免疫学杂志。作者手稿；PMC 2013年12月2日提供。
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急慢性酒精对脂多糖诱导炎症的相反作用与人单核细胞中的IRAK-M有关1
马萨诸塞大学医学院医学系，马萨诸塞州伍斯特，邮编01605
摘要
饮酒后宿主防御受损与细胞因子产生的改变有关，然而，急性和慢性酒精对单核细胞/巨噬细胞的激活调节不同。我们假设，在人类单核细胞中，急性酒精会导致对LPS的低反应性，导致TNF降低-α而慢性酒精会增加TNF-α通过LPS致敏。我们发现，急性酒精增加了人单核细胞中IL-1R相关激酶单核细胞（IRAK-M），IRAK-1的负调控因子。这与I降低有关κB类α激酶活性κB DNA结合和NFκLPS刺激后B驱动的报告活动。相反，慢性酒精降低了IRAK-M的表达，但增加了IRAK-1和IKK激酶的活性，NFκB DNA结合和NFκB-报告人活动。使用小干扰RNA抑制急性酒精暴露单核细胞中的IRAK-M恢复LPS诱导的TNF-α慢性酒精巨噬细胞中IRAK-M的过度表达阻止了TNF的增加-α生产。添加酒精代谢抑制剂不会改变LPS信号和TNF-α慢性酒精暴露期间的生产。IRAK-1激活诱导MAPK在TNF中发挥重要作用-α归纳。我们确定，急性酒精降低了单核细胞ERK的激活，而慢性酒精增加了单核细胞核ERK的活化，ERK抑制剂PD98059阻止了慢性酒精诱导的TNF增加-α总之，抑制LPS诱导的NFκ急性酒精对B和ERK的激活导致单核细胞对LPS的低反应性，这是由于IRAK-M的增加。相反，慢性酒精通过减少IRAK-M的表达和NF的激活使单核细胞敏化为LPSκB和ERK激酶。我们的数据表明，IRAK-M在单核细胞不同长度的酒精暴露对LPS信号的相反调节中起着关键作用。
根据饮酒的持续时间和程度，饮酒既有好处也有坏处。虽然适量饮酒可能对心血管系统有好处，但它也会破坏对感染的免疫防御，并增加细菌性肺炎、丙型肝炎和HIV感染的易感性(1–三). 相反，长期饮酒会导致器官损伤和死亡率增加(4,5). 导致急性和慢性使用这些不同影响的细胞机制尚不明确。先天免疫细胞（如单核细胞和巨噬细胞）的缺陷可能导致酒精诱导的器官损伤。对动物和人类急性和慢性饮酒模型的研究表明，巨噬细胞功能受到调节(三,6,7).
单核细胞通过TLR4复合物的识别对内毒素作出反应，从而产生炎性细胞因子，尤其是TNF-αLPS与CD14/TLR4复合物结合，随后激活一系列下游信号分子，包括激活IL-1R相关激酶-1（IRAK-1）三激活IκB类α激酶（IKK）复合物和MAPK伴随I的解离κB类α核易位和核因子的DNA结合κB到靶基因的启动子区域，如粘附分子和促炎细胞因子，尤其是TNF-α，IL-1β和IL-6(8). 血清TNF升高-α已在酒精性肝炎患者中观察到(9). TNF的关键作用-α成功使用抗肿瘤坏死因子的实验阐明了酒精损伤-α抗体对酒精性肝炎和酒精依赖大鼠肝损伤的预防作用(10,11).
我们早期的研究表明，在体外和体内，急性酒精暴露与LPS诱导的人类单核细胞抗炎作用有关(12–14). 这与慢性酒精对炎症细胞因子基因表达的影响形成对比，其中TNF-α导致人类和小鼠模型的肝损伤(6,15,16). 因此，研究急性和慢性酒精暴露对LPS信号调节的差异与先天免疫细胞对酒精性肝病的发展和进展的贡献有关。在本研究中，我们假设根据接触时间，急性酒精和慢性酒精分别使单核细胞对随后的LPS低反应或对LPS敏感。为了验证我们的假设，我们开发了一个改良的体外系统来研究急性和慢性酒精暴露对LPS信号事件和TNF的影响-α人类单核细胞的产生(15). 我们报告说，急性酒精增加了IL-1R相关激酶单核细胞（IRAK-M），这是LPS信号的负调节因子，并导致LPS信号级联下游激活减少，最终导致NF受损κB DNA结合和反式激活，最终降低TNF-α生产。相反，慢性酒精通过降低IRAK-M、增加IRAK-1和IKK激酶激活，然后增强NF，将抗炎反应转化为促炎反应κB DNA结合、反式激活、ERK激酶激活和TNF-α生产。
材料和方法
细胞培养和试剂
如前所述，通过从Ficoll-Hypaque纯化的单核细胞制剂中选择性粘附分离人类外周血单核细胞(14). 本研究招募了18至60岁的健康个体，以及每周饮酒少于6杯的女性和男性，这些人以前没有酗酒史。该研究由研究中人类受试者保护机构委员会审查和批准。
RAW 264.7巨噬细胞购自美国型培养物收集中心，并保存在含有10%FBS（HyClone）的Dulbecco改良培养基（Invitrogen Life Technologies）中。PD98059和4-甲基吡唑和氰胺购自Sigma-Aldrich。液化石油气(大肠埃希菌菌株0111:B4）来自Difco和NFκ由寡核苷酸合成的B寡核苷酸。
酒精暴露和细胞刺激
单核细胞或RAW 264.7巨噬细胞被刺激大肠杆菌-衍生LPS（100 ng/ml）、25 mM乙醇，以及LPS和乙醇在图图例所示时间的组合。25 mM体外乙醇浓度接近0.1g/dl的血液酒精水平，这是在体内适量饮酒后达到的，略高于血液酒精浓度的法定限制。乙醇或脂多糖处理对细胞活力没有影响。将单核细胞和/或巨噬细胞置于6孔板中，并在长达7天的长时间内暴露于25 mM酒精中。对于短期或急性酒精暴露，细胞暴露于25 mM酒精24小时或更短时间，然后进行LPS刺激。
对于长时间酒精暴露，将暴露于25 mM酒精的细胞放置在比卢普斯-罗森堡（Billups-Rothenburg）培养箱中，培养箱底部的酒精浓度为培养箱底部酒精浓度的两倍，以使培养箱饱和，并将培养箱中的酒精浓度维持7天，如前所述(15). 使用安乃近酒精分析仪（安乃近仪器）测量每个孔中的酒精浓度。在7天期间，浓度保持在25 mM±4.5（mM EtOH：第1天：24±0.1；第2天：21.5±0.5；第3天：25±0.1；第一天：22±0.2；第5天：24？.7；第6天：22？.1；第7天：19.5±0.5）。
酶联免疫吸附试验
TNF公司-α和IL-1β使用BD Pharmingen的ELISA在无细胞上清液中进行评估。
小干扰RNA（siRNA）沉默IRAK-M
为了通过siRNA击倒IRAK-M，用IRAK-MsiRNA转染原始264.7巨噬细胞，并根据制造商的说明，使用siPORT NeoFx转染剂（Applied Biosystems）控制siRNA（AppliedBiosystes）。通过将GAPDH siRNA转染细胞来测定转染效果。转染48小时后，巨噬细胞暴露于25 mM酒精中24小时，然后用LPS刺激6小时。通过实时PCR和Western blotting分析总RNA提取物和全细胞裂解物中的IRAK-M，以确认IRAK-M-的敲除，并分析收集的上清液中的TNF-αELISA检测。
IRAK-M的过度表达
为了过度表达IRAK-M，从Origene购买了IRAK-McDNA克隆和控制载体（pCMV6-XL-4）。根据制造商的说明，将未经处理的巨噬细胞暴露于酒精中7天，使用脂质体和加试剂（Invitrogen）瞬时转染IRAK-M表达载体和对照载体。用LPS刺激转染细胞24小时以检查过度表达的影响，或用6小时来测定TNF的产生-α在IRAK-M过度表达细胞中。
RNA分析
根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）提取RNA，并使用无RNase DNA酶组（Qiangen）进行柱上DNA酶消化。通过分光光度分析对RNA进行定量，并通过OD（260/280和260/230比例）的测量和凝胶电泳对RNA的质量进行常规检查。cDNA合成是通过使用逆转录系统（Promega）对RNA进行逆转录来完成的。如前所述，使用iCycler-iQ实时检测系统（Bio-Read实验室）进行实时定量PCR(17). 人体肿瘤坏死因子-α引物由Maxim Biotech和人18S引物（正向5′GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT 3′；反向5′CCA TCC AAT CGG TAG CG3′）和IRAK-M引物（反向5′AGA GCA GCT CCT CCA AA 3′；逆向5′AAT TGA GCG ATT TGG TC 3′）合成。
表面标记的FACS分析
将单核细胞与饱和浓度的氟铬结合单克隆抗体在4℃孵育30分钟，然后在含有2%FBS的PBS中洗涤两次，并固定在1%多聚甲醛中。使用FACScan II流式细胞仪（BD Biosciences）收集数据，并使用FlowJo软件（BD bioscience）进行数据分析。抗人细胞表面蛋白CD14、TLR2和TLR4的荧光结合单克隆抗体及其相应的同型对照来自Bio-Source International和BD Pharmingen。
核和细胞质提取物的制备及电泳凝胶迁移率变化分析
根据Schatzle等人的方法，在37°C条件下对细胞进行有或无刺激的细胞核和细胞质提取(18)如前所述(19).
公认的双股NFκ使用B寡核苷酸（5′AGTTGAG GGGACTTTCGC3′）并进行EMSA(19).
免疫印迹法
核蛋白或细胞质蛋白（20μg） 将其装入每个孔中，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并在硝基纤维素膜上进行电印迹。通过在TBS/1%脱脂奶粉/0.1%吐温20中孵育膜，然后在图图例中显示Abs，可以阻止非特异性结合。抗磷酸和总Erk、JNK和p38的抗体购自Cell Signaling Technology，CYP2E1和IRAK-M购自Chemicon。兔子对抗我κB类α来自圣克鲁斯生物技术公司。β-肌动蛋白和TATA-结合蛋白Abs来自Abcam。使用HRP-共轭次级抗体（Santa Cruz Biotechnology）和细胞信号技术的化学发光分析试剂检测抗体。
NFκB报告子分析
NF公司κB依赖性报告质粒p(κB） 5-Luc是N.Mackman博士（加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所）的礼物，里面有五份串联的NF拷贝κ人类TNF的B位点-α基因。RAW264.7巨噬细胞暴露于酒精中4天或对照巨噬细胞被转染报告质粒5×NFκ如前所述，使用转染剂FuGENE 6（罗氏应用科学公司）的B-萤火虫荧光素酶和Renilla-luciferase作为对照（Promega）(20). 培养24小时后，对照细胞在有或无LPS（100 ng/ml）的情况下用25 mM酒精处理，或慢性酒精暴露的巨噬细胞暴露于LPS中8小时，并根据制造商的说明用双球荧光素酶检测试剂（Promega）评估荧光素瘤酶活性。法国试验标准κ萤火虫荧光素酶活性检测到的B转录活性用Renilla荧光素酶活动。相对光单位表示三份样品的平均值。
激酶分析
如前所述进行IKK或IRAK-1分析(20). 简言之，IKKβ和来自细胞质提取物的IRAK-1（500μg） 在裂解缓冲液中用各自的Abs沉淀（20mM Tris-HCl（pH 7.6）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1%Triton X-100），然后用50μl抗兔IgG珠（eBioscience），并在含有20mM HEPES（pH 7.6）、10mM MgCl的激酶测定缓冲液中测定2，1 mM DTT，5μCi公司[γ32P] ATP（NEN生命科学产品），10μM未标记ATP，以及0.5μg基板（适用于IKKβ激酶：GST-IκB类α（圣克鲁斯生物技术）；对于IRAK-1激酶：MBP（髓磷脂碱性蛋白）（圣克鲁斯生物技术公司）。
统计分析
Wilcoxon非参数分析用于Mac G4计算机（Apple）上的Statview（SAS Institute）程序，以分析TNF-α人类单核细胞中的水平。对于所有其他研究吨使用了测试。A类第页<0.05在所有研究中都被认为是显著的。
结果
急性和慢性酒精暴露对人单核细胞TNF-α表达的相反影响
循环单核细胞在急性酒精性免疫抑制和慢性酒精性肝损伤中起着重要作用，因为它们对感染期间内毒素（LPS）升高和酒精性肝炎患者血清中内毒素（LPS）升高有反应(9). 在本研究中，我们使用体外系统研究了急性（短期）和慢性（长期）酒精暴露对人类单核细胞的影响，该体外系统用于在培养7天内保持生理相关（25 mM）酒精浓度。表明急性酒精暴露（1-2天）可降低LPS诱导的TNF-α生产。然而，长期饮酒4-7天（慢性）会导致脂多糖诱导的TNF显著增加-α人类单核细胞的产生。TNF的变化-α与TNF相关的蛋白质水平-α首次饮酒3小时至1天降低LPS诱导TNF的mRNA水平-αmRNA和4-7天的酒精暴露显示LPS诱导的TNF增加-α信使核糖核酸()在人类单核细胞中。这些结果表明，单核细胞酒精暴露在初始阶段（急性）会导致对LPS的低反应性，而长时间（慢性）酒精暴露会使单核细胞对LPS诱导的转录和翻译水平调节的细胞因子产生敏感。
急性酒精减少，但慢性酒精治疗人单核细胞增加LPS诱导的TNF-α生产。A类，将人单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1至7天，然后进行LPS（100 ng/ml）处理18 h并检测TNF-α用ELISA法在无细胞上清液中检测。TNF平均值-α（微微克/毫升/106细胞）±SE（与LPS相比；*，第页< 0.001).B类LPS（100 ng/ml）治疗3 h和TNF-α用特异性TNF实时PCR测定mRNA-α如中所述的底漆材料和方法条形图表示mRNA±SE的倍数诱导（与LPS相比；*，第页< 0.01; **,第页< 0.001;n个= 6).
急性酒精诱导IRAK-M，而慢性酒精降低IRAK-M以调节下游LPS信号
各种研究探讨了LPS受体CD14和TLR4在慢性酒精致敏LPS诱导的肝损伤中的作用(21,22)以及急性酒精诱导的免疫功能(4,17). 因为人类单核细胞急性酒精暴露减少，而慢性酒精暴露增加，LPS诱导的TNF-α接下来，我们确定人类单核细胞酒精暴露1天或7天对CD14和TLR4表达是否有任何影响。流式细胞术分析表明，急性（1天）和慢性酒精暴露（7天）不会改变CD14和TLR4的表面表达，表明急性和慢性酒精介导TNF的变化-α其产生与人类单核细胞表面受体的表达无关。
酒精改变IRAK-M和IRAK-1水平，但对CD14和TLR4的表达没有任何影响。A类人单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）1天（急性）或7天（慢性），用CD14和TLR4 Abs染色，并用流式细胞仪进行分析。采用等型IgG抗体作为阴性对照。B类，将人单核细胞暴露于25 mM乙醇中7天（Chr），然后将LPS（100 ng/ml）暴露15分钟。按照材料和方法以髓磷脂碱性蛋白（MBP）为底物进行激酶分析。蛋白质在SDS-PAGE上分离，凝胶显示32磷酸化MBP。用IRAK-1抗体免疫印迹法（WB）测定IP样品中的等蛋白。下面的条形图表示闪烁计数器测量的基底中的cpm。（与unt相比；*，第页< 0.01; 与LPS相比；**，第页< 0.05;n个= 4).C类，将人单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后进行LPS（100 ng/ml）处理6小时，并使用特定IRAK-M引物通过实时PCR测定IRAK-MmRNA，如材料和方法条形图表示mRNA±SE的倍数诱导（与unst相比；*，第页< 0.01; 与LPS相比；**，第页< 0.02;n个= 4).D类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后进行LPS（100 ng/ml）处理24小时，并使用抗IRAK-M抗体通过免疫印迹法测定IRAK-M-蛋白水平，如材料和方法使用内部控制抗-β-肌动蛋白抗体。
LPS受体的参与增强了各种衔接蛋白如MyD88、IRAK-4和IRAK-1对CD14-TLR4复合物的激活(8). 随后，IRAK-1被磷酸化，然后与TRAF6相互作用，导致IKK激酶活化(23). 因为我们观察到急性和慢性酒精暴露不会影响CD14或TLR4的表达，所以我们试图确定在人类单核细胞酒精暴露期间是否有任何细胞内膜近端信号分子受到影响。与我们之前的研究中观察到的急性酒精降低LPS诱导的IRAK-1激酶活性相反(17)在本研究中，我们发现慢性酒精增强了LPS诱导的IRAK-1激酶活性()表明急性和慢性酒精暴露对IRAK-1激酶活性的调节不同。
IRAK-1激酶活性由LPS信号负调控因子IRAK-M调节，在单核细胞中表达，在低反应性和LPS致敏中起关键作用(24–26). IRAK-M通过抑制MyD88和IRAK-1的解离来关闭下游信号传导(24). 因此，我们假设急性和慢性酒精对人单核细胞中IRAK-M的调节不同，从而影响IRAK-1激酶的活性。表明LPS刺激人单核细胞6h后，IRAK-M mRNA被诱导。尽管急性酒精使LPS诱导的IRAK-M mRNA增加，但慢性酒精在基线和LPS刺激时显著降低了IRAK-M mRNA(). IRAK-M蛋白的表达遵循相似的模式，即急性酒精增加，慢性酒精暴露降低人单核细胞细胞质中的IRAK-M水平(). 因此，急性酒精暴露可能上调了IRAK-M，从而抑制了IRAK-1激酶的活性，而慢性酒精介导的IRAK-M下调可能导致IRAK-1酶持续活化。
为了证实IRAK-M在急性和慢性酒精暴露的单核细胞中的调节作用，我们要么在急性酒精暴露后使用siRNA抑制IRAK-M，要么在慢性酒精暴露巨噬细胞中过度表达IRAK-M。显示在急性酒精暴露的巨噬细胞中，IRAK-M mRNA敲除70%(上部面板)和蛋白质(中间面板)，显著恢复LPS诱导的TNF-α出现个级别。这些数据表明IRAK-M有助于减少LPS诱导的TNF-α急性酒精暴露期间的生产。相反，免疫印迹分析显示IRAK-M的高效过表达(上部面板)慢性酒精暴露的巨噬细胞阻止LPS诱导的TNF上调-α水平(B类；下部面板)提示IRAK-M在慢性酒精暴露期间炎症反应增加中起重要作用。
IRAK-M表达调节TNF-α在饮酒期间。A类，用对照siRNA（scr）和IRAK-M特异性siRNA转染原始巨噬细胞（对照细胞），并在暴露于25 mM酒精中48 h后再暴露于LPS中6 h。通过实时PCR和条形图分析总RNA提取物中的IRAK-MmRNA(上部面板)表示为IRAK-M基因表达的百分比（与对照组相比；*，第页< 0.009). 通过Western blot分析，在存在或不存在LPS的情况下对全细胞裂解液进行6 h的IRAK-M蛋白分析(中间面板)和上清液分析TNF-αELISA法生产(下部面板). TNF平均值-α（微微克/毫升/106显示了三个实验的±SE（与对照siRNA相比；#，第页< 0.007; **,第页< 0.01).B类，将原始264.7个巨噬细胞暴露于慢性酒精中7天，用控制载体或IRAK-M过表达载体（Origene）转染36小时，并在没有(插图图）或与LPS作用6小时。使用抗IRAK-M蛋白进行Western印迹(上部面板)对抗体和上清液进行TNF分析-α通过ELISA(下部面板). TNF的平均值-α（微微克/毫升/106细胞）±SE（与矢量控制相比；*，第页< 0.01; **,第页< 0.001).
急性和慢性酒精暴露影响IKK激活和ERK MAP激活
IRAK-1激活发出的信号导致κ介导I磷酸化的B激酶（IKK）复合物κB类α和NF活化κB类(23). 因为我们观察到急性和慢性酒精对IRAK-1活性的调节是反向的，所以我们接下来评估急性和慢性暴露于酒精的人单核细胞是否调节下游IKK激酶活性。表明急性酒精暴露降低了IKK-β激酶活性，慢性酒精增加IKK-β激酶活性。这些结果与急性酒精处理细胞中近端IRAK-1活性降低和单核细胞慢性酒精暴露后IRAK-1活化增强相一致。
急性酒精减少，而慢性酒精增加LPS诱导的人单核细胞IKK激酶活性。人类单核细胞暴露于酒精（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后用LPS（100 ng/ml）刺激15分钟。用IKK激发细胞质提取物β使用GST-I对裂解缓冲液中的抗体进行激酶分析κB类α作为基板，如所述材料和方法.蛋白质在SDS-PAGE上分离，凝胶显示32P-磷酸化GST-IκB类α。通过免疫印迹法测定输入样品中的等蛋白载量β-肌动蛋白Ab。条形图表示通过闪烁计数器测量的结合在基质中的cpm。（与unt相比；*，第页< 0.05; 与LPS相比；#，第页< 0.05; **,第页< 0.01;n个= 3).
除IKK激酶激活外，LPS诱导的IRAK-1激活还触发细胞内信号事件级联，包括MAPK，如ERK、JNK和p38激酶(27). 在本研究中，我们测定了急性和慢性酒精暴露对MAPK激活的影响：ERK、JNK和p38。使用Western blotting和磷酸特异性MAPK抗体，我们观察到急性酒精暴露降低了LPS诱导的磷酸化ERK激酶水平，而慢性酒精暴露显著增加了LPS诱发的磷酸化ERK激酶活性，而总ERK水平没有任何变化(). 此外，在急性酒精暴露的单核细胞中，LPS诱导的磷酸化p38 MAPK略有增加，而慢性酒精暴露对LPS诱导磷酸化p38MAPK没有任何影响(). 人类单核细胞JNK MAPK未受到酒精暴露的显著影响。重要的是，使用特定抑制剂PD98059抑制慢性酒精暴露的单核细胞中的ERK MAPK，可以抑制慢性酒精诱导的LPS诱导的TNF增加-α生产()表明ERK MAPK在人类单核细胞慢性酒精暴露后炎性细胞因子生成中起重要作用。
急性酒精抑制MAPK-ERK激活，而慢性酒精增加单核细胞中的磷酸-ERK水平。单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1天（Ac）或7天（Chr），然后进行LPS（100 ng/ml）处理15分钟。A类，使用抗特异性磷酸化抗体通过免疫印迹测定的总和磷酸化ERK、磷酸化p38和磷酸化JNK蛋白水平，如材料和方法。B类，显示了总共六个个体的磷酸-ERK带的平均密度单位±SE。（与LPS相比；*，第页< 0.05; #,第页< 0.02,n个= 6).C类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中7天（Chr），然后与ERK抑制剂（PD98059，50μM） 4 h，用LPS（100 ng/ml）刺激18 h。收集无细胞上清液并检测TNF-α在ELISA中。数据表示为平均值±SE（与LPS相比；**，第页< 0.001; 与Chr-Et加LPS相比；*，第页< 0.02,n个= 6).
急性与慢性酒精暴露对单核细胞IκB-NFκB活化的差异调节
法国试验标准κB激活是LPS诱导炎症级联信号的主要调节因子。LPS诱导的IKK激酶激活最终导致细胞质I的快速降解κB类α(8). LPS刺激人单核细胞显示I降低κB类α细胞质提取物中表明NFκB激活伴随着IκB类α退化，退化(). 如我们团队之前所示(19,20)，我们在这项研究中的结果证实了我κB类αLPS和急性酒精暴露的单核细胞中的IKK激酶活性降低，但其水平仍然较低(). 有趣的是，长期酒精暴露4-7天，然后LPS刺激，导致I降低κB类α这表明IKK激酶激活可能诱导IκB类α慢性酒精暴露单核细胞的降解。这些结果表明，虽然急性酒精诱导的IκB类α降解可能独立于IKK激酶、慢性酒精诱导的IκB类α降解依赖于IKK激酶活性。
急性和慢性酒精暴露促进脂多糖诱导的IκB类α单核细胞降解。将单核细胞暴露于酒精中1（Ac）、4和7天，然后用LPS（100 ng/ml）模拟60分钟。制备细胞质提取物，并用总I进行免疫印迹κB类αAb.条形图表示总共六个人的平均密度单位±SE（与LPS相比；*，第页< 0.02,n个= 6).
LPS诱导的IκB类αNF中的降解结果κ靶基因如TNF的B易位、DNA结合和反式激活-α(8). 当急性酒精与LPS结合时，LPS诱导NFκ酒精暴露1小时后，单核细胞的B结合活性显著降低(). 然而，单核细胞的慢性酒精暴露（4-7天）导致LPS诱导的NF显著增加κB激活(). 这些结果表明，急性和慢性酒精对IRAK-1和IKK激酶激活的相反影响延伸至NF的差异κ人类单核细胞中的B DNA结合活性。
急性和慢性酒精暴露对NF的相反影响κB结合活性与人单核细胞的酒精代谢无关。A类，单核细胞暴露于酒精中1（Ac）、4和7天，然后用LPS（100 ng/ml）模拟60分钟NFκEMSA使用32P标记双绞线NFκB寡核苷酸。条形图显示了总共六个人的平均密度±SE（与LPS相比；*，第页< 0.01).B类RAW 264.7巨噬细胞暴露于酒精（Et）中1（ac）或4天（chr），然后瞬时转染NFκ携带5个NF串联拷贝的B报告基因构建物κ萤火虫荧光素酶基因前的B结合位点和Renilla荧光素酶构造。转染后24小时，用LPS（100 ng/ml）处理细胞8小时。然后将细胞裂解以测定萤火虫荧光素酶活性，并将其归一化为Renilla荧光素酶活动。条形图表示荧光素酶基因与总共三个实验的未刺激对照相比的折叠激活。（与LPS相比；*，第页<0.01；**，第页< 0.02,n个= 3).C类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）中1至7天，使用抗CYP2E1抗体通过免疫印迹法测定CYP2E1蛋白水平，如材料和方法条形图表示总共六个人的平均密度±SE。D类，单核细胞与4-甲基吡唑或氰胺一起暴露于酒精中7天，然后用LPS（100 ng/ml）刺激60分钟κEMSA使用32P标记双绞线NFκB寡核苷酸。条形图显示了总共六个个体的平均密度±SE（与unt相比；*，第页< 0.001; 与LPS相比；**，第页< 0.001).E类，单核细胞暴露于25 mM乙醇（Et）和4-甲基吡唑或氰胺中7天（Chr），然后用LPS（100 ng/ml）刺激18小时。收集无细胞上清液并检测TNF-α在ELISA中。数据表示为平均值±SE（与LPS相比；*，第页< 0.001,n个= 6).
促炎细胞因子基因的转录是通过靶基因启动子中特定转录因子的结合来控制的。法国试验标准κB、 一个关键转录因子结合在TNF的启动子区域-α基因与启动转录(18). 因为我们发现NF的调节κB结合活性，我们想评估酒精是否影响NFκB启动子驱动的转录活性。NF的瞬时转染κ对照组RAW 264.7细胞或暴露于酒精中4天的细胞中的B-驱动荧光素酶报告子，显示NF增强κ选择人类单核细胞中的B结合。表明LPS刺激显著诱导NFκB介导的荧光素酶报告活性。此外，如前所述(20)，暴露25 mM酒精长达24小时或1天，然后进行LPS，导致NF显著降低κB介导的荧光素酶报告活性。然而，转染慢性酒精暴露的RAW 264.7细胞显示LPS诱导的NF显著增加κB介导的荧光素酶活性(). 这些结果表明，急性和慢性酒精暴露调节NFκB结合活性和反式激活提示NF的关键作用κB调节TNF-α酒精暴露期间的表达。
酒精代谢酶如CYP2E1在氧化应激相关肝损伤中起重要作用(29)并直接参与活性氧的产生。人单核细胞源性巨噬细胞诱导CYP2E1对酒精处理的反应水平低于肝细胞，但与其他肝外组织相似(30). CYP2E1产生的活性氧已被证明直接影响NFκB激活，这可能影响炎症细胞因子基因的表达(31). 因为慢性酒精会诱发NFκ激活B，使用4-甲基吡唑（CYP2E1的药理抑制剂）和氰胺（醛脱氢酶抑制剂），我们确定是否酒精代谢参与了这种作用。研究表明，长期饮酒7天以上会适度诱导人单核细胞中的CYP2E1。然而，使用4-甲基吡唑和氰胺抑制酒精代谢酶并不影响慢性酒精诱导NFκB DNA结合活性()和LPS诱导的TNF-α水平()表明尽管慢性酒精诱导人单核细胞中的CYP2E1，但酒精对NF的影响κB调节独立于CYP2E1。
讨论
关于急性酒精诱导免疫抑制导致感染易感性增加和慢性酒精介导肝病的研究表明，先天免疫细胞发挥着关键作用。对小鼠模型的体内研究表明，虽然慢性酒精会增加巨噬细胞对脂多糖的敏感性(7)人外周血单核细胞中的急性酒精降低LPS介导的促炎细胞因子(14). 确切的细胞内信号分子参与将酒精的急性免疫抑制作用逆转为炎症状态，目前尚不清楚。在这项研究中，我们首次使用人外周血单核细胞，证明了信号分子参与了急性酒精诱导的对LPS的低反应性和慢性酒精介导的单核细胞对随后的LPS刺激的敏感性。我们的结果表明，酒精的主要靶点是IRAK-M，它是LPS信号的负调节剂，参与急性和慢性酒精对LPS诱导的信号通路的相反作用(). 单核细胞急性酒精暴露似乎通过增加IRAK-M水平诱导对LPS的低反应性。然而，慢性酒精暴露会降低IRAK-M水平，导致对随后的LPS刺激敏感。因此，IRAK-M可以作为一个分子开关，将急性酒精诱导的抗炎表型转换为慢性酒精诱导的炎症表型。我们的结果表明，急性酒精诱导LPS低反应性的机制包括IRAK-1和IKK激酶活性降低、MAPK-ERK活化降低和NFκB激活独立于IκB类α退化。相比之下，单核细胞慢性酒精暴露后IRAK-M降低与IRAK-1和IKK激酶活性增加、MAPK-ERK活性增加和IκB类α-依赖NFκB放射性(). 急性或慢性酒精暴露的这些影响与CD14和TLR4表面表达无关，表明酒精只改变细胞内信号分子，从而对促炎细胞因子表达产生影响。
酒精根据暴露时间的长短改变IRAK-M，以不同方式调节人类单核细胞中的LPS信号。急性酒精暴露诱导而慢性酒精降低人单核细胞中的IRAK-M，从而降低或增加下游LPS信号分子IRAK-1、IKK、ERK和NF的活性κB、 最后是TNF-α生产。
急性和慢性酒精暴露对来自外周血单核细胞到来自脾、肺和肝的组织巨噬细胞的固有免疫细胞的影响可能是不同的。早期研究表明，使用抗生素对肠道进行消毒可以消除急性酒精对库普弗细胞的体内影响，表明循环内毒素在酒精的影响中起着关键作用(32). 此外，小鼠Kupffer细胞体内急性酒精暴露显示对LPS的反应性降低，这与IRAK表达降低、NF减少有关κB放射性(33)，并降低细胞内钙2+浓度(32). 随后的研究还表明，Kupffer细胞急性体内乙醇暴露通过依赖AP-1激活的机制增加CD14的表达(34). 此外，暴露于单剂量体内酒精和LPS体外刺激的脾脏和肺泡巨噬细胞显示出促炎反应显著减少和吞噬功能受损，这可能是由于模式识别受体和下游MAPK的抑制(36). 在我们的研究中，急性酒精不会影响LPS受体、CD14和TLR4的表面表达，而LPS介导的信号在人外周血单核细胞中发生改变。
除了LPS受体的下调外，LPS信号的负调控在LPS低反应性中也起着重要作用(37). 负调控因子如IRAK-M、SOCS-1、A20和Tollip在不同水平上影响LPS信号(37)并且在LPS低反应性和致敏性方面很重要。虽然IRAK-M和SOCS-1直接抑制LPS诱导的IRAK-1激酶活性，但Tollip影响IL-1受体相关的IRAK1激酶，A20直接抑制IKK激酶和NFκB激活(37). 最近的研究表明，上调IRAK-M对于Kupffer细胞对第二次内毒素刺激的低反应性至关重要(26). 在这项研究中，我们发现人类单核细胞急性暴露于酒精中长达1天会导致IRAK-M mRNA和蛋白质水平升高。我们实验室以前的研究表明，体内和体外急性酒精诱导SOCS-1表达，从而影响促炎细胞因子信号传导(38). IRAK-M水平升高伴随着LPS诱导的IRAK-1降低(17)IKK激酶活性和NF降低κB与I绑定κB类α退化。急性酒精暴露不仅降低NFκB DNA结合也降低了其反式激活潜能。这与先前的数据一致，即急性酒精促进NF的DNA结合-κ具有最低反式激活能力的B p50/p50同源二聚体(39). 法国试验标准κB二聚体从其与I的复合物中释放κB蛋白随后转移到细胞核。虽然急性酒精降低了NFκB与正在进行的I的结合活动κB类α急性酒精可抑制单核细胞的降解、IRAK-1和IKK激酶活性。我们早期的研究结果也表明，急性酒精暴露会影响神经功能κB p65磷酸化通过调节IKK激酶导致NF改变κB结合和TNF-α表达式(20)在人类单核细胞中。相互矛盾的报告显示巨噬细胞LPS低反应性期间ERK、JNK和p38 MAPK活性下调或无变化(40,41). 在我们的实验中，急性酒精选择性降低ERK MAPK水平，但对JNK和p38 MAPK没有显著影响。我们的总体结果表明，与急性酒精对库普弗细胞的体内作用相似(32)，短期饮酒会导致人血单核细胞出现“LPS低反应”状态，从而抑制TNF-α生产。此外，急性酒精暴露可导致人外周血单核细胞LPS低反应性，从而限制炎症反应，增加感染的易感性，与感染性休克患者相似(42).
与急性酒精相反，慢性酒精暴露于人单核细胞会导致LPS致敏，导致TNF增加-α表达。单核细胞暴露于酒精中4至7天，NF逐渐增加κB活化和TNF-α生产。这些结果与酒精性肝病中提出的长期酒精对脂多糖致敏的假设相一致，酒精诱导的肠源性内毒素增加导致促炎细胞因子诱导增加(43). 几项研究表明，体外或体内用慢性酒精处理的Kupffer细胞对LPS高度敏感，并显示TNF增加-α生产(44). Kupffer细胞中慢性酒精诱导的LPS致敏性归因于IRAK激酶表达和活性的增加，部分归因于CD14表达的增加(33). 我们的研究表明，人类单核细胞的慢性酒精暴露降低了IRAK-M的表达，并增加了IRAK-1激酶的活性，而CD14和TLR4的表达没有变化。这与晚期肝硬化患者的单核细胞显示TNF上调的研究一致-α产生的原因是IRAK激酶增加，NF增加κB活动，少IκB类α蛋白质水平、缺乏IRAK-M诱导和TLR4表达降低(45). 以往对单核细胞的研究表明，干扰素-γ粒细胞/单核细胞CSF可以通过抑制IRAK激酶降解并促进其与MyD88的结合来防止或逆转对LPS反应的降低，而不会对IRAK酶活性产生任何影响(46). 考虑到人类单核细胞长期酒精暴露导致IRAK-1激酶活性增加，IKK激酶活性上调导致LPS诱导的NF增加κB结合和TNF-α在我们的实验中，不能排除慢性酒精会增加干扰素-γ体内循环T细胞和NK细胞的生成，影响单核细胞的过度活动并增加炎症。这种可能性有待进一步调查。然而，在我们的实验中，即使在没有其他细胞类型的情况下，单核细胞中的IRAK-M在mRNA和蛋白质水平上也受到慢性酒精的抑制。最近的研究表明，使用人类单核细胞系Mono Mac 6细胞，慢性酒精会增加TNF的激活-α启动子及其产生，这取决于TRIF-IRF3途径的激活(47). 而慢性酒精诱导NFκ我们研究中观察到的B激活可能通过MyD88-IRAK-1途径发生，不能排除其通过TRIF-IRF3-TBK-1途径激活的作用。
与单核细胞和库普弗细胞不同，长期摄入酒精会降低TNF-α生产(48)肺泡巨噬细胞中与氧化应激相关的谷胱甘肽有效性降低，GM-CSF受体降低(35). 由于GM-CSF已被证明会导致TLR耐受性的丧失，因此很容易推测持续的TNF-α慢性饮酒后肺泡巨噬细胞的低反应性可能与GM-CSFR信号减少有关(35).
虽然MAPK调节在单核细胞和巨噬细胞LPS低反应性中的作用已经确定(38,39)没有研究表明ERK、JNK和p38 MAPK在增加LPS敏感性中起作用。在这项研究中，我们发现之前长期饮酒7天会选择性地增加随后LPS诱导的ERK MAPK激活，这有助于LPS诱导TNF的增加-α慢性酒精治疗后的产量。观察表明，一种特异性ERK激酶抑制剂可以防止慢性酒精诱导的TNF增加-α生产。类似于慢性酒精暴露的Kupffer细胞(49)这些研究表明，除了增加NF外，ERK MAPK激酶也发挥着重要作用κ慢性酒精暴露人体单核细胞的B活性。我们还发现，长期饮酒不会影响p38和JNK MAPK。在慢性酒精诱导的TNF中，IRAK-M的降低在IRAK-1激酶的下游激活以及随后IKK和ERK-MAPK的激活中起着关键作用-α人类单核细胞的产生。人类单核细胞慢性酒精暴露降低IRAK-M的确切机制将在未来的研究中探索。
虽然酒精本身对细胞功能和信号分子有直接影响，但其代谢产物也与免疫调节作用有关(29,50). 在我们的实验中，慢性酒精治疗（而非急性酒精治疗）会略微上调巨噬细胞中主要的酒精代谢酶CYP2E1的表达。有趣的是，NF的改变κB结合活性和TNF-α产生与CYP2E1激活无关，表明酒精对LPS信号的调节作用是直接的，而不是由于其代谢物。
总之，我们的研究表明，酒精介导的IRAK-M（一种单核细胞中表达的LPS信号的负调节因子）的调节可能是急性酒精暴露后LPS低反应性转变为重编程增加TNF的原因-α慢性酒精暴露后的基因表达。因此，从这些研究中可以明显看出，酒精暴露的时间长短和由此产生的外周血单核细胞免疫表型可能会导致感染易感性增加或酒精性肝损伤。
脚注
1这项工作得到了国家酒精滥用和酒精中毒研究所第AA011576号公共卫生服务拨款（发给G.S.）和第AA008577号公共卫生事务拨款（发给GS）的支持，并得到了马萨诸塞大学医学院艾滋病研究中心（5P30 AI42845号拨款）和糖尿病内分泌研究中心（DK32520号PHS拨款）的资源支持其内容完全由作者负责，不一定代表国家酒精滥用和酒精中毒研究所的观点。
三本文中使用的缩写：IRAK-1、IL-1R相关激酶1；IKK，我κB类α激酶；小干扰RNA。
披露
作者没有经济利益冲突。
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