单元格。作者手稿;PMC 2014年10月10日提供。
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PKM2异构体特异性缺失揭示了肿瘤细胞对丙酮酸激酶的不同需求
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,1 ,三 ,4,5 ,三 ,6 ,7 ,4,8 ,9 ,1 ,7,10 ,三 ,11 ,2 ,三,12和1,4,*
威廉·伊斯雷尔森
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
塔利亚·戴顿
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
肖恩·戴维森
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
布莱恩·菲斯克
1美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院科赫综合癌症研究所02139
亚伦·霍西奥斯
1美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院科赫综合癌症研究所02139
加里·贝林格
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
李杰(音译)
2美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学系,邮编77030
Yimin余
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
米卡·佐佐木
三Beth Israel女执事医疗中心,美国马萨诸塞州波士顿市信号转导医学部,邮编02115
詹姆斯·霍纳
4美国马萨诸塞州波士顿达纳-法伯癌症研究所肿瘤内科
5德克萨斯大学应用癌症科学研究所和基因组医学系M.D.Anderson癌症中心,美国德克萨斯州休斯顿77030(当前地址)
劳拉·N·伯格
三Beth Israel女执事医疗中心,美国马萨诸塞州波士顿市信号转导医学部,邮编02115
谢建新
6Cell Signaling Technology,Inc.,美国马萨诸塞州丹佛市,邮编01923
迈克尔·朱尔恰克(Michael J.Jurczak)
7耶鲁大学医学院内科,美国康涅狄格州纽黑文06510
罗纳德·德皮尼奥
4美国马萨诸塞州波士顿达纳-法伯癌症研究所肿瘤内科
8德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系,德克萨斯州休斯顿,邮编77030(当前地址)
克莱里·克利什
9代谢产物分析平台,美国马萨诸塞州剑桥布罗德研究所02142
泰勒·杰克
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
理查德·基比
7耶鲁大学医学院内科,美国康涅狄格州纽黑文06510
10耶鲁大学医学院细胞与分子生理学系,美国康涅狄格州纽黑文06510
格尔堡·M·伍尔夫
三Beth Israel女执事医疗中心,美国马萨诸塞州波士顿市信号转导医学部,邮编02115
多洛雷斯·迪维齐奥
11加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医疗中心癌症生物学和治疗学部;波士顿儿童医院泌尿疾病研究中心;和美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院外科
戈登·米尔斯
2美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学系,邮编77030
刘易斯·坎特利
三Beth Israel女执事医疗中心,美国马萨诸塞州波士顿市信号转导医学部,邮编02115
12哈佛医学院系统生物学系,美国马萨诸塞州波士顿02115
马修·范德·海登
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
4美国马萨诸塞州波士顿Dana Farber癌症研究所医学肿瘤学系02115
1美国麻省理工学院科赫综合癌症研究所,马萨诸塞州剑桥市,邮编02139
2美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学安德森癌症中心系统生物学系,邮编77030
三Beth Israel女执事医疗中心,美国马萨诸塞州波士顿市信号转导医学部,邮编02115
4美国马萨诸塞州波士顿达纳-法伯癌症研究所肿瘤内科
5德克萨斯大学应用癌症科学研究所和基因组医学系M.D.Anderson癌症中心,美国德克萨斯州休斯顿77030(当前地址)
6Cell Signaling Technology,Inc.,美国马萨诸塞州丹佛市,邮编01923
7耶鲁大学医学院内科,美国康涅狄格州纽黑文06510
8德克萨斯大学安德森癌症中心癌症生物学系,德克萨斯州休斯顿,邮编77030(当前地址)
9代谢产物分析平台,美国马萨诸塞州剑桥布罗德研究所02142
10耶鲁大学医学院细胞与分子生理学系,美国康涅狄格州纽黑文06510
11加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医疗中心癌症生物学和治疗学部;波士顿儿童医院泌尿疾病研究中心;和美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院外科
12哈佛医学院系统生物学系,美国马萨诸塞州波士顿02115
- 补充资料
1
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2
GUID:3668AE2D-8318-407E-ABF1-8BC34B302977
结果
条件PKM2等位基因的产生和鉴定
前mRNA转录自PKM公司通过包含外显子9或外显子10,该基因被剪接以产生PKM1或PKM2 mRNA(). 研究PKM2在肿瘤中的作用体内,我们建立了一个允许PKM2特异性外显子10有条件删除的小鼠模型。外显子10两侧的LoxP位点被引入PKM公司同源重组小鼠胚胎干细胞的定位(,第1部分). 这些ES细胞用于产生嵌合小鼠,通过靶向等位基因的种系传递产生的小鼠与表达FLP重组酶的小鼠杂交,以删除新霉素抗性基因(Neo第页). 这些小鼠的繁殖导致PKM2条件等位基因的传播(PKM2(平方公里)飞行)孟德尔比率。PKM2(平方公里)佛罗里达州/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行后代健康,无明显表型。存在PKM2(平方公里)飞行Southern杂交显示成年小鼠的等位基因(,S1B、S1C). 为了便于饲养和分析,我们制定了基于PCR的策略,以确定PKM2(平方公里)基因型(). 我们接下来试图验证PKM2(平方公里)飞行等位基因通过Cre介导的切除PKM2的表达PKM公司外显子10。老鼠PKM2(平方公里)飞行和诱导型Cre重组酶(Cre-ER公司)将等位基因杂交产生小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行分析。用4-羟基他莫昔芬治疗这些MEFs导致切除PKM公司外显子10PKM2(平方公里)飞行/飞行单元格()western blot分析显示PKM2蛋白在PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司(). 这些数据证实PKM2(平方公里)飞行等位基因允许外显子10缺失和PKM2蛋白生产中断。
PKM2条件小鼠的产生和验证(A) 老鼠PKM公司位点、靶向结构以及由此产生的靶向、漂浮和缺失等位基因。用于Southern blot分析的KpnI位点标记为“K”,靶向载体引入的新KpnI部位标记为“K*”。还显示了用于Southern blot分析的5'和3'探针的位置。
(B) 使用5'探针对KpnI消化的基因组DNA进行Southern blot分析。野生型消化PKM公司等位基因产生一个~8.3kb的片段,而floxed等位基因生成一个~6.0kb的片断。
(C) 基因组DNA的PCR基因分型PKM2(平方公里)+/+,PKM2(平方公里)+/佛罗里达州、和PKM2(平方公里)飞行/飞行老鼠。如(A)中箭头所示,基因分型引物在loxP位点外退火,并从中产生509 bp的扩增子PKM2(平方公里)+等位基因和577bpPKM2(平方公里)飞行等位基因。
(D) PCR基因分型PKM2(平方公里)+/+
Cre-ER公司和PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司使用4-羟基三苯氧胺(TAM)或模拟治疗的MEF。这个PKM2(平方公里)Δ等位基因产生195bp的扩增子。
(E) (D)中所述的来自MEFs的PKM2蛋白的蛋白质印迹分析。另请参见图S1.
在小鼠乳腺癌模型中PKM2缺失加速肿瘤形成并促进肝转移
为了研究PKM2在肿瘤形成中的作用,PKM2(平方公里)条件小鼠与已建立的乳腺癌模型杂交(Xu等人,1999年). 在此模型中巴西航空公司1肿瘤抑制因子巴西航空公司1飞行/飞行
MMTV-核心p53+/-小鼠在大约一岁大的时候会产生乳腺肿瘤。这个PKM2(平方公里)飞行等位基因也应该在该模型中引起肿瘤的表达Cre的上皮细胞中进行重组。由于PKM2在癌症中起着重要作用,我们预计PKM2(平方公里)缺失导致更少的肿瘤或延迟肿瘤发病。令人惊讶的是,PKM2(平方公里)飞行/飞行与小鼠相比,小鼠肿瘤相关死亡率增加PKM2(平方公里)+/+对应方().
PKM公司乳腺肿瘤第10外显子缺失导致死亡率加快和PKM1 mRNA的可变产生(A) Kaplan-Meier生存曲线比较PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行带有巴西航空公司1飞行/飞行
MMTV-核心p53+/-等位基因。
(B) PCR基因分型PKM2(平方公里)等位基因PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ乳腺肿瘤。来自的尾部DNA分析PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行鼠标显示为对照。
(C) PKM2 mRNA水平PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤定量RT-PCR,与正常小鼠组织对照:M,肌肉;H、 心脏;B、 脑;K、 肾脏。
(D) PKM1 mRNA水平PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤定量RT-PCR,与正常小鼠组织对照:K、肾脏;M、 肌肉;H、 心脏;B、 大脑。
(E) PKLR mRNA水平PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ通过定量RT-PCR检测肿瘤,与正常小鼠组织对照:L,肝脏;K、 肾脏。
(F) 未切割[U]和PstI[P]消化的放射自显影照片PKM公司cDNA扩增子。未切割的PKM1和PKM2放大器长度相同(频带1)。PstI仅消化PKM2扩增子以产生带2和带3。三位代表的结果PKM2(平方公里)+/+肿瘤以定量显示。请参见图S2C和E获取如何生成每个频带的示意图。
(G) 未切割[U]和消化的放射自显影PKM公司来自代表性的cDNA扩增子PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。未切割的PKM1和PKM2扩增子具有相同的长度(带1),并且对应于PKM跳过错误剪接产物的扩增子用箭头标记(带3)。NcoI[N]消化PKM1扩增子,PstI[P]消化PKM2扩增子。图S2C、D、F显示如何生成每个频带。
(H) PKM拼接的量化PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤,根据放射自显影确定,如(G)所示。数据显示为平均值±s.e.m,n=4。另请参见图S2.
我们描述了以下肿瘤的特征:PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行小鼠研究导致死亡加速的潜在因素PKM2(平方公里)飞行/飞行老鼠。一种可能是PKM2的缺失改变了增殖和凋亡的平衡。肿瘤切片中增殖标记物Ki-67和凋亡标记物裂解caspase-3的染色未显示基因型之间的明显差异(图S2A). 然而,5例患者中有3例出现了肉眼可见的肝转移PKM2(平方公里)飞行/飞行小鼠与7只中的0只比较PKM2(平方公里)+/+评估小鼠可能的转移(图S2B). 据我们所知,在这种小鼠乳腺癌模型中,还没有报告肝转移。
确认PKM2在肿瘤中被删除PKM2(平方公里)飞行/飞行我们用PCR检测了Cre介导的外显子10缺失的效率。定性删除PKM公司在所有来源于PKM2(平方公里)飞行/飞行老鼠()与野生型肿瘤相比,肿瘤转录物的定量PCR(qPCR)分析显示PKM2 mRNA水平非常低(). 因为PKM2(平方公里)Δ/Δ在mRNA剪接过程中,肿瘤细胞可能通过包含外显子9来产生PKM1蛋白,我们通过qPCR定量了PKM1 mRNA水平。一些PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤的PKM1表达水平较低,与PKM2(平方公里)+/+肿瘤,而其他肿瘤的PKM1 mRNA水平接近大脑中的水平,大脑是一种正常表达PKM1的组织(). 确定是否PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤具有另外两种丙酮酸激酶亚型PKL或PKR的代偿表达,我们通过qPCR检测肿瘤PKLR mRNA水平。我们没有观察到来自PKLR公司任何基因型肿瘤中的基因,表明该蛋白来源于PKM公司基因是唯一存在的丙酮酸激酶().
PKM2缺失导致PKM1或错误剪接mRNA的产生
我们进一步描述了PKM公司肿瘤中mRNA剪接PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行老鼠。外显子9和10的长度相同,但包含独特的限制性内切酶位点,允许PKM1和PKM2转录水平的相对定量(Clower等人,2010年;David等人,2010年). 之间的交替拼接区域PKM公司外显子8和11扩增自PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤cDNA并消化分析(图S2C、S2E). 与qPCR结果一致,PKM2是发现于PKM2(平方公里)+/+肿瘤().PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤显示PKM2 mRNA总体减少,其中PKM1信息占总数的较大比例PKM公司-衍生mRNA(); 然而,这项分析也揭示了在野生型肿瘤中未发现的额外PKM剪接变异体(比较). 这种mRNA物种约占PKM公司成绩单PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤(),通过测序鉴定为第8外显子到第11外显子的剪接(图S2D、S2F、S2G),以下简称为PKM-skip。
的拼接PKM公司产生PKM2转录物的前mRNA包括通过特定剪接因子与交替剪接外显子内序列的结合抑制外显子9内含子和激活外显子10内含子(Clower等人,2010年;David等人,2010年;Wang等人,2012年). 因此,外显子10的缺失和外显子9的抑制可能解释了PKM-skip mRNA物种在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤(Chen等人,2012年). PKM第8外显子到第11外显子的剪接导致第8-11外显子连接处的移码,从而导致38个错义密码子和第11-12外显子上游超过500个碱基对的提前终止密码子(图S2G). 异常拼接PKM公司在外显子11-12连接上游产生提前终止密码子的转录物通过非传感介导的衰变导致信息降解(Chen等人,2012年).
PKM2缺失导致可变的PKM1蛋白水平,但没有PKM-skip蛋白
因为删除PKM2(平方公里)第10外显子并不总是导致第9外显子包含和产生PKM1 mRNA,并且由于PKM1的mRNA水平在不同的肿瘤中差异很大,我们确定了PKM2(平方公里)丙酮酸激酶蛋白水平的缺失PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。肿瘤裂解物的蛋白质印迹证实PKM2蛋白在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤(). 在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤裂解物,丙酮酸激酶的总表达在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤与PKM2(平方公里)+/+肿瘤,即使是PKM1表达最高的肿瘤,其水平也低于表达PKM1的骨骼肌。
PKM公司乳腺肿瘤第10外显子缺失导致PKM蛋白的可变表达(A) PKM2、PKM1和总PKM蛋白水平PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。肌肉和293T细胞裂解物分别作为PKM1和PKM2蛋白对照,GAPDH作为负荷对照。
(B) PKM蛋白PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ使用具有PKM1和PKM2共同表位的单克隆抗PKM抗体观察肿瘤。肌肉和293T细胞裂解物分别作为PKM1和PKM2蛋白对照。全长PKM-skip的大小用箭头标记,PKM-skap降级产品用星号标记。该污点故意过度暴露。
(C) 组织学和染色PKM2(平方公里)+/+肿瘤和三PKM2(平方公里)Δ/ΔPKM2或PKM1的肿瘤。比例尺代表200μm。
(D) 与(C)中相同肿瘤的高倍显微照片。比例尺代表20μm。另请参见图S3.
接下来我们确定PKM-skip mRNA是否在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。野生型PKM1和PKM2均为531个残基,亚基质量约为58kD,而预测的PKM-skip蛋白为418个残基长,预测质量为45kD(图S3A). 为了验证我们可以通过western blot检测PKM-skip蛋白,在大肠杆菌具有N-末端6xHis标签,并使用亲和层析进行纯化。同样的方法用于生产PKM2蛋白,该蛋白作为糖酵解酶具有活性(Anastasiou等人,2012年;Dombrauckas等人,2005年)作为一种假定的蛋白激酶(Gao等人,2012年;Yang等人,2012a). 细菌裂解后,从可溶部分中回收了部分PKM-跳过产物;然而,预期的蛋白质伴随着一系列较小的产物,这些产物与不稳定蛋白质在大肠杆菌(图S3B). 在western blot分析中,全长和较小的多肽都被两种不同的PKM抗体识别(图S3C). 接下来,我们使用重组PKM-skip蛋白作为对照,对肿瘤裂解物进行western blot分析;然而,我们未能在任何肿瘤中检测到小于全长蛋白的条带(). 这些数据表明,PKM-skip蛋白在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。
由于少量的催化活性具有潜在的意义,我们认为假定的PKM跳过我们的检测限可能会保留一些PKM2活性。通过与已发表的PKM2蛋白结构的比较(Christof k等人,2008b;Dombrauckas等人,2005年),PKM-skip蛋白预计缺乏在天然PKM2四聚体中发现的FBP结合位点和二聚体界面(图S3D). 然而,随着一些氨基酸的改变,预测的PKM-skip单体保留了产生活性位点结构域所必需的一级结构(图S3E). 因此,我们评估了重组PKM-skip是否保留催化活性,以及该蛋白是否可以形成二聚体或四聚体。使用尺寸排除色谱法,我们发现重组PKM跳过洗脱体积,与45kD或更小单体的数量一致(图S3F). PKM-skip蛋白的糖酵解丙酮酸激酶活性每微克比重组PKM2低230000倍(图S3G)没有检测到蛋白激酶活性(图S3H)表明PKM-skip蛋白即使存在于PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。综上所述,这些数据表明PKM-skip蛋白在分析PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤,还有PKM公司外显子10的缺失有效地阻止了PKM2蛋白的产生,同时仍然允许细胞表达PKM1。
PKM2基因敲除肿瘤中PKM1的表达具有空间异质性
要了解中的哪些单元格PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤表达PKM1,我们在固定肿瘤切片上进行免疫组织化学(IHC)。与以前的报告一致(Christofk等人,2008年a;Mazurek,2011年),中的大多数单元格PKM2(平方公里)+/+肿瘤染色有PKM2,但没有PKM1().PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤仅在脂肪或其他与肿瘤相关的基质组织中显示PKM2染色,而在肿瘤细胞中没有PKM2着色。PKM1染色是可变的,在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤(). 总之,这些数据表明并非所有肿瘤细胞都需要PKM2,并且不同肿瘤细胞群体对丙酮酸激酶的需求不同。
PKM2表达的肿瘤细胞系的建立
进一步描述PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤细胞,我们从产生于PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行BRCA公司飞行/飞行MMTV-核心p53+/-老鼠。细胞系的生成PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤持续了数周,尽管在亲代肿瘤中观察到PKM2缺失,但在所有病例中,细胞系都显示出高水平的PKM2蛋白表达(). 细胞系的PCR基因分型显示保留了至少一个PKM2(平方公里)飞行所有病例中的等位基因()这表明,向组织培养的过渡选择了在两种情况下均未发生重组的罕见肿瘤细胞PKM公司基因座。与它们来源的肿瘤形成鲜明对比的是,肿瘤细胞系显示PKM2 mRNA水平升高()PKM-skip转录减少().
PKM2衍生的细胞系Δ/Δ乳腺肿瘤保留PKM2的表达(A) 肿瘤中PKM2、PKM1和总PKM蛋白水平PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行小鼠及其衍生细胞系[C]。肌肉和293T细胞裂解物分别作为PKM1和PKM2蛋白对照,GAPDH作为负荷对照。
(B) 肿瘤PCR基因分型PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行小鼠及其衍生细胞系[C]。来自的尾部DNA分析PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)飞行/飞行小鼠作为对照。
(C) PKM2 mRNA水平PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤和衍生细胞系的定量RT-PCR。数据显示为平均值±s.e.m,n=4个肿瘤,n=3个细胞系。
(D) PKM拼接的量化PKM2(平方公里)Δ/Δ如图所示确定肿瘤衍生细胞系和亲本肿瘤数据显示为平均值±s.e.m,n=4个肿瘤,n=四个细胞系。P值通过Student t检验获得。另请参见图S4.
诱导型Cre重组酶(Cre-ER)的引入T2段)进入两个肿瘤细胞系,允许删除剩余的PKM2(平方公里)飞行等位基因在体外(图S4A)我们发现PKM2的丢失不会影响这些细胞的耗氧速率,也不会导致对β-氧化的依赖(图S4B). 我们还研究了PKM2的非糖酵解功能在这些细胞中是否活跃。缺氧或β-catenin诱导的基因表达不需要PKM2(图S4C-S4J)这表明,在细胞系建立过程中,这些功能的维持并不是罕见的PKM2表达细胞生长的基础。因此,尽管在细胞系生成过程中选择了PKM2,但功能性PKM2等位基因并不需要用于在体外增殖。
在同种异体肿瘤中选择PKM1表达,但不选择PKM2表达
鉴于组织培养条件似乎可以选择表达PKM2的细胞,我们专注于体内分析PKM2(平方公里)Δ/Δ以检测在缺乏内源性PKM2的情况下组成型PKM1或PKM2表达对肿瘤生长的影响。有代表性的细胞系稳定感染Cre-ERT2段并且没有cDNA(空载体控制)、FLAG-PKM1或FLAG-PKM2。FLAG表位标签的存在不会损害外源表达的PKM2拯救蛋白质任何已知功能的能力(Christofk等人,2008年a;Christof k等人,2008b;Yang等人,2011年). 处理这些细胞以删除剩余的PKM2(平方公里)飞行等位基因,皮下注射到裸鼠体内。虽然对照细胞和表达FLAG-PKM2的细胞能够形成肿瘤,但表达FLAG-PKM1的细胞却不能(). 使用抗FLAG抗体的IHC显示,34天后注射部位活检时可检测到表达FLAG-PKM1的细胞(). 这表明组成性PKM1表达并没有导致生存能力下降,而是促进了不利于增殖的状态。有趣的是,来自FLAG-PKM2表达细胞的肿瘤显示出异种FLAG染色,只有少数细胞染色阳性()这些肿瘤中的大多数癌细胞没有PKM2染色(). 这些数据表明,尽管内源性基因缺失,但并没有选择性压力来保持FLAG-PKM2的表达,并证实构成性外源性PKM1表达抑制增殖。
同种异体移植瘤生长不选择PKM2表达(A) 肿瘤生长曲线由PKM2(平方公里)Δ/Δ将表达空载体FLAG-PKM1或FLAG-PKM2的细胞注射到裸鼠体内。
(B) 异体移植实验中肿瘤切片的代表性抗FLAG和H&E染色如(A)所示。比例尺在低倍和高倍下分别代表200μm和20μm。
(C) 代表性的抗PKM2和H&E染色PKM2(平方公里)Δ/Δ
空向量肿瘤和三PKM2(平方公里)Δ/Δ
PKM2标志肿瘤。右上角PKM2(平方公里)Δ/Δ
PKM2标志肿瘤是一样的PKM2(平方公里)Δ/Δ
PKM2标志肿瘤如(B)所示。比例尺在低倍和高倍下分别代表200μm和20μm。
PKM1仅在非增殖性肿瘤细胞中表达
PKM1染色PKM2(平方公里)Δ/Δ同种异体肿瘤显示PKM1仅在肿瘤细胞亚群中内源性表达(). 因为PKM1表达抑制肿瘤生长,PKM2活性降低与促增殖信号事件和合成代谢有关(Anastasiou等人,2012年;Christofk等人,2008年a;Varghese等人,2010年),我们推断增殖的肿瘤细胞可能包含在不表达PKM1的细胞亚群中。第节,共节PKM2(平方公里)Δ/Δ移植瘤进行PKM1和增殖标记物PCNA双重染色。高PKM1染色的区域几乎没有增殖细胞,而很少或没有PKM1着色的区域有许多增殖细胞(,5安). 对该表型的量化显示,26%的计数细胞PCNA染色阳性,在614个计数的PCNA阳性细胞中,大多数(419个)的PKM1染色较低或没有。
肿瘤细胞在没有PKM2的情况下增殖,但在有PKM1的条件下不增殖(A)PKM2(平方公里)Δ/Δ同种异体肿瘤PKM1(棕色)和PCNA(红色)双重染色。比例尺在低倍和高倍下分别代表200μm和20μm。
(B)PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤来自BRCA公司飞行/飞行MMTV-核心p53+/-小鼠PKM1(棕色)和PCNA(红色)双重染色。比例尺在低倍和高倍下分别代表200μm和20μm。
(C)PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤来自BRCA公司飞行/飞行MMTV-核心p53+/-PKM2(棕色)和PCNA(红色)双重染色的小鼠。比例尺代表20μm。
(D) 来自葡萄糖的乳酸百分比PKM2(平方公里)fl/Δ和PKM2(平方公里)Δ/Δ同种异体移植瘤由13正常化肿瘤中的C-乳酸标记13C-葡萄糖血清浓缩水平。两个独立的肿瘤细胞系同种异体移植的结果显示为平均值±s.e.m(两种基因型的line 1肿瘤n=8;line 2肿瘤n=4PKM2(平方公里)fl/Δ肿瘤,2号线n=5PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤)。另请参见图S5.
为了证实PKM1的表达也与内源性肿瘤中的非增殖肿瘤细胞有关,我们对来自PKM2(平方公里)飞行/飞行BRCA公司飞行/飞行MMTV-核心p53+/-小鼠PKM1和PCNA。我们再次发现PKM1低表达与PCNA染色之间的相关性(,5亿). 在这些肿瘤中,PCNA阳性细胞占所计数细胞的21%,而85%的PCNA阳性的细胞有低到无PKM1表达。肿瘤的双重PKM2,PCNA染色PKM2(平方公里)飞行/飞行BRCA公司飞行/飞行MMTV-核心p53+/-小鼠证实,尽管缺乏PKM2表达,但细胞PCNA染色呈阳性(),支持以下概念PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤细胞具有增殖能力。
可变PKM1表达可使PKM2-肿瘤中的葡萄糖代谢正常
我们观察到PKM1在PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤细胞增加了糖酵解被破坏的可能性PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。因此,我们试图确定PKM2的丢失是否导致了可检测到的糖原或脂质储存变化的总代谢紊乱。自发的PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ在有和无淀粉酶预处理的情况下,肿瘤表现出类似的周期性酸性-Schiff染色,与糖原含量相似的两种基因型肿瘤一致(图S5C). 中性脂质储存的油红O染色在PKM2(平方公里)+/+和PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤,大多数肿瘤在缺乏脂肪细胞的区域几乎没有脂质积聚(图S5D).
乳酸的产生与PKM2的表达有关(Christofk等人,2008年a). 为了研究PKM2缺失对肿瘤葡萄糖代谢的影响,我们确定PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤在葡萄糖转化为乳酸方面受损。有意识的老鼠窝藏PKM2(平方公里)fl/Δ或PKM2(平方公里)Δ/Δ同种异体移植瘤静脉输注fully标记13C-葡萄糖实现血清中标记葡萄糖的稳定稳态富集(Ayala等人,2010年;图S5E). 在表达PKM2的肿瘤和表达PKM2-的肿瘤中,来自葡萄糖的标记乳酸水平以及乳酸的绝对浓度相似(,S5F系列). 肿瘤中全标记乳酸的相对丰度大于血清中的丰度,无论PKM2(平方公里)基因型,进一步支持肿瘤从葡萄糖中产生类似数量的乳酸(图S5G). 这些数据与异种PKM1表达一致,允许PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤细胞重演在表达PKM2的肿瘤中发现的代谢。
人类癌症具有PKM2突变和可变PKM2表达
鉴于PKM2对肿瘤生长的不必要性,以及在我们的小鼠模型中观察到的丙酮酸激酶表达的变异性,我们试图确定是否在原发性人类肿瘤中发现可变PKM2表达。我们在两组乳腺肿瘤组织阵列上进行了PKM2和PKM1 IHC,共包含317个核心(). PKM2染色强度评分显示,尽管71%的评分肿瘤显示PKM2表达,但大多数肿瘤的PKM2着色较弱(评分1)。此外,相当大一部分肿瘤的PKM2染色完全阴性(得分为0),表明人类肿瘤中PKM2的表达并没有持续上调(). 在任何乳腺癌亚型中均未发现PKM2表达高或低的绝对要求,尽管更具侵袭性的Her2阳性和三阴性乳腺肿瘤亚型中PKM2阴性(0分)肿瘤的百分比最高(). 我们发现Her2扩增肿瘤和ER/PR阳性肿瘤之间PKM2 IHC评分的分布存在统计学显著差异(P=0.038,卡方检验)。
人类乳腺肿瘤PKM2的表达可变(A) 具有代表性的TMA核心,包含经H&E染色的正常人类乳房,以及PKM2和PKM1。插图显示放大倍数更高。比例尺在低倍和高倍下分别代表200μm和20μm。
(B) 具有代表性的TMA核心,包含人类乳腺肿瘤样本,经H&E染色,用于PKM2和PKM1。显示了每个PKM2 IHC强度评分的示例(0=阴性;1=较弱;2=较强)。插图显示放大倍数更高。比例尺在低倍和高倍下分别代表200μm和20μm。
(C) 来自两个不同TMA乳腺肿瘤样本的317个肿瘤的PKM2 IHC强度评分分布。
(D) 与乳腺肿瘤亚型(三联阴性、Her2扩增或ER/PR阳性)相关的人类乳腺肿瘤中PKM2表达的量化。经卡方检验,Her2扩增样本和ER/PR阳性样本的PKM2评分分布存在显著差异(P=0.038)。
(E) 示意图显示了人类癌症中发现的突变导致的PKM2截短。
由于我们观察到PKM2缺失导致小鼠肿瘤相关死亡率加速,我们想知道PKM2的基因缺失或失活是否也可能发生在一些人类癌症中。人类子宫内膜肿瘤样本的测序显示PKM2第10外显子内存在重复杂合无义突变(L394*)(). 如果翻译,这一信息将导致类似于PKM跳跃的无功能蛋白质产物,认为这是一种功能缺失突变。
通过癌症基因组图谱(TCGA)对人类肿瘤组织进行大规模测序分析,发现7种癌症类型中存在额外的PKM2突变(表S1). 这些突变包括两个额外的无义突变(E154*和E304*),它们只能产生比PKM-skip小的截短蛋白()和V375的一个移码突变导致提前终止密码子。这些突变都发生在PKM公司异构体特异性外显子(,表S1)并且预期会导致转录物的非传感介导的衰变(Maquat,2004年)并使任何蛋白质产品失去功能。其余的突变是错义突变,预计会降低酶活性。这些数据与人类癌症中某些情况下PKM2活性缺失的选择一致。
讨论
乳腺肿瘤BRCA公司飞行/飞行MMTV Cre p53+/-尽管PKM2缺失,小鼠的生长速度更快PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤与PKM1低表达相关。这些结果与肿瘤细胞中已知的PKM2活性调节一致,PKM2可以像PKM1一样以活性状态存在,也可以通过驱动细胞增殖的信号事件而促进处于非活性状态(Christof k等人,2008b;Lv等人,2011年;Mazurek,2011年). 以下PKM公司外显子10缺失时,肿瘤细胞可以通过滴定组成活性PKM1亚型的表达来产生类似的高和低丙酮酸激酶活性状态。因此,在剪接过程中通过抑制外显子9来阻止PKM1的表达,在PKM2缺失后,通常由生长信号诱导的低丙酮酸激酶活性状态仍然可以保持。
PKM2活性的调节可能是对不同细胞代谢需求的适应性反应,这表明丙酮酸激酶活性的增加在肿瘤形成和进展的不同阶段很重要。肿瘤的起始,无论是在原发部位还是转移部位,都涉及到在新的、不适当的组织环境中生长的能力。血液供应不足或缺乏外源性生长和生存信号都可能是营养应激的来源,可能会限制单个癌细胞的增殖和存活(Vander Heiden等人,2001年;Vaupel等人,1989年). 在这些应激期间,生存需要一个远离合成代谢和高效ATP生成的代谢程序,这可能解释了为什么非增殖肿瘤细胞需要高丙酮酸激酶活性。在不利于增殖的情况下激活PKM2的能力可能会导致癌症中PKM2表达的保留,并可能解释为什么在人类癌症中观察到的功能缺失突变是杂合的。在这种情况下,由于突变导致细胞中丙酮酸激酶活性降低有利于增殖代谢,但保留一种功能PKM公司等位基因提供了代谢灵活性,使癌细胞能够承受压力体内.
这个PKM公司在多种人类癌症类型中发现的错义突变值得注意,因为PKM2活性对氨基酸替换敏感。对人类群体中罕见SNP引起的17个PKM2突变的功能特征分析表明,错义突变,即使在溶剂暴露的残基中,也会导致酶活性和稳定性降低,在某些情况下还会改变PKM2的变构调控(Allali-Hassani等人,2009年). 此外,我们对大量乳腺肿瘤的评估表明,PKM2蛋白水平在许多乳腺癌中较低。由于没有发现PKM2突变的高频率,因此在一些肿瘤中观察到的低表达可能是由于转录或翻译减少,或者是表观遗传沉默的结果。
除了作为糖酵解酶的作用外,PKM2特有的多种非代谢功能也与癌症有关,这表明这些非标准活动可能会驱动肿瘤细胞中PKM2表达的选择。事实上,细胞能够形成自发肿瘤并在PKM2缺失后增殖,这意味着PKM2亚型的非代谢功能对于增殖或肿瘤进展并非绝对必要。虽然最近的报告表明组蛋白H3的PKM2依赖性磷酸化是细胞周期蛋白D1表达和细胞周期进展所必需的(Yang等人,2012a)我们的结果表明,这种机制并非细胞周期控制的绝对必要条件,至少在某些肿瘤中对细胞增殖是不可或缺的。PKM2的其他非代谢功能,通过与HIF1的相互作用促进基因表达(Luo等人,2011年),β-连环蛋白(Yang等人,2011年)或通过stat3转录因子的磷酸化(Gao等人,2012年),可能发生在肿瘤细胞群中并且对肿瘤细胞群有利,但并非所有肿瘤的生长都需要。
肿瘤细胞在没有PKM2的情况下增殖的能力提出了一个问题,即PKM2缺失且没有明显PKM1表达的细胞是否需要任何丙酮酸激酶。极低水平的PKM1表达可能提供了足够的丙酮酸激酶活性来维持糖酵解通量,这是导致葡萄糖持续转化为乳酸的原因PKM2(平方公里)Δ/Δ肿瘤。如果是这样,那么癌细胞中的丙酮酸激酶必须超过允许足够的PEP转化为丙酮酸所需的量,因此丙酮酸酶活性在正常表达水平上永远不会受到速率限制。然而,这种可能性与PKM1表达和丙酮酸激酶激活剂都可以通过增加丙酮酸酶活性来抑制肿瘤生长的观察结果不一致(Anastasiou等人,2012年). 如果丙酮酸激酶活性水平在增殖细胞中是限速的,那么观察到的PKM2的损失而没有其他亚型的补偿表达,这表明可能存在一种不依赖于丙酮酸激酶的PEP转化为丙酮酸的机制,以允许糖酵解通量在没有丙酮酸激酶的情况下继续。有人建议存在这种活性,并可能使细胞将糖酵解ATP生成与葡萄糖并入中枢代谢途径的结合解耦(Vander Heiden等人,2010年).
The ability ofPKM2(平方公里)Δ/Δ尽管许多细胞中丙酮酸激酶的表达可以忽略不计,但肿瘤将葡萄糖转化为乳酸盐还有另一种可能的解释。可能是肿瘤乳酸的产生仅限于丙酮酸激酶活性高的非增殖细胞,而丙酮酸酶活性低的细胞消耗另一种底物。一种类似的代谢共生被认为可以支持肿瘤缺氧区的细胞(Sonveaux等人,2008年).
肿瘤细胞群体对丙酮酸激酶活性的不同需求使针对PKM2的癌症治疗策略的制定变得复杂。PKM2敲除抑制生长在体外,但情况并非如此体内,PKM2的诱导性敲除对已建立的异种移植瘤没有影响(Cortes-Cros等人,2013年). 这一发现,再加上我们对PKM2缺失后加速肿瘤死亡率的观察,表明药物抑制或治疗性敲除PKM2可能不是有效的独立癌症治疗方法。使用小分子激活剂增加细胞中丙酮酸激酶的活性可以抑制肿瘤生长(Anastasiou等人,2012年;Parnell等人,2013年); 然而,我们发现表达PKM1的癌细胞持续处于非增殖状态体内增加丙酮酸激酶活性有助于癌细胞在某些条件下存活的可能性。此外,PKM2活性的药理激活可能对非增殖性肿瘤细胞群没有影响,顶多是一种细胞抑制疗法。最后,至少一些肿瘤可以耐受PKM2的丢失,PKM2缺失、突变或表观遗传沉默可能为治疗环境中PKM2激活物的耐药性提供了一种机制。在靶向PKM2对抗PKM2活性的生物调节的情况下,激活或抑制丙酮酸激酶作为辅助治疗可能仍然有效。例如,有效的PKM2抑制可能会破坏非增殖肿瘤部分的代谢,导致细胞死亡或使细胞对细胞毒治疗敏感。这项研究的结果强调了了解癌细胞依赖于环境的代谢需求对有效靶向代谢以获得治疗益处的重要性。
实验程序
PKM2条件小鼠和胚胎成纤维细胞的产生
使用标准方案生成PKM2条件小鼠和胚胎成纤维细胞。
Southern印迹、PCR基因分型、qPCR和剪接分析
使用标准方案和放射自显影显示的探针结合,通过Southern blot分析Asp718(Roche)消化的基因组DNA。用PCR检测小鼠基因型。使用Fast SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)进行qPCR反应,并如先前报道的那样分析PKM剪接(Clower等人,2010年).
Western Blot和IHC
使用针对PKM1(Sigma SAB4200094)、PKM2(细胞信号技术#4053)、PKM(细胞信号技术#3190;abcam ab6191)、FLAG(细胞信号技术#2368)、β-肌动蛋白(abcam ab1801)或GAPDH(细胞信号技术#2118)的一级抗体进行蛋白质印迹。在抗原检索后,用以下主要抗体对固定切片进行染色:PKM1(细胞信号技术#7067)、PKM2(细胞信息技术#4053)、PCNA(细胞信号处理技术#2586)、Ki-67(BD Pharmingen 556003)、Cleaved Caspase 3(细胞信号发送技术#9661)和/或FLAG(细胞信号传递技术#2368)。PKM1/PCNA双重染色通过PCNA阳性或阴性和PKM1高或低/无的评分细胞进行量化。
肿瘤细胞系
在含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中培养胰蛋白酶分解的肿瘤细胞。细胞系被MSCV-CreER逆转录病毒感染T2段-puro载体和pLHCX表达载体,并如前所述用嘌呤霉素和潮霉素选择(Christofk等人,2008年a). 如有指示,使用1µM 4-羟基三苯氧胺诱导重组。
同种异体移植瘤实验
5 × 106裸鼠皮下注射细胞。肿瘤生长通过卡尺测量进行二维监测,并使用方程式V=(π/6)(L*W)估算体积2).
组织芯片分析
在三种组织微阵列中分析了人类乳腺癌中PKM2和PKM1的表达:US BioMax BR1504,一种来自巴塞尔大学病理学研究所档案的含有TMA的多组织组织微阵列(Baumhoer等人,2008年;Schraml等人,1999年)和两名来自Beth-Israel女执事医疗中心的乳腺癌TMA。每个TMA核心分别对PKM2 IHC强度进行独立评分。根据肿瘤亚型量化美国BioMax BR1504的PKM2评分。
质谱代谢物测量
用同位素标记的内标物制备代谢物进行分析。如前所述,对1号生产线样品进行分析(Jain等人,2012年). 简言之,代谢物使用岛津卓越超高效液相色谱(Shimatzu Prominance UHPLC)分离,并使用配备SelexION的ABSCIEX 5500 QTRAP在负离子模式下测量乳酸同位素。GC-MS代谢物分析采用安捷伦7890A GC和安捷伦5975C MS,MID测定如前所述(Commisso等人,2013年). 通过亲水相互作用液相色谱法(HILIC)/负离子模式MS,使用Open Accela 1250 U-HPLC和Q Exactive混合四极轨道阱质谱仪(Thermo Fisher Scientific;马萨诸塞州沃尔瑟姆)对2号线样品进行分析。
扩展实验程序中提供了方法的详细说明。
集锦
并非所有肿瘤细胞都需要PKM2
丙酮酸激酶的需求在非增殖性肿瘤细胞中最为明显
PKM2在人类癌症中的表达是可变的
在人类癌症中发现破坏丙酮酸激酶的复发点突变
致谢
我们感谢Chu-Xia Deng分享巴西航空公司1小鼠模型,Luigi Terracciano和Luigi Tornillo提供多组织TMA,Cynthia Clower、Sarah-Maria Fendt、Andrea J.Howell、Vivian M.Liu、Sophia Lunt、Katherine R.Mattaini、Benjamin A.Olenchock和Kerry Pierce提供技术援助。Eric L.Bell提供了建议和试剂。丹尼斯·克劳利(Denise G.Crowley)、迈克尔·布朗(Michael Brown)、凯萨琳·S·科米尔(Kathleen S.Cormier)协助组织学检查。这项工作得到了NIH拨款R01CA168653、5P01CA117969、P30CA147882、5P30CA14051、5K08CA136983、DK059635、R01DK092606、R00CA31472、R01GM056203和ADA拨款7-12-BS-09的部分支持。RAD和JH感谢Belfer基金会的支持。MVH感谢Smith家族基金会、Burroughs Wellcome基金会、Damon Runyon癌症研究基金会和Stern家族的额外支持。CBC是股东,MVH是股东和SAB成员,LCC是股东、SAB成员和Agios Pharmaceuticals董事会成员。
脚注
补充信息:补充信息包括扩展实验程序、五张图和一张表。
出版商免责声明:这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。作为对客户的服务,我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前,将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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