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胃肠病学。作者手稿；PMC 2013年12月3日提供。
以最终编辑形式发布为：
胃肠病学。2012年10月；143（4）：10.1053/j.gastro.2012.06.036。
2012年6月27日在线发布。 数字对象标识：10.1053/j.gastro.2012.06.036
预防性维修识别码：项目经理3848328
美国国立卫生研究院：NIHMS500360标准
PMID：22750464

小鼠肝纤维化消退过程中肝星状细胞的失活

朱利安·特洛伊格（Juliane S.Troeger）,#1 英格玛·梅德拉克,#1 Geum-Youn Gwak公司,1 戴安·达皮托,1,2 穆雪茹,1 克里斯汀·C·徐,1 Jean-Philippe普拉德,1 理查德·弗里德曼,三，4和罗伯特·施瓦布1,2
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关联数据

补充资料

摘要

背景和目标

激活的肝星状细胞（HSC）是肝脏的主要成纤维细胞类型，在肝损伤停止后发生凋亡，从而有助于肝纤维化的解决。在本研究中，我们研究了HSC失活是否构成肝纤维化解决的额外机制。

方法

在内源性波形蛋白启动子（VimCreER）的控制下，通过单细胞PCR和遗传跟踪研究表达他莫昔芬诱导的CreER的转基因小鼠的HSC激活和失活。

结果

单细胞定量PCR显示纤维化肝脏中几乎整个HSC群体都被激活，并且在纤维化消退期间HSC激活逐渐减少，表明HSC失活。VimCreER标记的活化HSC，通过注射四氯化碳（CCl）后对膜结合绿色荧光蛋白（mGFP）Cre报告物的6至16倍诱导证明4)在肝脏和孤立的HSC中，mGFP标记的HSC的定位从窦周转移到纤维化间隔。对mGFP阳性HSC的追踪显示，CCI停止后30–45天，肝脏和孤立HSC中mGFP的表达持续存在40–45%4尽管纤维生成参数正常化，从而证实HSC激活的逆转。纤维化消退后，在结蛋白阳性的窦周HSC中再次观察到mGFP的表达；在肝细胞或胆管细胞中未检测到mGFP表达，因此排除了间质-上皮转换。值得注意的是，恢复的HSC仍处于启动状态，对纤维前刺激有较高的反应性。

结论

在小鼠中，HSC激活的逆转有助于在纤维化消退期间终止纤维化形成，但会导致恢复的HSC对复发性纤维化刺激的更高反应性。

介绍

肝星状细胞（HSC）被认为是肝脏的主要成纤维细胞类型。作为对损伤的反应，HSC经历了一个特征鲜明的激活过程，在此过程中，HSC失去了其特有的维生素a和脂质储存，并获得肌纤维母细胞表型1,2该激活过程由两种细胞因子（转化生长因子β和血小板衍生生长因子）驱动，导致收缩丝（如α-平滑肌肌动蛋白（αSMA））和细胞外基质（ECM）蛋白（如I型胶原）的表达增加。1,2虽然维生素A储存量的减少是HSC激活的一个特征，但它并不影响HSC的激活，因为HSC的正常激活缺乏特征性的维甲酸和脂滴。三

在过去的二十年里，这两种啮齿动物的纤维化肝脏的主要功能都得到了令人信服的证明，可以恢复到较少纤维化甚至正常的结构4–6以及成功治疗各种潜在疾病的患者。7–12以前的研究已经很好地证明，肝纤维化的逆转导致肌成纤维细胞的减少，而肌成纤维纤维细胞的这种减少伴随着肌纤维细胞凋亡的增加。6此外，通过药理学方法增加肌成纤维细胞凋亡可加速纤维化的消退，这表明细胞凋亡对这一过程具有致病作用。13虽然凋亡是从纤维化和肝硬化肝脏中去除活化的肌成纤维细胞的一个关键机制，但也可以想象活化的肌纤维细胞可能会重新分化并恢复到静止表型。在这里，我们采用单细胞PCR和基因追踪来测试激活的HSC能够失活的假设。

方法

Vim-CreER小鼠的产生

从p451质粒中PCR扩增出CreERFrtNeoFrt盒14与小鼠波形蛋白基因ATG位点周围的上游和下游序列同源。通过重组将PCR产物插入含有小鼠波形蛋白基因的BAC中。用阿拉伯糖诱导的翻转酶去除Neo盒后，将BAC DNA微注射到受精的CBA×C57BL/6J卵母细胞的原核中。注射三苯氧胺后，三分之一的创始人表现出较强的Vim-CreER活性。在实验中，用Balb/c小鼠繁殖一次，产生用于实验的雄性Vim-CreER+mTom/mGFP+小鼠。Vimentin-Cre的基因分型使用正向引物5'-CCCTTCCTCATTCTTTCC和反向引物5'-AGTTTAGCTGGCCTCAATG进行。所有动物程序都符合美国国家卫生研究院的指导方针，并得到哥伦比亚大学动物护理和使用委员会的批准。

纤维化诱导、三苯氧胺注射液和纤维化逆转

四氯化碳（CCl）腹腔注射四至八次可诱导肝纤维化4，0.5μl/g，以1:3的比例溶于玉米油中）。在一些实验中，小鼠在4-6周内以增加的TAA浓度（1）腹腔注射12-18次硫代乙酰胺（TAA）标准时间剂量：50 mg/kg，2第剂量：100 mg/kg，3第个至6第个剂量：200 mg/kg，以下所有剂量：300 mg/kg）。在一些实验中，小鼠进行了如前所述的胆总管结扎。15,16首次CCl后3天开始，通过6次腹腔注射三苯氧胺（2 mg/小鼠溶于玉米油）诱导Vim-CreER活性4注射并在最后一次CCl前一天结束4注射。

HSC隔离

如前所述，先用蛋白酶-胶原酶灌注，然后用Nycodenz梯度离心法分离HSC17,18在某些情况下，通过基于维生素A自身荧光的FACS分类进行额外纯化。

细胞培养中HSC的激活

为了比较正常和恢复的HSC对纤维原性刺激的反应，从未经治疗的Balb/c小鼠或接受4次CCl注射的年龄匹配的Balb/c小鼠中分离出HSC4（0.5μl/g i.p.），最后一次注射发生在隔离前45天。部分细胞直接溶解，无需任何平板或培养物（静态HSC），而所有其他细胞在含有10%FBS的培养基中平板4小时，然后在含有0.1%FBS的介质中，在有或无重组人TGFβ（2.5 ng/ml）或重组人PDGF（20 ng/ml，或在含有10%FBS的介质中。

其他实验程序在补充材料。

结果

在单个细胞水平激活损伤肝脏中的HSC

为了确定激活的HSC是否失活，我们首先比较了CCl中纤维生成基因的表达4-损伤停止后不同时间点的损伤肝脏和HSC达到损伤前和损伤峰值水平。四次注射CCl后4，最后一次注射后两天，整个肝脏中的纤维生成基因表达升高，最后一个CCl后30天，纤维生成基因的表达逐渐恢复到正常水平，几乎达到正常水平4注入(图1A). 该方案还诱导了显著的组织学纤维化，在最后一次CCl后30天几乎完全消失4注入(图1B). 与整个肝脏相似，我们还发现在最后一次CCl后1天和2天，纤维生成基因表达峰值4在隔离的HSC中注射，在最后一次CCl后的3天和5天，水平已经显著降低4CCl后第15天和第30天的注射和几乎正常水平4(图1C和补充图1). 为了研究激活的HSC可能在肝损伤停止后“失活”并恢复到静止状态的假设，了解纤维化肝脏中经历活化的HSC的比例是有帮助的。目前基于信使核糖核酸和蛋白质的方法只测量整个细胞群中的HSC激活，并且可能提示整个细胞群的激活，即使只有一小部分亚群激活，其余的亚群保持静止状态。为了解决这个问题，我们采用了FACS分类和单细胞PCR来量化HSC中纤维生成基因的表达。单细胞PCR显示，在最后一次CCI后2天，90%以上的HSC（p<0.01）处于激活状态4Col1a1的表达至少是单个静止HSC的10倍，且Col1a1a的表达高于单个静态HSC(图1D).

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CCl分析4-单细胞qPCR诱导HSC活化和失活

A–B类。在未经治疗的Balb/c小鼠（n=4）或经4次CCl注射治疗的小鼠的肝脏中测定了成纤维基因表达（A.）和苦味酸红染色（B.）4（0.5μl/g），最后一次CCl后2天（n=6）、15天（n=5）或30天（n=0.8）处死4注入。所示为与未经处理的对照组（a）和代表性图片（B）相比，mRNA水平的折叠诱导。C、。从未经治疗的Balb/c小鼠（n=4）或用4次CCl注射治疗的Balb/c小鼠分离的HSC中纤维生成基因表达的测定4（0.5μl/g），并在最后一次CCl后2天（n=3）、5天（n=3）、12天（n=3）或30天（n=5）处死4注入。D。从Balb/c未经处理的小鼠（n=58）分离的单细胞FACS分类HSC中或在4次注射CCl后的不同时间点测定其激活和失活4（对于d2 n=49，对于d3.5 n=45，对于d5 n=29，对于d15 n=53）。所示为每个时间点的三个代表性HSC隔离之一*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

肝星状细胞逐渐失活

在确定纤维化肝脏中几乎所有HSC都处于激活状态后，我们接下来通过单细胞qPCR研究HSC失活。如果HSC仅通过凋亡发生失活，则活化HSC的比例应持续下降，而在恢复期内，静止HSC取代活化HSC比例应增加，但持续活化的HSC的活化程度不应降低。相反，HSC应在恢复期内逐渐减少促纤维化基因的表达，如果能够失活，则没有或只有少数细胞应保持高度激活状态。在这两种情况下，整个群体的基因表达都会减少，但单个HSC的基因表达模式看起来会大不相同。通过单细胞qPCR分析，我们发现在CCI后第2天到第15天的整个恢复期内，几乎所有HSC中已确立的HSC激活标记物Col1a1和TIMP1的表达都逐渐且持续下降4(图1D). 这些数据强烈表明，几乎所有未被凋亡清除的恢复期肝脏中的HSC都是处于失活状态的HSC。为了验证这些发现，我们将小鼠置于TAA诱导的肝损伤作为第二种肝纤维化模型。尽管Col1a1上调的程度低于CCl4模型中，我们观察到在TAA停止后HSC的类似逐渐失活，再次表明HSC激活的逆转(补充图2A).

Vim-CreER标记肌成纤维细胞

为了通过第二种方法确定HSC失活，并量化纤维化回归过程中HSC失活性的百分比，我们制作了一种新型BAC转基因小鼠，用于标记和追踪损伤和消退阶段的肌成纤维细胞。我们选择由波形蛋白驱动CreER的表达，波形蛋白是一种中间丝，在肌成纤维细胞中高表达的间充质细胞群体中表达。19在肝脏中，波形蛋白主要在HSC中表达，但也可能在血管平滑肌细胞和门静脉成纤维细胞中发现20,21为了产生由波形蛋白启动子驱动的BAC转基因小鼠，我们在含有小鼠波形蛋白位点（Vim-CreER，补充图3). 使用mTommGFP Cre报告鼠标22其中mTom在没有Cre活性的情况下表达，mGFP在具有Cre活性的细胞中表达(图2A)，我们分析了肝脏和各种其他器官中的VimCreER标记细胞群。然而，6次注射三苯氧胺后，肝脏中mGFP的表达量很少，胃、小肠、结肠和肾脏中mGFP的表达量丰富(图2B). 我们还确定了Vim-CreER驱动的表达是否在其他肝细胞群中检测到，特别是在内皮细胞中，内皮细胞已知表达波形蛋白，尽管表达水平较低。在肝脏中，我们发现CD31表达的内皮细胞中没有Vim-CreER驱动的mGFP表达(补充图4)与之前的研究一致。21同样，mGFP和CD31在包括胃、小肠和结肠在内的其他器官中也有相似之处，但没有重叠(补充图4). 此外，表达F4/80的巨噬细胞未被Vim-CreER诱导的mGFP标记(补充图5). 这些发现表明，VimCreER是一种有用的工具，可以广泛而特异地标记肌成纤维细胞，并与正常肝脏仅包含少量肌成纤维纤维细胞的概念相一致，而肌成纤维是许多其他器官的组成部分。接下来，我们通过两种不同的方法诱导Vim-CreER小鼠的肝纤维化，CCl4注射和胆管结扎。在CCl后肌成纤维细胞定位的典型模式中，Vim-CreER强烈诱导mGFP表达4-诱导性肝损伤(图2C). 在胆管结扎模型中，mGFP的表达也被显著诱导，但程度低于CCl4模型(补充图6). 由于CCl中的标签更强4模型中，我们将重点放在该模型上，以进行剩下的纤维化回归研究。接下来，我们通过共焦显微镜证实了Vim-CreER介导的mGFP表达与内源性波形蛋白表达相匹配，这表明Vim-CreER-induced mGFP和内源性波状蛋白在纤维化肝脏和肠道中的共同定位(图2D).

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波形蛋白CreER标记肠道和纤维化肝脏中的波形蛋白表达细胞

答：。示意图显示了在没有和存在他莫昔芬诱导的Cre介导重组的情况下mTom/mGFP报告基因的表达。B。将Vim-CreER BAC转基因小鼠与mTom-mGFP-Cre报告小鼠杂交，并注射6×三苯氧胺以观察Cre介导的重组。图示为肝脏、胃、小肠、结肠和肾脏的代表性切片，其中Cre介导的重组可见绿色mGFP阳性细胞。C、。显示了6次注射三苯氧胺后正常肝脏的代表性切片，以及6次注射他莫昔芬和4次注射CCl治疗的肝脏4。D。注射4次CCl的小鼠肝脏4用抗波形蛋白抗体对未治疗小鼠的胃进行染色，并通过共焦显微镜进行分析，以证明波形蛋白CreER诱导的mGFP表达（绿色）和内源性波形蛋白表达（蓝色）之间存在重叠。

纤维化消退过程中活化HSC的逆转

为了确定激活的肌成纤维细胞是否会恢复到静止表型，我们将Vim-CreER小鼠置于CCl4-在用三苯氧胺诱导CreER的同时诱导肝纤维化，并分析损伤前、损伤高峰以及CCl停止后15天和30天mGFP的表达4处理(图3A). mGFP的表达从未经治疗的肝脏的0.2%增加到CCl的3.2%4-第2天治疗的肝脏(图3B–C). 尽管纤维化参数正常化(图3D)mGFP的表达没有恢复到治疗前的水平，但在CCl后第15天和第30天分别维持在1.5%和1.4%4(图3B–C)分别表明40%的肝肌成纤维细胞恢复到静止状态。此外，mGFP阳性细胞的定位也发生了变化，不再是典型的CCl细胞4-如箭头所示，诱导纤维间隔处于静止HSC的典型窦周定位(图3B). 为了证实观察到的纤维化肝细胞标记确实发生在HSC中，我们从CCl中分离出HSC4-在不同时间点处理纤维化肝脏，并通过FACS分析维生素A阳性HSC分析mGFP的表达。虽然只有4.6%的静止HSC表达mGFP，但在CCl后2天，mGFP的表达强烈增加到HSC的27.5%4处理(图4A-B). 与我们对整个肝脏的分析类似，HSC在损伤停止后保持mGFP表达，损伤30天后13.8%的HSC仍表达mGFP(图4B). mGFP阴性和mGFP阳性HSC的定量实时PCR显示两个群体都已失活(图4C–D)从而证明这些细胞不是在分解后期保持激活状态的细胞，而是它们从激活状态恢复到静止状态。冲销率，计算如下倒转=d日30−未经处理的d日2−未经处理的，为40%，因此与肝脏切片共焦显微镜观察到的肌成纤维细胞回复率相同(图3C). 为了进一步证实这些发现，我们额外电镀了分离的HSC和定量的细胞，这些细胞都是维生素A自身荧光的，并且在荧光显微镜下表达mGFP(图4E). 同样，在CCl停止30天后分离的HSC中mGFP的表达仍然存在4用3.6%来自未治疗肝脏的HSC阳性进行治疗，23%来自CCl第2天4-从CCl第30天开始，治疗肝脏呈阳性，12.5%4-治疗后肝脏阳性转为45%的逆转率(图4F). 我们分析了未接受CCl的小鼠中mGFP的表达4CCl后第2天对应的时间点4，我们想排除由于mGFP标记的HSC人群在第2天到第30天之间的潜在扩张，我们低估了mGFP信号。为此，我们还比较了未经治疗和CCl的肝脏切片和HSC4-在最后一次CCl后30天处死两组小鼠4注入(补充图7). 在这个实验环境中，我们再次发现mGFP阳性的肝脏面积和mGFP阴性的HSC显著增加，并且CCl中mGFP表达的诱导高度相似4--治疗小鼠(补充图7). 为了确定活化的HSC是否也会在更确定的纤维化中恢复到静止表型，用CCl治疗小鼠4持续一个月，然后恢复45天。与我们在短期纤维化模型中的数据类似，我们还发现活化的HSC逆转，在全肝切片和分离的HSC中测定的逆转率分别约为29%和37-43%(补充图8). 我们还采用18次注射硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝纤维化作为第二个长期模型，以证实HSC激活的逆转。在这个模型中，我们还观察到，在最后一次TAA注射后45天，纤维化峰值时mGFP标记显著增加，HSC中mGFP标签在统计学上显著保留，从而证实了我们在CCI中的发现4模型(补充图2B). 为了排除Vim-CreER表达细胞可能在恢复过程中从骨髓中募集，以及观察到的mGFP信号代表从骨髓中招募而非HSC逆转，我们在Vim-CreER阴性受体和CCl治疗小鼠中进行了Vim-CreER-阳性骨髓的骨髓移植4CCl后2天和30天，我们仅在肝脏中看到少量分散的GFP阳性细胞，占所有细胞的0.5%以下4治疗且无mGFP阳性HSC(补充图9A)从而排除了骨髓在纤维化高峰或纤维化消退期间对mGFP阳性细胞群的贡献(补充图9B–C). 总之，我们通过三种不同的方法，包括共聚焦显微镜、FACS分析和手动计数，观察到40-45%的肌成纤维细胞/HSC中mGFP表达的保留和活化的逆转。

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CCl消退过程中肝肌成纤维细胞失活4-诱导性肝纤维化

答：。三苯氧胺和CCl的定时示意图4注射，并牺牲VimCreER小鼠。B。未经治疗或CCl患者肝脏中mGFP和mTom的表达4-在最后一次CCl后2、15和30天，通过共焦显微镜观察治疗小鼠4注入。中间和右侧面板显示放大倍率较高，表示左侧面板中用虚线标记的区域。C、。mGFP表达被量化，并表示为未接受CCl的小鼠的总面积百分比4（n=10）和CCl4-最后一次CCl后第2天（n=6）、第15天（n=7）或第30天（n=30）给药小鼠4注入。D。用qPCR检测未接受CCl的Vim-CreER小鼠的全肝纤维化基因表达4（n=7）和CCl4-最后一次CCl后第2天（n=4）、第15天（n=3）或第30天（n=2）给药小鼠4注入。**p<0.01

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肝损伤停止后肝星状细胞失活

用6个三苯氧胺和4个CCl治疗Vimentin-CreER小鼠4在最后一次CCl后2天和30天分离注射和HSC4注入。在最后一次CCl后2天的相应时间，从接受玉米油和三苯氧胺的对照小鼠中分离出HSC4注入。A–B类。mGFP的表达通过维生素A自身荧光HSC的流式细胞术分析测定。显示了来自未治疗小鼠（n=4）、最后一次CCl后2天（n=4）和30天（n=6）分离的HSC的每个时间点的代表性FACS图像（A）和定量（B）4注入。插入物显示了来自每个分类细胞群的HSC，确认细胞为维生素A阳性HSC，表达mTom但不表达mGFP，或mGFP但不表达mTom。C–D。在4×CCl后2天，对来自未经治疗小鼠的mGFP阴性HSC和mGFP阳性HSC（每组5只），以及来自小鼠的mGFP阴性HSCs和mGFP-阳性HSCs进行Col1a1（C.）和αSMA（D.）的qPCR4注射（n=4个），以及4×CCl后30天从小鼠分离的mGFP阴性HSC和mGFP阳性HSC4注射（n=5 GFP阴性，n=4 GFP阳性）。E–F。在CCl后不同时间点，通过荧光显微镜检测电镀HSC mGFP的表达4并控制HSC。显示了维生素A荧光、mGFP表达和两者叠加的代表性图片（E.），以及从未经治疗的小鼠（n=6）、在最后一次CCI后2天（n=9）和30天（n=7）分离出的GFP-阳性/维生素A阳性HSC的定量（F.）4注入。**p<0.01

Vim-CreER标记的肌成纤维细胞不发生间充质-上皮转化

为了进一步证实活化的肌成纤维细胞恢复为HSC，我们对用结蛋白染色的肝脏切片进行了共聚焦显微镜检查，结蛋白是正常肝脏中HSC的一种众所周知的标志物。正常肝脏中mGFP染色很少，但mGFP阳性细胞的少数区域与结蛋白染色有明显重叠(图5A). 预期在损伤后30天mGFP表达增加，所有mGFP阳性细胞也呈结蛋白阳性(图5A)表明活化的mGFP标记的肌成纤维细胞确实重新分化为HSC。以前的研究表明，HSC也可能能够分化为上皮细胞23为了确定活化的mGFP标记的肌成纤维细胞是否也可以分化为肝细胞或胆管细胞，我们对HNF4α和泛角蛋白进行了共聚焦显微镜检查。多个动物和切片的仔细分析表明，没有mGFP阳性细胞具有典型的肝细胞核形状或HNF4α染色阳性(图5B). 同样，mGFP表达与角蛋白阳性胆管之间没有重叠(图5C)证明Vim-CreER标记的肌成纤维细胞在CCl中不能分化为肝细胞或胆管细胞4-诱导肝纤维化。

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肝肌成纤维细胞不经历间质-上皮转换

答：。为了确定mGFP标记的肌成纤维细胞是否再分化为HSC，对肝脏进行结蛋白染色并用共焦显微镜进行分析。典型图像显示未经治疗的小鼠和CCl中结蛋白（红色）和mGFP重叠4-在最后一次注射三苯氧胺31天后对小鼠进行治疗。B。为了确定mGFP标记的肌成纤维细胞是否分化为肝细胞，用HNF4α染色肝脏。共聚焦显微镜显示，没有mGFP表达细胞具有HNF4α阳性细胞核（蓝色）。C、。为了确定mGFP标记的肌成纤维细胞是否可以分化为胆管细胞，用泛角蛋白抗体对肝脏进行染色。共焦显微镜显示泛角蛋白阳性胆管（蓝色）和mGFP（绿色）之间没有重叠。

恢复的HSC更容易受到后续激活的影响

为了确定之前的激活和随后的失活是否会影响HSC生物学，我们比较了治疗后静止HSC和最后一次CCI后45天分离的HSC之间的纤维生成反应4治疗，从而恢复到静止表型。排除其他肝细胞类型对CCl损伤或代谢的适应4为了应对反复损伤，我们分离了HSC，并通过将其暴露于成熟的纤维生成刺激物（包括TGFβ、PDGF和10%胎牛血清（FBS））中，在细胞培养皿中激活它们。激活标记物αSMA在新的未镀层静止HSC和基线条件下保存在0.1%FBS中的HSC中的表达相似。然而，当用TGFβ、PDGF或10%FBS刺激HSC 48小时时，恢复的HSC表现出比治疗初期静止的HSC更高的激活水平，如αSMA蛋白表达增加所示(图6A–B)以及通过增加Col1a1和Acta2 mRNA的表达(图6C–D). 微阵列分析显示37个显著改变的基因，但没有揭示基因表达或通路激活的深刻变化，这可能解释了逆转HSC对特定纤维原性刺激的更高反应性(图6E,补充表1-2,补充图10). 相反，微阵列和qPCR分析表明，逆转HSC并没有完全达到qHSC的静止状态：与qHSC相比，逆转HSCs中升高的基因在肝纤维化高峰时也在HSC中上调，而在肝纤维化高峰期逆转HSC中表达较低的基因在HSC中下调(图6F)与恢复的HSC不完全恢复到静止状态一致。因此，尽管恢复的HSC没有显著升高的标记物水平，如αSMA或Col1a1，但很可能保持预激活状态，因此很容易激活以响应反复出现的纤维原性刺激。

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恢复的造血干细胞对纤维化刺激反应更强

HSC是从年龄匹配的未经治疗的小鼠或接受4次CCl注射的小鼠中分离出来的4（0.5μl/g i.p.），然后45天不治疗。A–B类。所示为未处理HSC（Ctrl）和d45回复HSC（d45）的代表性αSMA免疫印迹，使用未镀膜的新鲜分离静止HSC（qHSC），HSC在含有0.1%FBS的培养基中培养48小时，HSCs在含有10%FBS的介质中培养48 h，或HSCs经PDGF（20 ng/ml）或TGFβ（2 ng/ml，以及每组5个独立HSC分离物的αSMA免疫印迹的密度分析（B），归一化为肌动蛋白水平。C–D。所示为使用上述对照和d45回复HSC样品的纤维生成标记物Col1a1（C）和Acta2（D）的qPCR结果。E.公司。从接受4次CCl注射的小鼠中分离出的qHSC和还原HSC的微阵列分析比较4（0.5μl/g i.p.），然后45天不治疗。所示为所有校正p值<0.05且对数折叠变化至少为0.67的基因。F、。从上述微阵列中选择的基因的qPCR比较从未经治疗的小鼠（n=4）分离的HSC的表达水平，4×CCl后d2的表达水平4治疗（n=3）和4×CCl后d454治疗（n=4）。与从未经治疗的小鼠中分离出的qHSC相比，显示的是一倍。*p<0.05。**p<0.01

讨论

通过细胞凋亡去除肝肌成纤维细胞被认为是减少激活的肌纤维细胞数量并使肝脏恢复正常结构的关键机制。6在这里，我们提供证据表明，将肝肌成纤维细胞逆转为静止状态是导致肝纤维化消退的第二种机制。我们的研究使用了两种互补的方法，单细胞qPCR和遗传细胞命运追踪，以确定激活的HSC逆转为静止表型。单细胞qPCR明确显示CCl停止后HSC激活参数逐渐持续下降4-诱导肝损伤与HSC失活一致。单细胞PCR方法不排除HSC凋亡，也不允许确定HSC逆转的百分比，因为HSC分离物中无法分离和定量凋亡HSC。作为HSC逆转的第二条证据，我们在BAC-转基因Vimentin-CreER小鼠中使用了遗传细胞命运跟踪。我们的结果显示，对包括消化道和纤维化肝脏在内的各种器官中的肌成纤维细胞进行了可靠的追踪，当肌成纤维纤维细胞在肝纤维化过程中积累时，mGFP表达增加。有趣的是，尽管纤维化参数正常化，CCl4-诱导的mGFP在肝切片和分离的HSC中以类似的程度持续存在，显示出约40-45%的逆转率。这些结果表明HSC凋亡和失活是逆转小鼠肝纤维化的主要因素。需要进一步研究以确定HSC失活或凋亡的途径。众所周知，纤维化肝脏中的HSC数量增加。可以推测，通过细胞凋亡去除HSC不仅有助于减少纤维化，而且可以将HSC的数量恢复到损伤前的状态。由于我们使用了他莫昔芬诱导的Cre小鼠，并且在分辨阶段没有继续给予他莫昔酚，我们可以排除其他细胞群，例如新生成的HSC可能代表这种mGFP阳性细胞群。我们也没有发现mGFP阳性骨髓源细胞在纤维化高峰或纤维化消退后在肝脏积聚，进一步排除了逆转肝中mGFP阴性细胞可能代表从骨髓中mGFP-阳性来源而非逆转HSC中招募的细胞群的可能性。我们还可以排除，第30天残留在肝脏中的mGFP标记的HSC构成了一个细胞群，作为整个肝脏中的纤维生成标记物，以及分选的mGFP-阳性HSC比峰值激活低约95%，几乎达到基线水平。此外，我们发现“失活的”HSC从纤维间隔附近的局限性恢复到其在整个小叶内的特征性窦周位置。众所周知，趋化因子在控制和引导HSC向损伤部位迁移方面发挥着重要作用。24,25需要进一步研究以确定使HSC保持或返回正弦周定位的归航信号的性质。这种信号很可能构成Diss空间中存在的因子，这些因子要么在损伤肝脏中丢失，要么被损伤部位的化学引诱剂信号覆盖。肾中也显示出类似的周细胞从毛细血管向间质迁移，随后分化为肌成纤维细胞26虽然我们已经证明了HSC在损伤停止后恢复失活的主要能力，但尚不清楚这是否适用于所有情况，以及这种机制与肝纤维化或肝硬化患者的相关性如何。虽然我们也发现mGFP在更长时间的纤维化模型中持续存在，即在八次CCl后4或十八次TAA注射，人类纤维形成是一个经过多年发展的过程，因此与啮齿动物纤维化模型不同。我们也不能排除，一旦激活的HSC超过一定的激活阈值并达到“不可逆点”，然后凋亡或在肝脏中持续存在，它们最终可能会失去恢复到静止表型的能力。此外，在损伤停止后，不可降解的ECM可能仍存在于肝脏中，27,28这种持续的ECM可能会使一些肌成纤维细胞处于激活状态，无法失活。因此，赖氨酸氧化酶介导和组织转谷氨酰胺酶非依赖性ECM交联不仅影响肝脏僵硬，还影响肌成纤维细胞活化。28–30由于含有脂滴的活化HSC可以从患有晚期纤维化甚至肝硬化的人类肝脏中大量分离出来，31可以推测，大多数人类患者中都存在类似于我们研究中所调查的活化脂滴HSC群体，并且这些细胞的活化逆转也可能发生在损伤停止后的患者中。在我们的小鼠研究中，回复性HSC的数量为35–45%，但在人类中可能更低，并且很难量化。最近发表的一项研究也为HSC逆转的发生和HSC逆转百分比相似提供了有力证据32进一步强调了这一现象的相关性。

可以想象，HSC失活受到积极调控，或是损伤停止后减少暴露于纤维生成介质的结果。虽然我们对损伤停止后不同时间点分离的HSC进行了广泛的微阵列分析（数据未显示），但我们无法确定一种能将激活的HSC主动恢复到静止表型的介质或途径。我们观察到所有在CCl后第2天上调或下调的基因4在d5和d12接近损伤前水平，但没有发现潜在的“分辨率基因”，其上调或下调仅在纤维化峰值后开始，在分辨率阶段变化最大（数据未显示）。因此，我们认为最有可能的是，损伤停止后纤维生成介质的可用性降低是HSC失活的主要驱动因素。这意味着抗纤维生成治疗原则上不仅应阻止HSC的新激活，还应诱导已激活HSC的失活。这一发现具有潜在的临床意义，因为它预测HSC靶向抗纤维化治疗不仅可以用作预防策略，而且原则上应该在已经发生严重纤维化的环境中有效。这一知识对于针对HSC激活过程而非潜在疾病的药物的未来开发可能很重要。

恢复的HSC与静止的HSC表现出相当大的生物学差异，尽管它们几乎完全失活，在最后一次CCI后45天激活参数仅略有但无显著升高4注入。值得注意的是，与之前未被激活的静止HSC相比，恢复的HSC对包括TGFβ和PDGF在内的纤维原性刺激更为敏感。这些结果与本手稿编写期间发表的一项研究类似32微阵列分析和qPCR并没有揭示使回复的HSC对纤维原性刺激更加敏感的候选基因，但表明回复的HSCs的基因表达没有完全恢复到qHSC的状态，从而使其能够更快地重新激活。虽然我们观察到，如之前的研究所报告的那样，在纤维化峰值时，Hspa1a和Hspa1 b mRNA发生了深度下调（数据未显示）32，我们没有观察到在早期分辨阶段Hspa1a和Hspa1a的增加（数据未显示），我们的微阵列分析也没有揭示静止和恢复的HSC之间Hspa1a和Hspa1b水平的差异。肝细胞对反复纤维原性刺激的反应可能也依赖于其他肝细胞群，并受肝细胞敏感性和炎症细胞对反复损伤的反应的调节。

在肝损伤停止后，我们也没有观察到任何间质-上皮转换（MET）的证据。这些结果与之前的研究不同，之前的研究中，HSC通过GFAP-Cre追踪，纤维化是由胆碱缺乏、补充乙硫氨酸的饮食诱导的，23但与最近使用CCl的研究类似4用于GFAP-Cre小鼠的纤维化诱导，未观察到MET。33

总之，我们的研究表明，在肝纤维化消退过程中，大约一半的HSC人群失活，并且恢复的HSC对反复的原发性刺激有较高的反应性。

补充材料

补充图、表和方法

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致谢

拨款支持：本研究得到了拨款U54CA126513（项目2:RFS的PI）和U54CA163111的支持。Ingmar Mederacke得到了德国研究基金会（ME 3723/1-1）的支持。Dianne Dapito得到了1F31DK091980的支持。Jean-Philippe Pradere得到了美国肝脏基金会博士后奖学金的支持。

缩写

α-SMAα平滑肌肌动蛋白
CCl公司4四氯化碳
发动机控制模块细胞外基质
mGFP基因膜结合绿色荧光蛋白
HSC公司肝星状细胞
定量PCR定量实时PCR
TAA公司硫代乙酰胺
VimCreER公司Vimentin-CreaER公司

脚注

作者贡献：Juliane S.Troeger生成转基因小鼠并参与数据采集（4×CCl4模型）、数据分析和解释、统计分析、实验设计和手稿起草。Ingmar Mederacke参与了收购（4×CCl4型号，8×CCl4模型、TAA模型和还原HSC的表征）、数据分析和解释、统计分析、实验设计和手稿起草。Geum-Youn Gwak、Dianne H.Dapito、Jean-Philippe Pradere、Xueru Mu和Christine C.Hsu参与了数据采集和分析。理查德·弗里德曼进行了微阵列数据分析。Robert F.Schwabe负责总体研究概念和设计，起草手稿，监督研究并进行数据分析。

披露：不存在利益冲突。

工具书类

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