的颗粒酶B依赖性细胞毒性杀死HSC，从而减少肝纤维化。
在缺乏CXCL10的情况下，越来越多的NK细胞浸润肝脏，并通过颗粒酶B依赖机制清除活化的HSC。CCl开始后第4周采集的肝脏连续组织切片4给药后对NKp46、αSMA或颗粒酶B进行染色。（A）NK细胞数量低，野生型小鼠肝脏中经常出现αSMA表达细胞（左图）。相反，CXCL10患者肝脏中NK细胞的数量增加了8.12±1.18倍，αSMA表达细胞稀少–/–鼠标（中间面板）。同样，αSMA表达较低，用抗CXCL10抗体处理的小鼠（100μg腹腔注射，每周三次）的NK细胞比野生型小鼠多7.53±0.94倍。比例尺=100μm。从2个独立实验中，每组5只不同动物的4个切片中计算细胞数。相对细胞数已归一化为相应的NKp46数量+CCl患者肝脏中发现细胞浸润4-治疗野生型小鼠。数据表示平均值±SEM*P（P）<0.05（CXCL10–/–或抗CXCL10抗体治疗与对照）。（B） 在野生型肝脏中，颗粒酶B染色较弱，这与NKp46表达细胞数量较少有关。相反，αSMA阳性细胞非常丰富（上表）。在CXCL10中–/–肝脏中，αSMA表达细胞很少，而NK细胞数量较高，颗粒酶B表达较强（下表）。比例尺=100μm。
4.讨论
我们报告说，在没有CXCL10的情况下，CCl4-诱导的肝纤维化不太严重，CD4 T细胞、DC和B220的募集+受影响肝脏的细胞严重减少。相反，CXCL10中浸润NK细胞的数量显著增加–/–小鼠以及野生型C57BL/6小鼠，用中和抗CXCL10抗体治疗。此外，我们发现HSC表达CXCR3并对CXCL10作出反应，运动性增加。有趣的是，HSC在IFNγ刺激下分泌CXCL10。我们的发现表明HSC和CXCR3的一个子集+CXCL10将免疫细胞吸引到肝损伤部位。重新定位的HSC自身可能分泌CXCL10，因此可能随后进一步增加肝脏浸润。
先前的研究表明，在人和小鼠中，中毒性损伤导致的慢性肝损伤、病原体或自身免疫性肝病导致CXCL10表达增加。重要的是，这些CXCL10水平与炎症程度相关[24–30]. 因此，我们发现CCl中CXCL10 mRNA增加并不奇怪4-暴露的小鼠肝脏。
肝细胞是肝脏中CXCL10的主要来源。在慢性乙型和丙型肝炎以及AIH和PBC患者中，但在对照组中没有，小叶肝细胞表达CXCL10并吸引浸润的CXCR3+淋巴细胞[25–27]. 此外，原代大鼠肝细胞在IFNγ刺激后分泌CXCL10[42]. 重要的是，当暴露于CCl时，肝细胞系AML-12表达CXCL104[30]这表明，炎症细胞甚至还没有到达损伤部位，就已经对细胞损伤产生了直接的实质性反应。发现小鼠HSC表达CXCR3并对CXCL10反应，运动增强（我们的观察和[43])这可能是我们观察到野生型HSC比CXCL10聚集更明显（结蛋白染色更强）的原因之一–/–受损肝细胞主要位于门脉区。吸引的HSC随后可能被肝细胞激活，导致αSMA表达上调，在我们的研究中，CCl患者的肝脏中这种上调作用更强4-处理野生型比CXCL10–/–老鼠。有趣的是，我们还发现HSC在受到IFNγ刺激时上调CXCL10的表达在体外这一发现表明，通过浸润产生IFNγ的T细胞，吸引到受损肝细胞的HSC可能被进一步刺激分泌CXCL10。这表明免疫细胞和HSC之间存在复杂的串扰，支持霍尔特等人提出的数据，表明人类HSC调节淋巴细胞迁移和粘附在体外[44].
在各种疾病模型中，CXCL10需要招募不同类型的免疫细胞到组织损伤部位，并且在炎症和自身免疫中发挥关键作用[13–15,17,45–50]. CXCL10系列–/–小鼠天生免疫系统完整。然而，它们显示T细胞反应受损，T细胞增殖减少，T细胞浸润炎症组织以应对抗原挑战[16]. 当我们治疗CXCL10时–/–CCl小鼠4我们观察到B细胞、DC和CD4 T细胞的侵袭减少，而招募的CD8 T细胞数量与野生型动物相似。CD19的重要性+B220型+Novobrandtseva等人已经记录了肝脏疾病中的B细胞[51]. 在CCl模型中4-诱导的肝损伤，B细胞缺陷小鼠表现出减少的纤维化，并且这种作用是抗体无关的。似乎在没有B细胞的情况下，F4/80+巨噬细胞能更有效地清除濒死的肝细胞，从而减少活化的HSC数量，从而减少胶原沉积[51]. 此外，可以推测活化的B细胞本身可以通过释放细胞因子作用于HSC。此外，CD4 T细胞在CCl中没有发挥重要作用4-诱导肝损伤，因为缺乏CD4 T细胞的小鼠的纤维化程度与野生型小鼠一样严重[51]. 因此，我们观察到CXCL10患者的肝脏中CD4 T细胞较少–/–小鼠而非野生型动物可能是B细胞缺失的结果，而不是减少纤维化的原因。
我们研究中最有趣的观察结果可能是CCl中NK细胞数量的增加4-暴露的CXCL10–/–肝脏。以前的研究表明，NK细胞表达CXCR3，CXCL9和CXCL10的中和作用减少了乙型肝炎病毒感染后NK细胞向肝脏的募集[52]. 在Con A诱导的肝炎中，NK从循环向肝脏的募集是巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP-1α）依赖性的。然而，NK细胞从脾脏进入循环的最初动员是由CXCL9触发的，而不是由CXCL10触发的[53]. 考虑到CXCL9的配体效力不如CXCL10[54]可以想象，在没有CXCL10的情况下，CXCL9的作用比正常情况下更强，因为两种配体之间不再存在与CXCR3结合的竞争。因此，CXCL9在动员CXCL10中的NK细胞方面具有更高的潜力–/–老鼠比野生动物多。在缺乏NK细胞（除缺乏B细胞和T细胞外）的SCID-BEIGE小鼠中，CCl4与SCID小鼠相比，治疗引发了更强的纤维化（缺乏B和T细胞），再次强调了NK细胞的抗纤维化潜力[55]. 重要的是，慢性丙型肝炎患者的NK细胞活性与肝纤维化呈负相关[40]. NK细胞的抗纤维化作用被证明是通过其特异性杀伤早期激活但非静止HSC的能力介导的[39,41,55]. HSC杀伤是由于NK细胞活化配体维甲酸早期诱导基因1（RAE-1）的上调引起的，并且涉及穿孔素/颗粒酶B依赖的细胞毒性[41,56]. 同样在我们的实验中，活化的HSC是颗粒酶B连接细胞死亡的靶点。
最后，一项重要发现是，用中和性抗CXCL10单克隆抗体治疗成功地显著减少了肝纤维化。因此，开发调控CXCL10/CXCR3转运途径的试剂可能是减少肝纤维化的有效治疗策略。然而，这些试剂需要对CXCL10途径具有高度的特异性，如CXCR3–/–暴露于CCl后，小鼠肝纤维化加重4[57]. 在缺乏CXCR3的情况下，CXCL9可能不再能够招募NK细胞，因此活化的HSC会进一步促进肝纤维化。有趣的是，CXCL10的促纤维化作用似乎是肝脏特异性的，因为博莱霉素治疗的CXCL10肺纤维化更严重–/–老鼠比野生动物[58]. 在这个纤维化模型中，CXCL10抑制成纤维细胞迁移，而白细胞募集不受影响。因此，根据器官的不同，不同的细胞类型可能是CXCL10控制运动的靶点，从而导致CXCL10对纤维化的器官特异性影响。
未来，重要的是研究CXCL10的作用及其中和作用在自身免疫性肝病或慢性病毒感染（如乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染）导致的肝纤维化中的治疗潜力。新型模型系统，如细胞色素P450 2D6（CYP2D6）小鼠模型，使用表达主要人类自身抗原CYP2D的腺病毒诱导自身免疫性肝炎[59]从腺病毒CYP2D6感染的自身免疫开始到自身免疫性肝破坏的最后阶段，这可能是跟踪肝纤维化发展的一个很好的工具。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院R21 DK071577拨款和德国研究基金会对U.C.的拨款以及美国国立卫生研究院对a.D.L.的R01-CA069212拨款的支持。
缩写
| AIH公司 | 自身免疫性肝炎 |
| αSMA | α-平滑肌肌动蛋白 |
| CCl公司4 | 四氯化碳 |
| 直流 | 树突状细胞 |
| 发动机控制模块 | 细胞外基质 |
| HSC公司 | 肝星状细胞 |
| 单克隆抗体 | 单克隆抗体 |
| NK公司 | 自然杀手 |
| 中国人民银行 | 原发性胆汁性肝硬化 |
| 产品分成合同 | 原发性硬化性胆管炎 |
| RPA公司 | 核糖核酸酶保护试验 |
工具书类
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