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神经科学杂志。2013年12月4日；33（49）：19086–19098。
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.2508-13.2013
PMCID公司：项目经理3800036
PMID：24305806

药物抑制ROCK2抑制阿尔茨海默病小鼠模型淀粉样β的生成

杰里米·赫斯科维茨,1中，2 杨伯峰,5 Alexa L.Mattheyses公司,三 查德威克·黑尔斯,1中，2 莱诺拉·希金波坦,1中，2 Duong公爵,4 托马斯·蒙廷,6 胡安·特隆科索,7 Madhav Thambisetty公司,8 尼古拉斯·塞弗里德,1中，4 艾伦·I·利维,1中，2和詹姆斯·拉赫通讯作者1中，2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

阿尔茨海默病（AD）是痴呆症的主要病因，无法治愈。遗传、细胞生物学和生物化学研究表明，减少淀粉样蛋白-β（Aβ）的产生可能是延缓或预防AD进展的合理治疗途径。抑制Rho GTPase家族成员RhoA被提议抑制aβ的产生。然而，这一假设的障碍是对RhoA、Rho相关的、含有线圈的蛋白激酶（ROCK）1和ROCK2的主要下游效应器如何调节aβ生成的了解有限。在这里，我们报告说，ROCK1基因敲除增加了内源性人类Aβ的产生，而ROCK2基因敲除则降低了Aβ的水平。使用同种型选择性小分子（SR3677）抑制ROCK2激酶活性，抑制AD小鼠大脑中β-位点APP裂解酶1（BACE1）的酶促作用并减少Aβ的产生。免疫荧光和共聚焦显微镜分析显示，SR3677改变了BACE1的内吞分布，并促进淀粉样前体蛋白（APP）向溶酶体的运输。此外，SR3677还阻断了苏氨酸654（T654）处APP的ROCK2磷酸化；在神经元中，T654对APP处理为Aβ至关重要。这些观察结果表明，ROCK2抑制通过独立机制降低Aβ水平。最后，无症状AD、轻度认知功能障碍和AD脑中ROCK2蛋白水平升高，表明ROCK2水平在AD早期阶段发生变化，并在整个疾病进展过程中保持升高。总之，这些发现强调了ROCK2是一种基于机制的治疗靶点，可以对抗AD中aβ的生成。

介绍

阿尔茨海默病（AD）是痴呆症的主要病因，没有有效的治疗方法。大量证据表明淀粉样前体蛋白（APP）及其衍生物淀粉样β（Aβ）肽在AD中起着核心作用(Masters等人，1985年)、和应用程序基因突变导致染色体21连锁家族性AD（FAD）；Goate等人，1991年;Murrell等人，1991年). FAD病例表现出与散发性AD相似的神经病理学表型，所有已知的FAD突变增强或改变aβ的产生为淀粉样级联假说提供了机制基础(哈代，1997年). 虽然Aβ本身不能解释AD的所有特征，但减少Aβ的产生或积累是旨在改善疾病的治疗策略的核心。

Aβ是由β位点APP裂解酶（BACE）1对APP的连续蛋白水解裂解以及γ-分泌酶的后续作用产生的。BACE1裂解位点APP瑞典突变的特征强调了调节该途径调节Aβ生成的效力(Mullan等人，1992年;Citron等人，1995年). 此外，对冰岛人群的遗传研究表明，一种APP氨基酸替代物可以消除BACE1的切割作用，从而防止AD(Jonsson等人，2012年). 由于BACE1酶位点的大小和缺乏药代动力学效力，生成可行的BACE1小分子抑制剂遇到了重大障碍体内(斯塔切尔，2009年). 然而，已经探索了减少Aβ生成的替代小分子方法，包括γ-分泌酶抑制剂/调节剂和非甾体抗炎药（NSAIDs；De Strooper等人，2010年)。

非甾体抗炎药降低Aβ的一种方法是通过抑制Rho-GTPases及其主要下游效应物Rho-相关的含螺旋线圈的蛋白激酶（ROCK）1和ROCK2(Zhou等人，2003年). ROCK1和ROCK2是普遍存在的丝氨酸/苏氨酸激酶，其氨基酸序列具有65%的相似性，激酶结构域具有92%的同源性(Nakagawa等人，1996年). 暴露于Y-27632，这是一种抑制ROCK1和ROCK2的药物，具有相似的效力(Uehata等人，1997年)在AD小鼠模型中，Aβ42的大脑水平降低，但对总可溶性Aβ没有明显影响(Zhou等人，2003年). 这些研究表明，抑制ROCK可能是抑制aβ生成的合理途径。然而，由于对Rho/ROCK途径如何调节Aβ生成以及哪种ROCK亚型负责这些作用的了解有限，这一有希望的假说近年来有所减弱。在本报告中，定义了ROCK1或ROCK2击倒对Aβ生成的影响。我们发现，在使用小分子ROCK2抑制剂治疗后，在AD的细胞和动物模型中，APP对aβ的加工显著减少，并且确定了导致观察到的效果的机制。

材料和方法

细胞培养、转导和转染。

SH-SY5Y人神经母细胞瘤和HEK293细胞分别用10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素保存在Eagle的最小基本培养基或DMEM（Lonza）中。从胚胎第17天的小鼠胚胎中制备出初级皮层神经元细胞，并将其保存在添加0.8 m米 我-谷氨酰胺和B27。从小鼠胚胎中解剖皮质组织并消化胰蛋白酶。细胞以100000个细胞/cm的密度进行电镀212孔培养皿中涂有100μg/ml聚赖氨酸。在电镀后的第3天，用指示的慢病毒转导神经元，多重感染率为1。对于Aβ研究，在转导后72小时，用药物在条件培养基中处理细胞16小时。对于ROCK1或ROCK2的RNAi敲除，在转染后96小时收集细胞。对于转导或转染，按照制造商的说明，电镀等量的细胞，并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行转染。

DNA构建和慢病毒。

慢病毒产生的质粒模板为pLENTI，慢病毒由埃默里大学病毒载体核心产生。表达人类野生型（WT）APP695，cDNA编码APP695使用BamH1和EcoR1位点克隆到pLENTI中。如前所述构建shRNA表达慢病毒载体(Herskowitz等人，2012年). 采用以下shRNA序列：人ROCK1 shRNA 1，5′-GCCAATACTTACTTAGGA；人ROCK1 shRNA 2，5′-CTACAAGTGTTGCTAGTTT；人ROCK2 shRNA 1，5′-ATCAGACAGCATCCTTTCT；人ROCK2 shRNA 2，5′-GCAAAATCTGTTAATACTCG；加扰，5′-GGACTACTCTAGACGTATA；小鼠ROCK2 shRNA，5′-CAATGAAGCTTCTTAGTAA。为了产生对人类shRNA 1序列具有抗性的ROCK1和ROCK2突变体，以编码人类ROCK1（印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院雷伟博士馈赠）或ROCK2（中国北京清华大学孟安明博士赠送）的cDNA为模板，使用QuikChange XL定点突变试剂盒（Stratagene）已使用(Lee等人，2009年;Zhang等人，2009年). ROCK1的阳性引物为5′-CTG AAG AAG AAA CAG TAC GCA TCC ATT CAT GGT GTG GAG，反义引物为5'-AGC TGT GTC CGA TTC TGT CCT AAG CAA ATC ATT GGC TTC TAG CAG。ROCK2的阳性引物为5′-C GG TGG AAG AAA TCA GAC AAC CTT TCT TTA AGA ATG ATC AGT G，反义引物为5'-CAC TGA TCA TTC TTA AAG GGG TGT CTT ATT TCT TCC ACC。为了产生APP苏氨酸654A（T654A），cDNA编码APP695作为模板，使用QuikChange XL定点突变试剂盒。T654A的阳性引物为5′-CTG AAG AAG AAA CAG TAC GCA TCC ATT CAT GGT GTG GAG，反义引物为5'-CTC CAC CAC ACC ATG ATG AAT GGA TGC GTA CTG CTT CTT CAG。如前所述，生成表达人类野生型BACE1 cDNA或丝氨酸498（S498A）BACE1的构建物(Herskowitz等人，2012年). 所有结构均通过限制性消化和测序进行验证。

化学制品。

对于Rho抑制，Rho抑制剂I（RhoI；Cytoskeley Inc）以1μg/ml的浓度使用。为了抑制ROCK，将Y-27632（Calbiochem）溶于H250μ时为O米，将Fasudil（HA-1077，Sigma-Aldrich）溶解在H中2O，并按指示剂量使用。为了抑制ROCK2，将SR3677溶解在H中2O，并按指定剂量使用。为了抑制BACE1，在10μ米.车辆控制（标记为“模拟”）为H2O表示所有实验。

Aβ测量。

对于细胞，将培养基调节16小时，然后与细胞一起收集用于生化分析。对于脑组织，可溶溶物的制备如下所述。按照制造商的说明，使用夹心ELISA检测人类Aβ40或Aβ42（Millipore）。在Spectra Max Plus平板读取器（分子器件）上以450 nm的波长读取平板。

细胞裂解物、小鼠组织制备和免疫印迹。

细胞在PBS加蛋白酶抑制剂混合物（PIC；Roche Diagnostics）中溶解；停止磷酸酶抑制剂混合物（Pierce）；和含有0.5%Nonidet P-40、0.5%脱氧胆酸盐的裂解缓冲液，150 m米氯化钠，和50 m米Tris，pH 7.4（PBS+PIC+暂停+溶解缓冲液）。组织在上述PIC+Halt+裂解缓冲液中均质（dounce均质器）。将均质组织或细胞裂解液进行13000 rpm的旋转，以去除细胞核和碎片。清除的裂解液用于指示的生化分析。使用前面描述的标准程序进行免疫印迹(Herskowitz等人，2011年). 为了装载每个样品等量的裂解物，采用双茚二酸法（Pierce）测定蛋白质浓度。肌动蛋白被用作负荷控制。使用奥德赛成像站（LI-COR）拍摄图像，并使用Scion图像量化波段强度。

抗体。

使用以下抗体：ROCK1、ROCK2和肌动蛋白（Abcam）；APP和α-分泌酶裂解APP（sAPPα；6E10，Covance）；sAPPβ（192wt或192swe，用于5XFAD，Elan Pharmaceuticals）；免疫细胞化学APP（C8；Dennis Selkoe博士的礼物，哈佛医学院，马萨诸塞州波士顿）；BACE1（Abcam）；pMLC-Ser19（细胞信号技术）；EEA1（BD生物科学）；CD63（BD生物科学）；LAMP1（衣阿华大学发展研究杂交瘤库，衣阿华城，IA）；电离钙结合适配器分子1（Iba1；Wako）；和胶质纤维酸性蛋白（GFAP；BIOCARE Medical）。

细胞活力测定。

按照制造商的说明，使用CellTiter 96非放射性细胞增殖试验（Promega）测量原代神经元培养细胞的存活率。在570 nm处测量吸光度，在650 nm处测量参考波长。细胞死亡值计算为对照吸光度的百分比。

立体定向注射。

用80 mg/kg氯胺酮和8 mg/kg木聚氮烯麻醉12周龄的5XFAD转基因小鼠（雌雄各半），并将其置于立体定向框架内。眼膏覆盖了眼睛。头皮在颅骨暴露和切开前消毒。单侧注射H2O或SR3677以1μl/3分钟的速率注射到左半球和右半球（前后方向，距离前角-2.1 mm；中外侧方向，距离中线±1.8 mm；背中央方向，距离硬脑膜表面−1.8 mm）。立体定向注射后，对头皮进行缝合和消毒。20小时后，用异氟醚麻醉小鼠并斩首。快速采集半球并将其储存在−80°C的温度下，直到进行生化分析的进一步处理。

BACE1活性测定。

BACE1活性检测试剂盒（Sigma-Aldrich）用于测量来自细胞、大脑和在体外按照制造商的说明进行分析。对于细胞和脑匀浆，每个样品分别使用100或500μg。使用Synergy 2 Alpha微孔板阅读器（BioTek）读取所有荧光读数。

体外激酶分析和液相色谱-串联质谱联用。

合成BACE1肽（ab41766，Abcam）或APP肽（AnaSpec）与重组ROCK2蛋白（Abcam，200μ米ATP和1X NEB PK缓冲液在30°C下放置3小时。如前所述，样品经胰蛋白酶消化，并通过反相液相色谱法结合串联质谱法（LC-MS/MS）对所得肽进行独立分析(Herskowitz等人，2010年)。

免疫细胞化学和共焦显微镜。

如前所述进行免疫细胞化学和共焦显微镜实验(Herskowitz等人，2012年). 简单地说，HEK293细胞在转染24小时后，在12孔培养皿中被镀到Matrigel细胞外基质（BD）涂层盖玻片上。细胞暴露于SR3677中6 h，然后在2%多聚甲醛中固定20 min，并用含有0.5%正常马血清、0.5%正常山羊血清和0.05%皂苷的PBS冲洗数次。用含有5%正常马血清、5%正常山羊血清、1%牛血清白蛋白、0.05%皂苷（封闭缓冲液）和0.05%Triton X-100的PBS封闭并渗透细胞30分钟。冲洗细胞，并在4°C下在封闭缓冲液中稀释的一级抗体中孵育过夜。第二天，用荧光团结合的抗兔和小鼠二级抗体（Jackson ImmunoResearch）冲洗细胞并在封闭缓冲液中孵育1小时。细胞核用Hoechst 333258（Invitrogen）染色，并用Vectashield（Vector Laboratories）固定在载玻片上。使用奥林巴斯IX81 FV1000倒置共焦显微镜拍摄图像。根据已发布的方法，使用JACoP（Just Another Colocalization Plugin）2.0版通过ImageJ进行Colocalisation分析(博尔特和科德利埃，2006年). 简单地说，对所有图像应用滚动球背景减法（半径=20像素），并选择阈值（处理和染色一致）。计算阈值曼德系数以确定红重叠绿（M2）的比例。实验一式三份，数据表示为平均值±1 SD。

人脑组织制备和免疫组织化学。

华盛顿大学阿尔茨海默病研究中心（ADRC）及其成人思维变化研究、约翰·霍普金斯ADRC和巴尔的摩衰老纵向研究提供了尸检人脑组织样本(表1;Shock等人，1984年). 如前所述，从每个病例中制备可溶性（S2）部分(Donovan等人，2012年). 50μg样品用于免疫印迹。免疫组织化学染色程序如前所述(Herskowitz等人，2010年). 简单地说，在4°C下，用一级抗体将尸检后人类额叶皮质固定的50μm冷冻保存切片孵育48小时。将组织样品与荧光团偶联的抗兔和小鼠二级抗体（Jackson ImmunoResearch）孵育1小时，并使用双苯甲脒（Hoechst）孵育5分钟来标记细胞核。对于ROCK2，使用酪胺信号放大（PerkinElmer）。

表1。

尸检人脑组织样本

案例CASI公司CERAD（消除种族歧视委员会）制动阶段年龄（岁）性别采购经理人指数
控制(N个= 11)
    1990078M（M）
    2970287F类
    三950279F类
    4960292F类
    5880198F类
    6890286M（M）
    70292F类
    80287M（M）
    91271F类16
    100486M（M）7
    110三95M（M）17
无症状AD(N个= 5)
    1982三86M（M）
    2972三92F类
    三972三79M（M）
    4912三75F类
    5962477F类
MCI公司(N个= 9)
    10268M（M）10
    22三87M（M）20
    三1三90M（M）14
    41489M（M）16
    51290M（M）14
    61三88F类14
    72482M（M）5.5
    82478M（M）4
    924101F类25
AD公司(N个= 16)
    1432683M（M）
    278三689F类
    三69三680F类
    441三592F类
    570三678F类
    683三685F类
    7三498M（M）20
    8三492M（M）7
    9三686M（M）15
    10三682F类6
    11三672F类10
    12三692F类19
    13三682M（M）23
    14三683F类11
    15三694F类17.5
    16三691F类18

将11名认知正常、年龄匹配、无病理的对照组与5名无症状AD（aAD）患者、9名MCI患者和16名散发AD患者进行比较。病例数与显示免疫印迹样本的数字相对应图7A类——C类组织样本来自约翰·霍普金斯ADRC巴尔的摩老龄化纵向研究的前瞻性研究参与者，以及来自华盛顿大学ADRC及其成人思维变化研究的参与者。病例诊断基于简易精神状态检查、认知能力筛查工具（CASI）评分、建立阿尔茨海默病注册协会（CERAD）评分和Braak分期。所有病例在年龄、性别和尸检间隔（PMI）方面尽可能匹配。病例被分为四个诊断组，包括（1）无AD病理的认知正常对照组，（2）中重度病理的认知健康无症状AD，（3）中重度病变的MCI，以及（4）明确的重度病理的AD。值得注意的是，这些病例都没有任何共存的病理学，如中风或路易体病。简易精神状态检查是记忆问题投诉或正在考虑痴呆诊断时最常用的测试。严重到中度AD患者的简易精神状态检查得分为10-20分，可能总共为30分。成人思维变化研究使用了CASI。CASI>90（相当于迷你精神状态检查得分～27）排除了认知能力的下四分之一，以确保消除前驱性痴呆患者。人口统计学尽可能在各组间进行匹配，并与巴尔的摩老龄化纵向研究进行匹配。CERAD（0→3）和Braak（0→6）量表分别用于衡量斑块和缠结堆积的严重程度。如果值为空，则信息不可用。F、 女性；M、 男性。

统计分析。

所有实验均在至少三份生物样品上进行，并使用Student’st吨独立样本测试。除非另有说明，否则所有数据均以对照的平均值±SEM的百分比表示。误差条代表SEM。所有图形均使用Prism软件（GraphPad软件）。

结果

ROCK1或ROCK2击倒内源性人类Aβ水平的相反结果

为了测试Rho或pan-ROCK抑制是否改变内源性人类Aβ的产生，SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞暴露于RhoI（1μg/ml）、pan-ROCK抑制剂Y-27632（50μg/ml米)，或车辆（H2O、 标记mock），并用ELISA测定分泌的内源性Aβ40。RhoI或Y-27632治疗可使Aβ降低40 12%，这与之前的研究结果一致(图1A类;Zhou等人，2003年). 为了确定ROCK1或ROCK2的选择性缺失如何影响APP对Aβ的处理，用表达ROCK1靶向、ROCK2靶向或干扰shRNA的慢病毒转导SH-SY5Y细胞。96小时后，内源性全长细胞相关APP、分泌的sAPPα、，免疫印迹或ELISA检测Aβ40水平（sAPPβ和Aβ42均低于检测限）。密度测定分析表明，在ROCK2的RNAi缺失后，APP和sAPPα略有减少(图1B类). 与扰乱或模拟对照相比，ROCK1敲除细胞的分泌Aβ40水平增加了65%，但ROCK2缺失细胞的分泌Aβ40水平降低了50%(图1C类). 在人类细胞中使用第二组shRNA序列敲除ROCK1或ROCK2后，这些结果得到了证实(图1D类). 为了挽救shRNA介导的ROCK1或ROCK2基因敲除对Aβ40水平的影响，使用定点突变产生ROCK1和ROCK2 shRNA抗性突变体（分别为R1挽救和R2挽救）。用表达ROCK1靶向、ROCK2靶向或干扰shRNA的慢病毒转染SH-SY5Y细胞，72小时后用所示质粒瞬时转染细胞。RNAi缺失ROCK1或ROCK2后观察到R1救援或R2救援的表达对Aβ40生成的逆转作用(图1E类). 值得注意的是，ROCK1或ROCK2敲低SH-SY5Y细胞中Aβ水平的相反结果表明，抑制这两种激酶的最终结果是有限的，这是在使用RhoI或Y-27632治疗后观察到的。这些发现表明，选择性抑制ROCK2活性可能会减少APP的淀粉样变过程。

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Aβ水平在ROCK1击倒后升高，但在ROCK2击倒后降低。A类将人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞暴露于RhoI、Y-27632或载体（Mock），用ELISA法检测分泌内源性Aβ40。与模拟相比，RhoI或Y-27632降低了Aβ40 12%***第页< 0.0001.B类，SH-SY5Y细胞被表达ROCK1-、ROCK2-或scrams-shRNA的慢病毒转导，并测量APP、sAPPα和Aβ40（显示代表性印迹）。ROCK2敲除降低内源性APP和sAPPα（分别为20%和32%）*第页= 0.032, **第页= 0.0037.C类ROCK1或ROCK2敲除细胞的Aβ40分别增加65%和减少50%***第页< 0.0001.D类，使用第二组shRNA序列，ROCK1或ROCK2敲除对人类内源性Aβ水平的影响。用表达交替ROCK1-、ROCK2-或干扰shRNA序列的质粒转染HEK293细胞，转染后96 h用ELISA测定分泌的内源性Aβ40。代表性免疫印迹证实shRNA介导的ROCK1或ROCK2基因敲除。与shRNA实验一致B类和C类ROCK1敲除使Aβ40水平增加16%，而ROCK2敲除使Bβ40水平降低22%***第页< 0.0001.E类、ROCK1和ROCK2 shRNA-resistant突变体对ROCK1或ROCK2 RNAi缺失后内源性Aβ水平的拯救作用。用表达ROCK1-、ROCK2-或scram-shRNA的慢病毒转染SH-SY5Y细胞，然后分别用表达ROCK1 shRNA-resistant突变体（R1拯救）、ROCK2 shRNA-resistant突变（R2拯救）或空载体的质粒转染。转染48小时后，用ELISA检测分泌的内源性Aβ40。代表性免疫印迹证实shRNA介导的ROCK1或ROCK2的敲除，以及R1和R2的拯救表达。Aβ40水平在打乱、R1救援和R2救援样本中具有可比性（SCR:99%；R1 shRNA:120%；R1救援：94%；R1 sh RNA vs R1救援*第页= 0.02; R2 shRNA：67%；R2救援：103%；R2 shRNA vs R2救援*第页= 0.0204). M、 模拟；SCR，加扰。N个=每种条件下3–6次生物复制。所有数据均表示为模拟或加扰控制的平均值±SEM的百分比。

SR3677以剂量依赖性方式降低sAPPβ和Aβ

为了研究药物对ROCK2活性的抑制是否影响Aβ的产生，用表达野生型人类APP的慢病毒转导小鼠初级皮层神经元695，并在暴露于RhoI、Y-27632或SR3677（一种高选择性ROCK2小分子抑制剂）后通过ELISA测量分泌的Aβ40和Aβ42(Feng等人，2008年). 与上述发现一致，RhoI或Y-27632治疗对Aβ几乎没有影响，而SR3677显著降低了Aβ40和Aβ42水平>75%(图2A类). 为了确定SR3677对人类细胞内源性aβ是否有类似作用，还对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞进行了测试。SR3677治疗使内源性分泌Aβ40水平降低68%(图2B类). 为了进一步表征SR3677对APP处理Aβ的影响，Aβ是表达APP的初级神经元695增加SR3677的剂量，用免疫印迹法或ELISA法测定全长细胞相关APP、sAPPα、sAPPβ和Aβ40的水平。密度分析表明，当剂量≥20μ米而sAPPβ和Aβ40均显示出更显著的线性剂量依赖性下降(图2 C类,E类). Fasudil是唯一经临床批准的ROCK抑制剂，对ROCK1或ROCK2缺乏选择性，但已成功用于治疗中风患者，且无严重副作用发生(涉谷等人，2005年). 与SR3677相比，在浓度≥20μ米在表达APP的初级神经元中695(图2E类). SR3677处理不会影响原代神经元培养物的细胞活力(图2F类). 此外，肌球蛋白轻链2丝氨酸19（ROCK2底物）的磷酸化(Totsukawa等人，2000年)，在暴露于SR3677或缺乏ROCK2的RNAi的神经元中减少，证实SR3677抑制神经元中的ROCK2激酶活性(图2G公司). 这些结果表明，ROCK2抑制以剂量依赖的方式强烈抑制APP的淀粉样蛋白生成过程。此外，SR3677反映了ROCK2的RNAi缺失对APP处理Aβ的影响，这有力地支持了SR3677诱导的表型是选择性ROCK2抑制的结果这一结论。

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SR3677以剂量依赖性方式降低sAPPβ和Aβ。A类，用表达APP的慢病毒转导神经元695并暴露于RhoI，Y-27632（Y-27，50μ米)，SR3677（50μ米)，或H2O（模拟）。SR3677分别降低Aβ40和Aβ42水平76%和78%***第页< 0.0001.B类将人SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞暴露于SR3677（50μ米)或车辆（H2O、 标记mock），并用ELISA测定分泌的内源性Aβ40。与模拟相比，SR3677治疗使Aβ40降低68%***第页< 0.0001.C类，表达APP的神经元695以指定剂量暴露于SR3677，并测量APP、sAPPα和sAPPβ（显示代表性印迹）。密度分析表明，当浓度≥20μ米（APP:20μ米, 58%; 40 μ米, 48%; 60 μ米，46%；sAPPα：20μ米, 67%; 40 μ米, 65%; 60 μ米, 57%; APP：模拟与20、40或60μ米, ***第页< 0.001; sAPPα：模拟vs 20 40或60μ米, *第页≥ 0.01). sAPPβ的减少呈剂量依赖性（sAPP？：模拟，100%；5μ米, 74%; 10 μ米, 40%; 20 μ米, 26%; 40 μ米, 21%; 60 μ米, 8%; 模拟与10μ米, *第页= 0.0341; 模拟vs 20μ米, *第页= 0.0138; 模拟vs 40μ米, *第页= 0.013; 模拟vs 60μ米, **第页= 0.0089).D类，密度分析C类用于计算sAPPα与APP的比值。在较高浓度的SR3677下，sAPPα与APP的比值增加。E类，表达APP的神经元695以指定剂量接触SR3677或Fasudil，并用ELISA测定Aβ40。SR3677以剂量依赖的方式降低Aβ40（模拟，100%；5μ米, 88%; 10 μ米, 70%; 20 μ米，56%；40微米米, 43%; 60 μ米, 26%; 模拟vs 5μ米, **第页= 0.0088; 5μvs 10μ米, ***第页= 0.0001; 10μvs 20μ米, ***第页< 0.0001; 20μvs 40μ米, **第页= 0.0016; 40μvs 60μ米, *第页= 0.0301). 当剂量≥20μ米（模拟，100%；5μ米, 107%; 10 μ米, 99%; 20 μ米, 83%; 40 μ米, 81%; 60 μ米, 78%; 模拟vs 20μ米, *第页= 0.0151; 模拟vs 40μ米, **第页= 0.0092; 模拟与60μ米, **第页= 0.0022).F类，将小鼠初级皮层神经元暴露于载体（H2O、 标记的模拟）或指示剂量的SR3677持续16小时。吉为了验证SR3677能够降低神经元中ROCK2激酶的活性，用SR3677（20μ米)或载体（模拟），16小时后收获以检测肌球蛋白轻链2丝氨酸19（pMLC-Ser19）的磷酸化，该丝氨酸19是ROCK2底物(Totsukawa等人，2000年)免疫印迹法。吉伊同时，用慢病毒转导神经元，驱动ROCK2靶向或干扰shRNA的表达，96小时后收获神经元。使用针对Ser19的磷酸特异性抗体进行的免疫印迹分析显示，暴露于SR3677或ROCK2的RNAi缺失类似地降低了pMLC-Ser19的水平，支持SR3677抑制神经元中的ROCK2激酶活性。肌动蛋白用作负载控制。M、 模拟；SCR，加扰。N个=每种条件下3–6次生物复制。所有数据均表示为相对于模拟的平均值±SEM的百分比。

SR3677降低5XFAD小鼠脑内BACE1活性和Aβ

在缺乏药代动力学和中枢神经系统穿透特性的全面知识的情况下，我们试图研究急性接触SR3677对5XFAD AD小鼠模型中APP处理Aβ的影响(Oakley等人，2006年). 用2 mg/kg SR3677或相同体积的载体（H2O、 标记为mock）通过立体定向注射到海马体。20小时后，提取主要注射部位（齿状回分子层）和紧邻针孔的上覆顶叶皮层进行生化分析。分别采集大脑半球，制备脑匀浆进行免疫印迹，检测APP和sAPPβ水平。密度分析显示，SR3677治疗小鼠的APP和sAPPβ分别减少至对照组的68%和23%(图3A类). 此外，通过ELISA测定了可溶性Aβ水平，与上述结果一致，SR3677处理的小鼠与模拟对照组相比，Aβ40和Aβ42显著减少(图3B类)。

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SR3677降低5XFAD小鼠大脑中的Aβ。SR3677或H2将O（mock）立体定向注射到5XFAD小鼠脑内。在左右半球进行注射。每个大脑半球被分别处理，左右半球的分析测量值被平均化，以得出每个大脑的一个数据点（每个条件四只小鼠）。注射后24小时，准备脑匀浆进行生化分析。A类，显示代表性免疫印迹。注射SR3677的脑内APP和sAPPβ与模拟相比分别减少32%和77%***第页= 0.001, **第页= 0.0036.B类与模拟大脑相比，注射SR3677的大脑中Aβ40和Aβ42的水平分别降低了53%和33%***第页< 0.0001, *第页= 0.0105. 所有数据均表示为相对于模拟的平均值±SEM的百分比。

基于暴露于SR3677后sAPPβ的显著降低，我们假设ROCK2抑制抑制BACE1的APP处理。为了测试这种可能性，使用荧光共振能量转移测定BACE1活性，以测量外源底物（APP）的裂解770肽667–676）。对SR3677处理的大脑的分析表明，与模拟对照组相比，BACE1活性降低了31%(图4A类)和免疫印迹表明，在SR3677存在的情况下，BACE1蛋白水平没有改变(图3A类). 为了探讨SR3677直接抑制BACE1的可能性，将重组BACE1蛋白与SR3677、BI IV或载体孵育，并测量酶活性。虽然BI IV活性无效，但在SR3677处理的样品中未观察到任何变化，这表明SR3677并不直接抑制BACE1(图4B类). 最后，为了解决ROCK2抑制是否会减弱内源性人类BACE1活性，将SH-SY5Y细胞暴露于增加剂量的SR3677中16 h，并分析匀浆中的BACE1酶作用。与结果类似体内，BACE1活性在剂量≥10μ米而BACE1蛋白水平保持不变(图4C类). 总之，这些发现表明，在ROCK2抑制后，观察到的APP加工为Aβ的减少部分是由于BACE1酶活性的抑制。

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SR3677抑制5XFAD小鼠大脑中的BACE1酶活性。A类根据荧光单位测量，药物治疗小鼠的BACE1活性降低了～31%。B类，重组BACE1蛋白与H孵育2O、 SR3677或BI IV，并测量酶活性。C类，SH-SY5Y细胞暴露于增加剂量的SR3677，并测量BACE1活性。浓度≥10μ时米BACE1活性显著降低（模拟与10μ米, **第页= 0.0063; 模拟vs 20、40或60μ米, ***第页< 0.002; 10μvs 20μ米, *第页= 0.0281).D类BACE1肽与重组ROCK2蛋白±SR3677孵育，并通过LC-MS/MS进行检测。具有代表性的BACE1 S498磷酸肽谱显示前体中性丢失峰。E类，S498磷酸肽的代表性提取离子色谱图（使用定义的前体质量容限测量为百分比强度）。x个-轴表示获得MS/MS光谱的时间。将肽强度归一化为含有ROCK2蛋白但不含SR3677的样品。F类，用BACE1或BACE1S498A转染SH-SY5Y细胞，24h后检测酶活性。与BACE1相比，表达BACE1S498A的细胞的酶活性降低了20%***第页< 0.0001. 代表性免疫印迹显示BACE1和BACE1S498A的表达水平。M、 模拟；SR，SR3677。N个=每种条件下4–6次生物复制。所有数据均表示为相对于模拟的平均值±SEM的百分比。

BACE1的细胞内分区影响其酶活性，并且S498处BACE1细胞质尾部的磷酸化调节BACE1流量(科尔和瓦萨尔，2007年). 为了测试BACE1 S498是否为ROCK2基板，在体外通过激酶分析，将含有BACE1氨基酸485-501的合成肽在有或无重组ROCK2蛋白的情况下培养。利用LC-MS/MS对肽进行独立分析，并收集MS/MS光谱，并根据串联目标-诱饵数据库进行搜索。我们的LC-MS/MS数据表明，ROCK2可以磷酸化BACE1 S498，对提取的离子强度的检查表明，SR3677的存在完全阻断了BACE1的ROCK2磷酸化(图4D类,E类). 在没有ROCK2（对照）的情况下，未发现BACE1磷酸肽。

散发性AD患者BACE1酶活性增加，免疫沉淀研究表明，BACE1在AD大脑S498处磷酸化(Fukumoto等人，2002年;Yang等人，2003年;von Arnim等人，2004年). 因此，我们想知道BACE1 S498磷酸化是否影响BACE1活性。为了验证这一点，用表达野生型BACE1或突变型BACEl的构建物转染SH-SY5Y细胞，这些构建物在S498具有丙氨酸替代（BACE1S498A）。20小时后，对细胞提取物进行BACE1酶活性分析。在表达BACE1S498A的细胞中，酶活性与BACE1相比降低了20%，表明S498对丙氨酸的突变抑制了BACE1的活性(图4F类). 基于这些发现，我们假设暴露于SR3677后观察到的BACE1活性的降低可能是由于ROCK2对BACE1 S498磷酸化的抑制。

SR3677改变BACE1的内吞分布并促进APP向溶酶体的运输

细胞生物学研究表明，APP的处理是由其细胞内运输和接触分泌酶决定的，Aβ是在内胚体室中产生的(西索迪亚，1992年;古和斯奎佐，1994年;Hartmann等人，1997年). 因此，我们试图确定ROCK2抑制后sAPPβ和Aβ水平的降低是否是由BACE1内吞流量的变化驱动的。为了验证这一点，BACE1在盖玻片上生长的HEK293细胞中瞬时表达。第二天用50μ米SR3677或车辆（H2O、 标记mock）6 h。固定后，对细胞进行BACE1染色，并标记早期内体（EEA1）、晚期内体（CD63）或溶酶体（LAMP1）。通过共焦显微镜对BACE1进行定位，图像分析显示，在接触SR3677的细胞中，BACE1与EEA1的重叠减少，但BACE1和LAMP1的共定位显著增加(图5A类,C类). 在SR3677处理的样品中，BACE1定位到CD63阳性隔室出现升高；然而，定量分析表明，这些变化与mock相比并不显著。这些观察结果表明，ROCK2抑制减少BACE1在早期内体中的驻留，并促进BACE1向溶酶体的转运。最新研究表明，APP的BACE1裂解发生在早期内体中；因此，在SR3677治疗后观察到sAPPβ水平的降低可能部分是由于BACE1重新分布到LAMP1阳性细胞室(Sannerud等人，2011年). 值得注意的是，在SR3677存在的情况下，BACE1蛋白水平没有改变，这表明BACE1可以从溶酶体降解中解救出来(图3A类,​,44C类;Koh等人，2005年)。

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SR3677促进BACE1和APP向溶酶体的流量。用表达BACE1的质粒转染HEK293细胞。用50μg的药物治疗6小时后，评估BACE1与以下细胞器标记物的共定位：EEA1、CD63和LAMP1米SR3677。A类BACE1（红色）和细胞器标记（绿色）的代表性图像以及共定位（黄色）显示在合并和放大图像中。B类合并和放大图像中显示了内源性APP（红色）和LAMP1（绿色）的代表性图像，以及同位化（黄色）。C类，BACE1染色的定量分析。SR3677减少了BACE1与EEA1的重叠（模拟，M2=0.5；SR3677，M2=0.2044***第页< 0.0001). SR3677增加了BACE1与CD63的共定位，但与模拟相比变化不显著（模拟，M2=0.2493；SR3677，M2=0.4499）。SR3677增加了BACE1与LAMP1的重叠（模拟，M2=0.2614；SR3677，M2=0.735***第页< 0.0001).D类，内源性APP染色定量分析。SR3677增加了APP与LAMP1的共定位（模拟，M2=0.2510；SR3677，M2=0.6501***第页< 0.0001). 数值显示为平均值±1 SD（误差条）。所示数据代表三个独立实验。比例尺：合并图像，5μm；放大图像，1μm。

此外，在SR3677存在或不存在的情况下，通过免疫荧光和共聚焦显微镜评估内源性APP向溶酶体的运输。与BACE1类似，SR3677治疗后APP更强烈地定位于LAMP1阳性细胞(图5B类,D类). 值得注意的是，APP抗体（C8）识别676–695氨基酸；因此，我们的APP染色可以反映全长APP以及所有C末端片段（CTF；Selkoe等人，1988年). APP和/或APP CTF向溶酶体的流量增加可能是APP蛋白水平和Aβ水平降低的原因，这是在暴露于浓度增加的SR3677后观察到的(图2C类)。

ROCK2在T654磷酸化APP，而T654对神经元中Aβ的生成至关重要

据报道，APP胞质尾部的磷酸化在APP向aβ和[γ-32P] 代谢标记研究表明，ROCK激酶结构域可以磷酸化APP(Lee等人，2003年;Amano等人，2010年). 基于这些观察结果，我们假设ROCK2磷酸化APP的细胞溶质结构域，并且这种作用影响Aβ的生成。为了确定磷酸化的假定位点，在体外通过激酶分析，在存在或不存在重组ROCK2蛋白的情况下培养包含全长APP细胞质尾部的合成肽。通过LC-MS/MS独立分析肽，并如上所述收集和搜索MS/MS光谱。我们的LC-MS/MS数据确定了一个对应于T654磷酸化的APP磷酸肽(图6A类). 此外，对提取离子强度的检查表明，与SR3677孵育完全阻断APP的ROCK2磷酸化(图6B类). 在没有ROCK2（对照）的情况下，未发现APP磷酸肽。

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ROCK2在T654磷酸化APP，而T654对神经元中Aβ的生成至关重要。此外，APP T654对丙氨酸（T654A）的突变与SR3677暴露相结合可协同降低Aβ40和Aβ42水平，表明抑制ROCK2活性通过至少两种独立机制抑制Aβ的产生。A类，APP肽与重组ROCK2蛋白±SR3677孵育，并通过LC-MS/MS进行检测。具有代表性的T654 APP磷酸肽谱显示前体中性丢失峰。B类，T654磷酸肽的代表性提取离子色谱图（使用定义的前体质量容限测量为百分比强度）。这个x个-轴表示获得MS/MS光谱的时间。将肽强度归一化为含有ROCK2蛋白但不含SR3677的样品。C类，用表达APP的慢病毒转导神经元695（WT）或T654A，以及sAPPα和sAPPβ的测定（显示代表性印迹）。密度分析表明，表达T654A的神经元sAPPβ减少了42%**第页=0.0047。D类表达T654A的神经元的Aβ40和Aβ42水平分别降低了40%和26%（Aβ40:WT vs T654A**第页= 0.0014; Aβ42:WT与T654A***第页= 0.0006; T654A:Aβ40 vs Aβ42*第页= 0.0425). SR3677（SR+）使WT表达神经元的Aβ40和Aβ42水平分别降低34%和35%。SR3677使表达T654A的神经元的Aβ40和Aβ42水平分别降低68%和59%（Aβ40:T654Avs T654A+SR*第页=0.0146；Aβ42:T654A与T654A+SR**第页= 0.0018). SR，SR3677。A类,B类，生物检测一式三份。C类,D类,N个=每种条件下3–6次生物复制，所有数据均表示为相对于对照的平均值±SEM的百分比。

因为在大脑中观察到T654的APP磷酸化(Oishi等人，1997年)，我们想知道T654是否影响Aβ的生成。用定点突变取代T654的丙氨酸，产生APP突变体T654A。为了评估这种突变对Aβ产生的影响，用表达WT APP的慢病毒转导初级皮质神经元695或T654A；72h后，用免疫印迹或ELISA法检测APP、sAPPα、sAPPβ和Aβ水平。密度分析显示，T654突变后sAPPβ减少了42%(图6C类). 与表达T654A的神经元相比，分泌的Aβ40和Aβ42水平分别降低了40%和26%(图6D类). 这些发现表明，T654，以及可能由ROCK2磷酸化T654对BACE1的APP处理和Aβ的生成至关重要。与T654A类似，与aβ42相比，SR3677暴露后5XFAD大脑中aβ40的减少更大(图3B类). Aβ亚型的这些明显变化可能暗示了T654磷酸化在APP C末端片段的γ-分泌酶处理中的作用。

上述结果表明，ROCK2抑制抑制BACE1活性并阻断APP T654的ROCK2磷酸化在体外; 因此，我们假设将SR3677治疗与T654A联用会协同降低Aβ水平。为了验证这一点，将表达WT或T654A的神经元暴露于低剂量的SR3677（20μ米)用ELISA法测定Aβ水平。用SR3677处理后，在表达T654A的神经元中观察到Aβ40和Aβ42水平显著降低，表明ROCK2抑制与T654突变的相加效应(图6D类). 这些观察结果表明，抑制ROCK2活性至少通过两种独立的机制减少Aβ的产生。

无症状AD、MCI和AD大脑中ROCK2蛋白水平升高

ROCK2是一种细胞溶质激酶，aβ的积累可能导致细胞内细胞溶质蛋白在AD中失去溶解性，从而有效地改变其功能(Xu等人，2013年). 为了评估AD脑中ROCK2蛋白水平是否发生变化，从16例AD和11例年龄匹配的无病理对照病例中制备额叶皮质组织匀浆(表1). 对匀浆进行SDS-PAGE和随后的免疫印迹(图7A–C). 密度分析表明，与对照组相比，AD脑中ROCK2水平升高(图7D类). 为了确定ROCK2的变化是否发生在疾病进展的早期，对9个轻度认知障碍（MCI）和5个无症状AD大脑进行了分析。MCI被认为是AD的前驱期，而无症状AD被假设代表AD神经病理学首次出现和临床症状出现之间的早期疾病阶段(Driscoll和Troncoso，2011年;斯珀林等人，2011年). MCI脑中ROCK2蛋白水平升高，与对照组相比，无症状AD患者的ROCK2水平显著升高。为了确定ROCK2水平的变化是否是由于AD脑内小胶质细胞或星形胶质细胞的积聚所致，对4例AD和4例对照病例进行了免疫组织化学分析。与对照组相比，ROCK2染色呈神经元样，在AD大脑皮质层I–II中升高。ROCK2与GFAP或Iba1阳性细胞、成熟星形胶质细胞和小胶质细胞的蛋白标记物的共定位作用最小(图7E类). 总之，这些结果表明，ROCK2水平在AD的早期阶段升高，并在整个疾病进展过程中保持升高。基于这些发现，再加上我们的药理学研究，我们提出ROCK2是一种基于机制的治疗靶点，用于对抗aβ的产生，以治疗AD进展。

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人类AD大脑中ROCK2蛋白水平升高。A–C使用来自对照组（CTL）、无症状AD（aAD）、MCI或AD大脑的死后额叶皮质匀浆进行免疫印迹。每条车道装载50微克，ROCK2水平归一化为肌动蛋白。案例编号对应于中的信息表1。D类密度分析表明，与CTL相比，aAD、MCI和AD的ROCK2分别升高了107%、28%和92%*第页= 0.0164, ***第页< 0.0009. 每种情况都表示为一个单独的数据点，直线表示平均值。E类，对照组和AD脑中ROCK2的免疫组织化学分析。ROCK2（红色）和Iba1（绿色）或GFAP（绿色）的代表性图像，合并图像中显示了Hoechst（蓝色）。比例尺，10μ米。

讨论

目前尚不存在对抗AD进展的有效疗法。然而，对AD动物模型的研究提供了强有力的证据，表明减少Aβ的生成可能缓解症状并减缓疾病进展。APP的BACE1裂解是Aβ生成的速率控制步骤；因此，限制这一步骤将减少Aβ的生成。虽然开发抑制BACE1的小分子遇到了巨大挑战，但本文的研究结果为抑制BACEl活性和抑制aβ生成提供了新途径。我们的结果表明，药物抑制ROCK2活性会降低sAPPβ的生成和Aβ水平，并提供了以下可能的机制：（1）抑制BACE1酶的作用；（2） 改变BACE1内吞流量；（3）修改T654处APP细胞质尾部的磷酸化。

直接抑制淀粉样分泌酶的酶活性充满了警告，与对无关底物的影响有关(De Strooper等人，2010年). 规避这些问题的一种方法是调节分泌酶活性，而不是直接抑制它们。这种方法正在探索γ-分泌酶调节剂。另一种策略是调节APP的翻译后修饰，阻止淀粉样蛋白生成过程，但保护APP的α-分泌酶裂解。我们在神经元中的发现表明，低剂量（≤10μ米)SR3677、APP和sAPPα水平的处理没有显著改变，而sAPPβ的生成减少(图2C类). 较高剂量（≥20μ米)、APP和sAPPα水平略低，但sAPP与APP的比值仍≥1:1(图2D类). 类似地，在5XFAD小鼠大脑中，暴露于SR3677略微降低APP水平，但耗尽sAPPβ(图3A类). 此外，免疫荧光和共聚焦显微镜研究表明，SR3677促进APP向LAMP1阳性细胞室的运输(图5D类). 在这些条件下，观察到的APP减少可能是由于（1）增强了APP再循环和α-分泌酶的后续处理，（2）增加了降解途径的APP流量，或（3）两者结合。

我们假设ROCK2在T654磷酸化APP体内抑制这种磷酸化有助于减少用SR3677治疗后观察到的sAPPβ和Aβ。虽然T654的功能作用尚不清楚，但T654在大脑中磷酸化，并包含YTSI基序，它介导APP的基底外侧排序(Haass等人，1995年). 核磁共振研究表明，T654磷酸化诱导构象变化，可能稳定细胞溶质因子与APP C末端尾部的结合(Ramelot和Nicholson，2001年). APP蛋白-蛋白相互作用的亲和力和/或特异性的变化可能有助于观察到对Aβ生成的影响。例如，脂蛋白受体LR11或SorLA通过管腔和胞质相互作用与APP复合，并介导APP的运输；然而，APP磷酸化是否在这种相互作用中起作用尚不清楚(Spoelgen等人，2006年). 值得注意的是，LR11和ROCK2在人脑中相互关联，与LR11的绑定可能会促进ROCK2对APP处理的影响(Herskowitz等人，2011年). 如果没有磷酸特异性抗体，评估LR11是否对细胞内APP T654的ROCK2磷酸化至关重要是一个具有挑战性的问题。此外，LR11与BACE1相互作用(Spoelgen等人，2006年); 因此，ROCK2与LR11的结合可能对抑制ROCK2活性后观察到的BACE1酶作用的影响很重要。

ROCK1或ROCK2敲低Aβ水平的相反结果表明，抑制这两种激酶的最终结果是有限的，这在使用RhoI或Y-27632治疗后观察到(图1A类,​,22A类). 这些发现强调了ROCK1和ROCK2对Aβ生成的影响可能相互独立，我们假设选择性抑制ROCK1会增加Aβ生成。先前的研究表明，组成活性ROCK1突变体（CA-ROCK1）的表达降低了sAPPα水平，而显性阴性ROCK1突变（DN-ROCK1）增加了过度表达APP的N2a小鼠神经母细胞瘤细胞中sAPPβ水平，同时伴有瑞典突变(Pedrini等人，2005年). 额外的实验表明，CA-ROCK1或DN-ROCK1的表达对人类细胞中Aβ的产生没有影响(Leuchtenberger等人，2006年). 在本研究中，我们表明，人类神经母细胞瘤细胞中ROCK1的RNAi缺失不会显著改变内源性全长APP或sAPPα水平，但会显著增加Aβ40的生成(图1B—E类). 在RNAi缺失ROCK1后，对内源性APP的β-和/或γ-分泌酶过程进行更深入的分析可能有助于阐明ROCK1如何影响Aβ的生成。

目前，Fasudil是临床上唯一可用的ROCK抑制剂，但它对ROCK1或ROCK2缺乏选择性(涉谷等人，2005年). 我们对Fasudil和SR3677的比较表明，异形选择性ROCK2抑制剂可能是减少AD患者APP淀粉样蛋白生成过程的更有效方法(图2E类). SR3677的激酶抑制剂谱包括大量激酶和其他非激酶相关的酶和受体(Feng等人，2008年). 在353种激酶中，SR3677仅命中5种抑制率>50%的激酶。此外，SR3677证明ROCK2的选择性约为ROCK1的八倍。SR3677的靶外命中率为1.4%，被认为是最著名的ATP-竞争性激酶抑制剂之一(Karaman等人，2008年). 显然，在异构体选择性ROCK抑制剂进入临床之前，还需要做更多的工作；然而，这些化合物在治疗AD中对抗Aβ生成的潜力引起了相当大的热情。

脚注

这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持，包括美国国立老龄化研究所（NIA）向J.H.H.提供的5K99AG043552–02赠款、美国国立神经疾病和中风研究所（NINDS）P30NS055077赠款以及美国国立老龄化研究所AG025688、P01AG1449和AG05136赠款。这项工作得到了国家卫生研究院NIA校内研究项目的部分支持。J.C.T.得到了约翰·霍普金斯大学老年痴呆症研究中心（NIAAG05146）和老年痴呆症协会（IIRG-09-134090）的资助。N.T.S.由老年痴呆症协会拨款NIRG-12-242297支持。我们感谢BrightFocus基金会ADR项目的捐赠者对本研究的支持。该研究项目的部分支持由埃默里大学综合细胞成像显微镜核心埃默里神经科学NINDS核心设施拨款。我们感谢Ranjita Betarbet博士和Craig Heilman提供的技术援助。

作者声明没有竞争性的经济利益。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会