美国国家科学院院刊。2013年11月26日；110(48): 19472–19477.
人类特异性内源性逆转录病毒插入物作为精神分裂症相关基因的增强子PRODH公司
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玛丽亚·桑托娃
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
b条俄罗斯莫斯科罗加乔夫联邦儿科血液学、肿瘤学和免疫学研究中心生物信息学实验室，邮编：117198；
埃琳娜·戈瓦泽
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
谢尔盖·萨洛津
c（c）俄罗斯莫斯科高等神经活动和神经生理学研究所分子神经生物学实验室，117485；
努尔沙特·盖富林
d日基础医学和
e（电子）俄罗斯国立研究医科大学病理学系，以N.I.Pirogov命名，莫斯科117997；和
费多·厄洛什金
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
谢尔盖·德米特里夫
（f）莫斯科国立罗蒙诺索夫大学别洛泽尔斯基理化生物学研究所，莫斯科119192，俄罗斯；
娜塔莉亚·马蒂诺娃
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
基里尔·库利科夫
e（电子）俄罗斯国立研究医科大学病理学系，以N.I.Pirogov命名，莫斯科117997；和
加琳娜·马拉科娃
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
古尔努尔·图赫巴托娃
c（c）俄罗斯莫斯科高等神经活动和神经生理学研究所分子神经生物学实验室，117485；
阿列克谢·波沙科夫
c（c）俄罗斯莫斯科高等神经活动和神经生理学研究所分子神经生物学实验室，117485；
德米特里·吉拉罗夫
一细胞信号系统基因组调控小组，Shemyakin-Ovchinnikov生物有机化学研究所，莫斯科117997，俄罗斯；
安德鲁·加拉沙
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
b条俄罗斯莫斯科罗加乔夫联邦儿科血液学、肿瘤学和免疫学研究中心生物信息学实验室，邮编：117198；
亚历山大·阿利珀
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
b条俄罗斯莫斯科罗加乔夫联邦儿科血液学、肿瘤学和免疫学研究中心生物信息学实验室，邮编：117198；
查尔斯·坎托
克波士顿大学生物医学工程系，马萨诸塞州波士顿，02215
尤里·索洛金
e（电子）俄罗斯国立研究医科大学病理学系，以N.I.Pirogov命名，莫斯科117997；和
谢尔盖·鲁米安瑟夫
b条俄罗斯莫斯科罗加乔夫联邦儿科血液学、肿瘤学和免疫学研究中心生物信息学实验室，邮编：117198；
巴维尔·巴拉班
c（c）俄罗斯莫斯科高等神经活动和神经生理学研究所分子神经生物学实验室，117485；
亚历克斯·扎沃伦科夫
b条俄罗斯莫斯科罗加乔夫联邦儿科血液学、肿瘤学和免疫学研究中心生物信息学实验室，邮编：117198；
安东·布兹丁
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
b条俄罗斯莫斯科罗加乔夫联邦儿科血液学、肿瘤学和免疫学研究中心生物信息学实验室，邮编：117198；
一细胞信号系统基因组调控小组，谢米亚金·奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，莫斯科，117997；
b条俄罗斯莫斯科罗加乔夫联邦儿科血液学、肿瘤学和免疫学研究中心生物信息学实验室，邮编：117198；
c（c）俄罗斯莫斯科高等神经活动和神经生理学研究所分子神经生物学实验室，117485；
d日基础医学院
（f）俄罗斯莫斯科罗蒙诺索夫国立大学贝洛泽斯基理化生物研究所，莫斯科119192；
e（电子）俄罗斯国立研究医科大学病理学系，以N.I.Pirogov命名，莫斯科117997；和
克波士顿大学生物医学工程系，马萨诸塞州波士顿，02215
Charles R.Cantor供稿，2013年10月19日（2013年8月2日送审稿）
作者贡献：M.S.、E.V.G.、S.S.、F.E.、S.E.D.、A.P.B.、C.R.C.、Y.S.、S.R.、P.B.、A.Z.和A.B.设计研究；M.S.、E.V.G.、N.G.、F.E.、S.E.D.、N.M.、K.K.、G.M.、G.T.、A.P.B.、D.G.、A.G.、A.A.、Y.S.和A.B.进行了研究；M.S.、E.V.G.、S.S.、S.E.D.、A.G.、A.A.、C.R.C.、S.R.、A.Z.和A.B.分析数据；M.S.、E.V.G.、S.S.、S.E.D.、C.R.C.、S.R.、A.Z.和A.B.撰写了论文。
了解人类和黑猩猩表型差异的分子基础可以为人类特有的行为特征和神经疾病提供重要线索。为此，我们对人类特异性内源性逆转录病毒（hsERV）插入物进行了全基因组分析，该插入物可能作为启动子和增强子诱导新的调控途径(1,2). HERV-K（HML-2）组的HSERV是四个转座因子家族中的一个，这些转座因子能够在人类血统辐射时从其最密切相关的物种黑猩猩的血统中转座(三). 至少50%的hsERV元件在人体组织中表现出启动子活性(4). 我们在已知人类基因的上游区域，靠近转录起始位点，仅发现6个hsERV插入。其中三种在瞬时转染实验中表现出较强的增强子活性；在这三个地方中，只有一个靠近PRODH公司基因与其内源性基因组拷贝的转录活性模式相匹配。该hsERV拷贝是一种全长、几乎完整的乙型逆转录病毒，属于HERV-K（HML-2）组。PRODH公司编码线粒体酶脯氨酸，脱氢酶（氧化酶），将脯氨酸转化为d日-1-吡咯烷-5-羧酸盐(5). PRODH调节脯氨酸分解代谢，这对正常的中枢神经系统功能至关重要。几个PRODH公司突变与神经精神疾病有关，如精神分裂症(6). 小鼠基因敲除导致大脑执行功能的严重变化(7). 鉴于PRODH公司在脑功能和疾病方面，我们试图描述其新发现的hsERVPRODH公司增强剂。我们展示了hsERVPRODH公司增强子活性受甲基化调节，hsERVPRODH公司增强剂和PRODH公司内部CpG岛协同激活其启动子。PRODH公司转录分析显示海马中表达水平最高，其中hsERVPRODH公司被低甲基化。此外，hsERVPRODH公司增强器，以及PRODH公司启动子和CpG岛引起神经元特异性表达。我们还发现hsERVPRODH公司包含两个用于结合转录因子SOX2的功能位点，该转录因子激活其增强子活性并且主要在海马中表达。我们的数据揭示了PRODH公司并确定在海马体中激活的人类特异性增强子。
结果
单个hsERV的增强剂活性试验。
对我们和其他研究人员之前确认的所有133株hsERV进行生物信息学筛查(8)在已知人类基因的近邻（转录起始位点<5kb）插入了六个元素。这些hsERV映射到SOCS4系列,PRODH公司,NDUFV1型,采埃孚3,KIAA1919年、和c3或f17(图S1A类).
接下来，我们试图通过瞬时转染实验证明这些元素的增强子活性。转录起始位点上游的基因组序列，包括hsERV元件（LTR+构造）或排除hsERV元素（LTR−构建）被克隆到6个基因的荧光素酶报告构建中()并用于荧光素酶分析(和图S1B类). 为了获得更好的准确性，我们使用了双荧光素酶报告试验（Promega）。对于上游地区SOCS4系列,PRODH公司、和KIAA1919年，我们检测到强大且具有统计学意义的增强子活性，具有标准化荧光素酶活性LTR+/长期风险率−比率为7到10倍(). 对于c3或f17，LTR的荧光素酶活性只有两倍的差异+和LTR−构件(图S1B类). hsERV的增强子效应仅限于四种试验细胞系之一Tera-1，表明其具有组织特异性。
荧光素酶报告子分析数据与内源性基因拷贝转录活性的比较。(A类)荧光素酶报告子构建方案。(B类)LTR的推广活动+和LTR−在Tera-1、NGP127、HepG2和A549细胞系中构建（标准化为SV40启动子活性）。(C类)mRNA水平SOCS4系列,PRODH公司、和KIAA1919年通过qRT-PCR测量细胞系中相对于内源性β-肌动蛋白的基因(ACTB公司)基因表达。(D类)人类和黑猩猩的启动子活性PRODH公司上游地区。长期风险率−，人类PRODH公司启动子区；长期风险率+，人类PRODH公司启动子区包括hsERV LTR；黑猩猩，直系同源黑猩猩PRODH启动子（缺乏hsERV）。数据显示三个独立实验的平均值±SD。
许多研究表明，瞬时转染数据可能与同一基因在其天然基因组环境中的内源性拷贝的表达模式存在显著差异(9). 因此，需要检查内源性基因拷贝表达，以完善瞬时转染数据。我们使用定量RT-PCR（qRT-PCR）评估我们研究中所有基因在用于瞬时转染实验的相同四个细胞系中的转录活性(和图S1C类). 在六个基因中的五个中，内源性基因拷贝的转录活性与其转染的LTR上游调控区之间没有相关性+和LTR−构造。然而，对于PRODH公司()我们发现LTR的启动子活性之间存在相关性+该基因的构建和内源性拷贝，在Tera-1细胞中两者的活性都明显增强，但内源性拷贝的转录与LTR之间没有相关性−构造。因此，在四种不同病因的人类细胞系中测试时，只有三种元素显示出较强的增强子活性（通过将来自真正启动子的相邻基因的表达增加7到10倍）。然而，我们不能排除其他检测的hsERV可能在其他人类细胞类型中表现出相当明显的增强子活性的可能性。在这三个hsERV中，只有一个元素，即hsERVPRODH公司在荧光素酶测试中显示出增强活性，与内源性拷贝的转录模式相匹配。
我们进一步尝试比较人类hsERV的启动子活性PRODH公司-缺少（LTR−)和hsERVPRODH公司-包含（LTR+)PRODH公司上游地区()带有黑猩猩的同源复制品PRODH公司缺乏逆转录病毒插入的上游区域。为此，我们扩增了2.4 kb长的黑猩猩PRODH公司并将其克隆到荧光素酶报告载体中。我们发现黑猩猩上游序列的活动与人类LTR的活动相当−构造，比LTR弱+构造。这些数据表明，在某些细胞类型中，人类PRODH公司收容hsERV的上游地区PRODH公司insert的转录活性明显高于同源黑猩猩序列。
hsERVPRODH公司因此，增强子可以代表人类和黑猩猩祖先分离后产生的基因表达的人类特异性调节。
HsERV公司PRODH公司，一种与CpG岛协同激活的人类特异性增强剂PRODH公司转录。
对PRODH公司转录。序列分析表明该基因包含一个内部CpG岛（CpGPRODH公司)部分与第二外显子重叠(). 调查是否包含CpGPRODH公司影响hsERV的活动PRODH公司增强子，我们添加了一个与CpG重叠的230-bp长片段PRODH公司萤光素酶报告基因构建体的序列(). 这个碎片包括了第一个PRODH公司非编码外显子、短第一内含子（62bp）和第二外显子直到翻译起始密码子的一部分。在这些实验中，我们使用了Tera-1细胞。我们发现CpG的存在PRODH公司序列强烈增强了hsERV的活性PRODH公司增强剂(). 相反，CpGPRODH公司对启动子活性没有影响PRODH公司缺乏hsERV的上游序列PRODH公司(). 这些数据表明hsERVPRODH公司和CpGPRODH公司可能在以下方面起协同作用PRODH公司转录调控。我们还发现hsERV内有一个DNase超敏簇PRODH公司这似乎比PRODH公司基因本身，由其聚类得分值反映(). 这一发现清楚地表明hsERVPRODH公司和CpGPRODH公司在体内具有功能活性。
PRODH-CpG岛对hsERV的影响PRODH公司-增强剂活性。(A类)PRODH公司基因上游区域。黑色条表示PRODH公司外显子；黑色箭头，PRODH公司转录起始位点；打开箭头，hsERV LTR；开条，hsERV内部区域；绿条，CpG岛；灰色条，DNase I超敏簇。灰色条下的数字表示聚类得分。数据取自加州大学圣克鲁斯分校的基因组浏览器，http://genome.ucsc.edu. (B类) (左侧)荧光素酶报告子结构的示意图。(赖特)相对PRODH公司启动子活性，归一化为SV40启动子活性。数据显示三个独立实验的平均值±SD。
hsERV的甲基化状态PRODH公司监管PRODH公司转录。
DNA甲基化被认为与沉默HERV-K（HML2）转录调控元件有关(10,11). 为了测试这种可能性，我们用体外甲基化LTR转染Tera-1细胞−，长期利率+或对照结构（对照组包括荧光素酶报告子上游的SV40启动子）。甲基化程度取决于CpG-DNA甲基化酶治疗的时间长短（0–30分钟）(图S2A类). 结果表明甲基化显著降低了hsERVPRODH公司和SV40报告人转录活动。这一结果与DNA甲基化对HERV-K（HML2）转录活性的调节至关重要的观点一致。
这些瞬时转染结果表明hsERVPRODH公司高甲基化可能抑制增强子活性，而低甲基化可能增加增强子活性。揭示hsERV的甲基化状态PRODH公司在本研究迄今为止使用的四种人类细胞系中，我们对hsERV全长进行了亚硫酸氢盐测序PRODH公司LTR。我们发现hsERVPRODH公司在HepG2、A549和NGP127细胞系中被广泛甲基化，但在Tera-1细胞中被低甲基化(图S2B类). 这些低水平的甲基化和PRODH公司在Tera-1细胞中表明hsERVPRODH公司可能是Tera-1细胞中一种活性的组织特异性增强子。CpG甲基化的类似分析PRODH公司显示，与hsERV不同PRODH公司，CpGPRODH公司在所有测试的细胞中都被低甲基化了(图S2B类).
PRODH公司编码脯氨酸脱氢酶的一种亚型，根据以前的报道(7,12)（人类http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGene？hgg_gene=uc002zoj.4&hgg_prot=E7EQL6&hgg_chro=chr22&hgg_start=18900286&hgg_end=18923806&hg_type=knownGene&db=hg19&hgsid=294069969)，主要转录于心脏、肺、肝脏和CNS。我们用人类睾丸、膀胱、心脏、肺和混合脑组织样本的qRT-PCR数据证实了这些报告(图S2C类). 最高的PRODH公司在大脑样本中可以看到转录，与推测的作用一致PRODH公司中枢神经系统功能异常。
我们检查了hsERVPRODH公司和CpGPRODH公司使用亚硫酸氢盐测序在相同的脑样本中甲基化。与我们之前的数据一样，CpGPRODH公司所有组织中的甲基化程度都一样低(图S2D类). 相反，hsERVPRODH公司在大多数分子中被严重甲基化；然而，在几个分子中，hsERVPRODH公司几乎完全没有甲基化（箭头图S2D类). 甲基化等位基因可能代表hsERV感染的细胞PRODH公司-增强子元件被抑制，而非遗传等位基因可能对应于具有活性增强子的细胞。
总的来说，我们的数据表明hsERV的活性PRODH公司增强子通过甲基化和PRODH公司受启动子和CpG以外的机制调节PRODH公司甲基化。此外，CpG的非甲基化状态PRODH公司我们在所有被调查组织中观察到的结果本身不足以为该基因提供高转录活性。
hsERV公司PRODH公司–CpGPRODH公司人脑中的相互作用。
因为PRODH公司是大脑特有的，因为大脑中含有一部分含有非甲基化hsERV的细胞PRODH公司，我们接下来检查了PRODH公司表达和CpGPRODH公司在不同脑组织类型中使用qRT-PCR。我们对来自单个供体的20种脑组织进行了qRT-PCR()并发现PRODH公司在海马体、顶叶和枕叶高度表达(). 我们还检测到顶叶、枕叶和丘脑的左右半球之间的差异()但需要使用更多的抽样进行进一步研究，以验证这种影响的重要性。
功能特性PRODH公司位于脑组织中。(A类)研究的大脑切片示意图。(B类)的表达式PRODH公司使用qRT-PCR相对于ACTB公司数据显示三个独立实验的平均值±SD。(C类)hsERV的典型甲基化模式PRODH公司(左侧)和CpGPRODH公司(赖特)位于左侧海马和额叶左侧半球。黑圈，甲基化CG二核苷酸；白色圆圈，非甲基化CG二核苷酸。(D类)来自人类海马左（l）半球和右（r）半球的亚硫酸氢盐处理的DNA的高分辨率熔融图谱。数据显示了hsERV的两个经PCR-扩增的亚硫酸氢处理的富含CG的片段PRODH公司C.meth，甲基化序列控制；C非甲基、非甲基化序列控制。(E类)的转录活性PRODH公司在人类和黑猩猩的脑组织中。数据是从NCBI GEO数据库中提取的，并计算了单个人类组织样本和黑猩猩平均组织中基因表达水平的倍数变化差异。任意单位表示PRODH公司人类样本和黑猩猩中位数的表达PRODH公司表达式。
接下来，我们使用亚硫酸氢盐测序分析来评估hsERV的甲基化状态PRODH公司和CpGPRODH公司在这些组织中。CpG公司PRODH公司所有组织都被低甲基化了。相反，hsERVPRODH公司除海马体左半球外，所有组织都强烈甲基化(). 该区域还包含最高的转录活性PRODH公司在被调查的组织中(). 随后使用甲基化敏感的高分辨率熔解试验对从健康人供体获得的另外八个独立的左右海马样本进行分析，结果显示hsERV甲基化不足PRODH公司海马体是人类的普遍特征().
最后，我们比较了PRODH公司使用从国家生物技术信息中心（NCBI）基因表达总表（GEO）数据库中提取的可用微阵列基因表达数据在人类和黑猩猩中的基因转录(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). 我们检查了18个人类脑组织样本和18个黑猩猩脑组织样本，分别代表海马体、前额叶皮层和尾状体(数据集S1). 这些样本包括七个人和六只黑猩猩的海马样本。与黑猩猩样本相比，在所有测试的大脑切片中，我们观察到人类PRODH的明显上调().
细胞类型特异性PRODH公司转录活性。
接下来我们研究了PRODH公司仅限于特定的海马细胞类型。我们用慢病毒构建物转化培养的大鼠海马细胞()在CMV组成启动子的控制下含有GFP，在CMV的控制下含红色荧光蛋白DsRed的报告基因PRODH公司发起人。我们在海马组织中检测到三种明显不同的形态细胞类型：神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。每种细胞类型至少观察到50个荧光细胞。在所有病例中，DsRed荧光仅限于神经元，但GFP荧光在所有三种细胞类型中都显示()，表明PRODH公司海马体的表达是神经元特有的。
携带上游人类的慢病毒构建物转化大鼠海马细胞PRODH公司区域。(A类)慢病毒构建体的图解结构。红色荧光蛋白（DsRed）置于PRODH启动子的转录控制下；GFP基因被置于构成型CMV启动子（+对照）的控制下。(B类)PRODH公司不同海马细胞类型的启动子活性。(C类)星形胶质细胞（a）和神经元（b）中DsRed与GFP荧光的比较。
hsERV的机制PRODH公司增强剂活性。
确定哪些转录因子与hsERV有关PRODH公司通过生物信息学筛选hsERVPRODH公司使用MatIspert对转录因子结合位点（TFBSs）的LTR(13)和阿里巴巴2.1(www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)程序。我们确定了约200个推测的TFBS。识别可能在功能上促成hsERV的TFBSPRODH公司增强活性，我们比较了Tera-1（hsERVPRODH公司增强子阳性）细胞与未显示hsERV的细胞PRODH公司增强子活性，即A549、NGP127、HepG2和NT2/D1（hsERVPRODH公司-增强子–阴性）(图S3)并以人左半球海马组织为样本。我们确定了一组在增强子阳性细胞中上调的转录因子基因(数据集S2和第3章). 只有两个基因，索2和NFKB1型，展示了之前使用生物信息学预测的TFBS。随后的qRT-PCR分析表明，这两个基因在Tera-1细胞和海马中同时上调，在所有四种增强子阴性细胞类型中均下调(数据集S2和第3章). 随后对基因表达谱进行的树状图分析表明，Tera-1和海马样本聚集在一起(图S4).
确定是否索2和NFKB1型功能性影响hsERVPRODH公司活性，我们在Tera-1细胞和增强子阴性细胞系NT2/D1中过度表达这些基因。的过度表达NFKB1型对hsERV增强子活性无影响PRODH公司在任一细胞系中(图S5A类)，但过度表达索2在NT2/D1细胞中对hsERV产生强烈的增强作用PRODH公司(,下部). 尽管Tera-1细胞的背景水平较高索2(,上部).
hsERV的规定PRODH公司SOX2转录因子的增强活性。(A类)的影响索2hsERV过度表达PRODH公司Tera-1中的增强子活性(上部)和NT2/D1(下部)单元格。数据显示三个独立实验的平均值±SD。(B类)Tera-1细胞、NT2/D1细胞和NT2/D1-细胞核提取物过表达SOX2结合位点的EMSA索2. (C类)带有突变SOX2结合位点的EMSA（突变核苷酸位置下划线）。(D类)体外产生SOX2蛋白的SOX2结合位点的EMSA。雷尼利亚荧光素酶蛋白作为阴性对照。位点1和2 SOX2，hsERV内的识别位点1和2PRODH公司; 位点1和2 mut，各自的突变位点；控制站点，控制识别序列。
接下来，我们使用与预测的hsERV相对应的放射性标记双链寡核苷酸进行了EMSAPRODH公司的TFBSNFKB1型和索2基因产物(图S5B类). 我们没有发现预测的hsERV带PRODH公司-绑定位置NFKB1型(图S5B类和D类)表明NFKB1不参与调节hsERV的增强子活性PRODH公司在SOX2的类似实验中，hsERV内的两个结合位点PRODH公司序列显示出强烈的阳性信号(图S5B类和C类). 竞争性寡核苷酸的实验证实，SOX2–TFBS结合对所研究的两个识别位点都具有序列特异性(图S5B类). 这两个位点都含有预测的识别基序AACAAAG。随后的实验比较了细胞类型核提取物的TFBS结合，证实在增强子阳性细胞类型（Tera-1和SOX2-过度表达的NTD/D1）中结合，而在增强器阴性细胞中没有结合(). 我们的分析还发现，SOX2识别基序中的四个核苷酸突变使SOX2与增强子的结合失效().
接下来，我们在体外生产SOX2蛋白，以确定TFBS识别是否由SOX2结合介导。合成SOX2编码mRNA，并用于与兔网织红细胞的细胞质提取物进行翻译。雷尼利亚荧光素酶作为阴性对照。放射性标记探针含有野生型或突变型SOX2 TFBS(). 我们检测到与野生型TFBS和阳性对照序列的结合，而在SOX2翻译混合物中，没有与任何突变的TFBS结合(). 这些数据提供了强有力的证据，证明hsERV的增强子活性PRODH公司是由SOX2绑定引起的。有趣的是，我们的生物信息学分析表明，这两种SOX2 TFBS在内源性逆转录病毒家族HERV-K（HML-2）的LTR中高度保守，分别出现在84%和51%的LTR（即557和366个基因组拷贝）中(图S6). 因此，HERV-K（HML-2）介导的体内SOX2结合可能不限于基因的调控PRODH公司转录，但也可能用于人类基因组的其他地方。
讨论
的重要性PRODH公司对于中枢神经系统的功能是明确的，但其确切作用不是。基因组基因座22q11的缺失，其包含PRODH公司与DiGeorge综合征有关，这是一种与包括精神分裂症在内的多种神经系统疾病相关的疾病(14). 在一些研究中，PRODH被鉴定为精神分裂症相关基因(15,16)但不是在另一个(17). PRODH是一种线粒体酶，催化脯氨酸分解代谢的第一步，PRODH功能失常会导致I型高蛋白血症。众所周知，这种情况会导致神经异常(18,19).PRODH公司也可能在神经介质的合成中发挥作用。脯氨酸可以通过两个中间步骤转化为谷氨酸(20). 反过来，谷氨酸本身可能起到神经递质的作用，也可能进一步转化为GABA(21). 因为脯氨酸可能用于神经元的谷氨酸合成(22),PRODH公司功能失常可能导致神经介质失衡(7).
在这里，我们展示了这一点PRODH公司由hsERV插入物正向调节。我们假设，在人类进化的某个阶段，hsERVPRODH公司插入可能会影响PRODH公司转录活性显著增加，并增加其在中枢神经系统的表达。我们证明hsERVPRODH公司，连同PRODH公司启动子驱动培养海马细胞中神经元特异性表达。值得注意的是，hsERVPRODH公司在人类海马样本中被低甲基化，其中PRODH公司显示出最高的转录活性。我们还揭示了hsERV的调节机制PRODH公司涉及SOX2的绑定。在大脑中，SOX2优先表达于海马体，海马体是精神分裂症患者受影响最大的大脑结构之一(23). 我们的发现表明hsERV的潜在作用PRODH公司中枢神经系统功能异常。这种CNS-特异性PRODH增强子的发现鼓励进一步研究，以发现影响其功能活性的分子特征及其与神经疾病的关系。我们的结果可以刺激对PRODH调节区甲基化如何与活体人脑功能相互作用的进一步研究。hsERV公司PRODH公司它本身是一个重复性元件，两端两侧是其他低分化的基因组重复序列(http://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks？position=chr22:18920392-18928317&hgsid=193710100&rmsk=完整)，使其成为精确DNA操作的困难靶点。然而，转基因技术的进一步发展可能会使将来充分探索hsERV的调节潜力成为可能PRODH公司以及转置元件的其他特定于人的插入。
方法
有关其他方法和详细协议，请参阅SI方法.
细胞系。
本研究使用了Tera-1（睾丸胚胎生殖细胞肿瘤）、NT2/D1（具有CNS前体细胞特征的部分分化睾丸生殖细胞）、NGP127（神经母细胞瘤）、HepG2（肝癌）和A549（肺癌）细胞系。细胞生长在含有10%（vol/vol）胎牛血清（Invitrogen）的DMEM/F12培养基上，37°C和5%CO2.
组织样本。
从人的心脏、肺、膀胱、睾丸、大脑皮层、海马、中脑、脑桥和小脑（左、中、右）以及左右额叶、顶叶、颞叶、枕叶、海马、下丘脑、丘脑和延髓提取组织样本，。所有样本均在死亡后24小时内从死于交通事故的成年（19至63岁）捐献者处采集。获得了捐赠者代表的知情同意，实验得到了Shemyakin-Ovchinnikov生物有机化学研究所机构审查委员会的批准。
原代神经细胞培养。
从新生Wistar大鼠幼鼠海马中制备原代神经元培养物。
DNA和RNA提取、cDNA合成、PCR扩增和克隆。
使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒（Promega）分离基因组DNA，使用SV总RNA分离系统（Promeca）提取RNA，并根据制造商的建议使用薄荷反转录试剂盒（Evrogen）进行第一链cDNA合成。使用Encyclo-PCR Kit（Evrogen）对上游基因区域和亚硫酸氢盐转化DNA进行PCR扩增。对于qRT-PCR，我们使用了qPCRmix-HS SYBR（Evrogen）。使用MxPro3000热循环器（Stratagene）进行qRT-PCR。引物序列列在表S1为了扩增启动子区域，我们使用从人类胎盘和黑猩猩混合脑组织中分离的基因组DNA（每反应约40纳克）。使用pGEM-T Easy载体（Promega）克隆PCR产物，然后亚克隆到pGL3-基本载体（Promega）和pDsRed-Express-N1载体（Clontech）。
慢病毒载体构建。
AvaI和HpaI将含有Bsp120I和MluI限制性位点的42-bp连接子克隆到慢病毒载体p156RRLsinPPTCMVGFPPRE中（这是以色列雷霍沃特魏兹曼科学研究所Alon Chen的礼物）。含有DsRed荧光蛋白的表达盒PRODH公司使用NotI和MluI限制位点将上游调控序列亚克隆到结果载体中。
细胞转染和荧光素酶检测。
根据制造商的建议，使用Unifectin-56转染试剂在24孔板中进行细胞转染；每个孔使用0.5μg DNA。携带测试基因上游区域和萤火虫荧光素酶基因的基于pGL3的报告基因构建物以10/1的比例混合，pRL-TK载体用作内部对照。萤火虫荧光素酶值标准化为雷尼利亚荧光素酶。对于人类转录因子SOX2和NFKB1的过度表达，我们使用了pMXs-hSOX2（Addgene；载体由莫斯科Vavilov普通遗传学研究所的Maria Lagarkova善意提供）和phNFKB1（载体由莫斯科Engelhardt分子生物学研究所的Alexander Belyavsky善意提供）。在这里，索2和NFKB1型基因受标准CMV启动子的控制。转染后48小时，使用双荧光素酶报告试验（Promega）和GENios Pro光度计（Tecan）测量四份荧光素酶活性。
显微镜。
使用ProLong Gold防褪色试剂（Life Technologies）进行安装。图像在LSM5Life共焦显微镜上拍摄，并使用ImageJ软件进行伪彩色处理(24).
微阵列杂交。
根据制造商的方案，使用HumanHT-12 v4表达珠芯片试剂盒（Illumina）进行微阵列杂交。微阵列杂交数据可在GEO（NCBI）上获得，登录号GSE43773。
体外DNA甲基化。
根据制造商的方案，使用M.Sss I CpG-甲基转移酶（SibEnzyme）在体外甲基化基于pGL3的报告构建物。
亚硫酸氢盐测序。
使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒（Qiagen）进行基因组DNA的亚硫酸氢转换，然后使用EpiTecht全亚硫酸氢试剂盒（Qiagen）进行扩增。然后用巢式PCR扩增DNA（引物见表S1).
体外翻译。
为了获得SOX2的mRNA编码，以pMXs-hSOX2质粒为模板，用含有引入的T7启动位点的正向引物SOX2T7合成PCR产物。如参考文献所述，反向引物T50含有一个50-nt长的3′poly（T）重复序列。24使用RiboMAX试剂盒（Promega）进行体外转录，随后进行氯化锂沉淀和m7G封盖步骤（ScriptCap；Epicenter Biotechnologies）。这一步之后是第二次氯化锂沉淀。一种带帽和聚腺苷酸的信使核糖核酸编码雷尼利亚荧光素酶是以类似的方式获得的(25). 对于体外翻译，使用经核酸处理的兔网织红细胞裂解物（RRL；Promega），并遵循制造商的协议(26).
核提取物制备。
按照参考文献所述进行核提取。27并在−70°C下进行校准和储存。
EMSA。
使用Klenow聚合酶用α32P dATP对退火的寡核苷酸进行放射性标记，然后在聚丙烯酰胺凝胶中纯化并储存在−20°C下。核提取物（每次反应5μg总蛋白）与750 ng非真核DNA预孵育。将标记的寡核苷酸（30000 cpm）添加到核提取物中，并在20°C下培养30分钟。培养后，将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。凝胶干燥并暴露于X射线胶片48–120小时。
统计和数据集分析。
为了进行统计分析，我们使用了STATISTICA软件(www.statsoft.com网站/)和at吨测试。为了比较人类和黑猩猩的基因表达，我们从GEO数据库中选择了GSE33010数据集(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). 我们处理了Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平台上分析的样本。使用GCRMA算法对36个样本的原始微阵列数据进行归一化(28)使用重新定义的探针集定义对和进行了总结。为了成对比较大脑基因表达谱，我们定义了六组样本：智人海马体（7个样本），黑猩猩海马体（6个样本），智人前额叶皮层（四个样本），黑猩猩前额叶皮层（6个样本），智人尾状核（七个样品），以及黑猩猩尾状核（6个样品）。样品来自黑猩猩被用作参考。
