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神经科学杂志。2008年7月16日；28(29): 7445–7453.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.1812-2008年8月
预防性维修识别码：项目经理3844787
PMID：18632948

前扣带回神经病理性疼痛的突触前和突触后放大

许慧（音）,* 吴龙俊,* 王汉森（Hansen Wang）,* 张雪涵（Xuehan Zhang）, Kunjumon I.瓦达坎, 苏珊·S·金, 亨德里克·W·斯坦兰,和闵卓通讯作者
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

神经病理性疼痛是由神经系统的原发性损伤或功能障碍引起的。研究主要集中于神经病理性疼痛的脊髓机制，而对神经病理性痛的皮层变化知之甚少。在这里，我们报道了外周神经损伤导致前扣带回皮质（ACC）内II/III层神经元兴奋性突触传递的长期变化。采用小鼠周围神经损伤模型，损伤后谷氨酸突触前释放概率和突触后谷氨酸AMPA受体介导的反应均增强。Western blot显示神经损伤后ACC中GluR1磷酸化上调。最后，我们发现，在缺乏钙刺激腺苷酸环化酶1（AC1）的基因小鼠中，神经损伤后突触前和突触后的变化均不存在。因此，我们的研究为神经损伤后皮质突触的长期突触前和突触后变化提供了直接的整合证据，并且AC1对这种长期变化至关重要。因此，AC1可能成为治疗神经病理性疼痛的潜在治疗靶点。

关键词：前扣带皮层，突触前释放，腺苷酸环化酶，AMPA受体，小鼠，神经病理性疼痛

介绍

长期增强（LTP）被认为是在大脑中存储感觉信息的关键机制(Kaas，1991年;布利斯和柯林里奇，1993年;Buonamano和Merzenich，1998年;坎德尔，2001年;勒杜克斯，2003). 例如，有害或疼痛的足部电击会触发杏仁核内兴奋性谷氨酸传递的长期变化(Davis等人，1994年;Malenka和Nicoll，1997年;McKernan和Shinnick-Gallagher，1997年;布莱尔等人，2001年;Tsvetkov等人，2002年;Rumpel等人，2005年). 据信，突触传递中的这种变化在恐惧记忆中起着关键作用。最近有报道称持续疼痛和记忆之间存在相似之处(伍尔夫和索尔特，2000年;Wei等人，2001年,2002;桑德库勒，2007年;卓，2007). 突触传递的长期变化，发生在位于体感通路或疼痛处理脑区的感觉突触中，导致慢性炎症和神经病理性疼痛(伍尔夫和索尔特，2000年;Wei等人，2001年;桑德库勒，2007年;Zhuo，2007年).

大多数关于感觉相关突触的研究都集中在外周和脊髓背角神经元的长期变化上(鲍彻和麦克马洪，2001年;Coull等人，2003年,2005;池田等人，2003年;Kohno等人，2003年;Balasubramanyan等人，2006年;池田等人，2006年;Nassar等人，2006年)，很少有研究对神经病理性疼痛状态下与疼痛相关的皮层突触进行检测。人类和动物研究的累积证据表明，前脑神经元，包括前扣带皮层（ACC）和岛叶皮层的神经元，对疼痛相关感知和慢性疼痛很重要。包括ACC在内的内侧额叶皮层局部损伤降低了患者的急性伤害性反应、伤害相关的厌恶行为和慢性疼痛(Lee等人，1999年;Johansen等人，2001年;卓，2006). ACC神经元的电生理记录表明，ACC细胞对周围有害刺激作出反应(Sikes and Vogt，1992年;山村等人，1996年;Koyama等人，1998年;Hutchison等人，1999年). 人类的神经成像研究进一步证实了这些观察结果，并表明ACC和其他皮层结构被急性有害刺激、心理疼痛和社会疼痛激活(Talbot等人，1991年;Rainville等人，1997年;凯西，1999年;Koyama等人，2000年;Rainville等人，2001年;Eisenberger等人，2003年). 然而，ACC神经元长期变化的分子和细胞机制却很少受到关注。例如，在神经性疼痛的情况下，兴奋性突触传递是否发生可塑性变化尚不清楚。如果是，是否存在突触前谷氨酸释放增强或突触后谷氨酸受体介导的反应？最后，触发皮层长期可塑性变化的关键信号蛋白或信使是什么？

在本研究中，我们使用了综合方法，包括电生理学、药理学、生物化学、行为学和遗传学方法来解决这些问题。我们使用脑片制备来研究神经性疼痛小鼠模型中神经损伤后ACC的兴奋性传递(Vadakkan等人，2005年). 我们发现，神经损伤会触发ACC内兴奋性突触的突触前和突触后变化。钙刺激腺苷酸环化酶亚型1的基因敲除(交流1−/−)我们发现突触前和突触后的变化都被消除了，这与小鼠超敏反应的减少一致AC1型−/−行为研究中的小鼠。

材料和方法

动物外科。

从Charles River购买成年（6-8周龄）雄性C57BL/6小鼠。小鼠保持12小时的光/暗循环。提供了食物和水随意。AC1型−/−小鼠在C57BL/6背景下繁殖数代。实验是根据多伦多大学动物护理委员会批准的方案进行的。这个AC1型−/−本研究使用与C57BL/6雄性小鼠年龄相同的雄性小鼠。如前所述，通过结扎腓总神经（CPN）诱导神经性疼痛模型(Vadakkan等人，2005年). 简言之，通过腹腔注射氯胺酮（0.16 mg/kg；Bimeda-MTC）和木聚嗪（0.01 mg/kg；Bayer）混合盐水对小鼠进行麻醉。CPN在前后组几乎横向运动的肌肉之间可见。左侧CPN用5-0铬肠线（Ethicon）缓慢结扎，直至足趾抽搐时可见足背屈肌收缩。在手术后第7天测试机械性超敏反应，并在手术后7-14天使用小鼠进行电生理研究(图1A类).

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周围神经结扎后ACC第II/III层突触传递增加。A类，Synaptic输入–从控件以切片形式输出曲线(n个=6个神经元）和神经门控(n个=7个神经元）小鼠*第页<0.05和**第页与对照组相比<0.01。开环，对照小鼠的神经元；用神经结扎小鼠的神经元填满圆圈。B类在ACC的第II/III层中记录间隔为50 ms的代表性痕迹。在35、50、75、100和150 ms的间隔内记录对照组和神经型小鼠的配对脉冲比率（EPSC2/EPSC1的比率）。开环，对照小鼠的神经元(n个=17个神经元）；神经结扎小鼠的神经元填满圆圈(n个=19个神经元）*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001.C类对照组和神经封闭组小鼠ACC第V层PPF。开环，对照小鼠的神经元(n个=9个神经元）；实心圆圈，来自神经结扎小鼠的神经元(n个=15个神经元）。D类对照组和神经门控组小鼠运动皮层神经元中的PPF。开放式圆圈，来自对照小鼠的神经元(n个=5个神经元）；神经结扎小鼠的神经元填满圆圈(n个=5个神经元）。

全电池接线灯录音

C类使用标准方法制备ACC水平的口脑片（300μm）(Wu等人，2005年;Zhao等人，2006年). 将切片转移到浸没式回收室中，并加入氧气（95%O2和5%CO2)含有人工脑脊液（单位：m米)124氯化钠、2.5氯化钾、2氯化钙2，1 MgSO4，25氯化钠三，1 NaH2人事军官4在配备红外差分干涉对比光学系统的BX51W1显微镜台上的记录室中进行实验，以进行可视化。用Axon 200B放大器（分子器件）从II/III层神经元记录EPSCs，并通过放置在ACC第V层的双极钨刺激电极进行刺激。以0.05 Hz的重复刺激诱导AMPA受体介导的EPSCs，在AP5（50μ米). 记录移液管（3–5 MΩ）中充满含有（单位：M）的溶液米)145 K-葡萄糖酸盐，5氯化钠，1氯化镁2，0.2 EGTA，10 HEPES，2 Mg-ATP，0.1 Na三-GTP和10磷酸肌酸二钠（用KOH调节至pH 7.2）。内部溶液（单位：m米)140甲磺酸铯，5 NaCl，0.5 EGTA，10 HEPES，2 MgATP，0.1 Na三GTP、0.1精胺、2 QX-314溴和10磷酸肌酸二钠（用CsOH调节pH至7.2）用于校正AMPA受体介导的传播实验。为了计算AMPA受体介导的EPSC的整流，我们记录了保持电位为−65、−5和+35 mV时的电流。然后使用负（−65 mV）和正（+35 mV）保持电位下EPSC峰值振幅的比值作为整流指数的测量。对于微型EPSC（mEPSC）记录，0.5μ米在灌注液中添加TTX。苦毒毒素（100μ米)一直在阻止GABAA类在所有实验中，受体介导的抑制性突触电流。接入电阻为15–30 MΩ，并在整个实验过程中进行监测。如果在实验期间访问电阻变化大于15%，则数据被丢弃。数据在1 kHz下过滤，在10 kHz下数字化。

蛋白质印迹。

将小鼠双侧ACC在含有10 m的裂解缓冲液中进行分离和均质米三氯化氢，pH 7.4，2 m米EDTA、1%SDS、1×蛋白酶抑制剂混合物（西格玛）和1×磷酸酶抑制剂混合物I和II（西格玛）。根据之前报告的程序进行分析(Wang等人，2007年). 简单地说，蛋白质样品通过Bradford测定法进行定量。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行等量的总蛋白电泳。将分离的蛋白质在4°C下过夜转移到聚偏氟乙烯膜上。用1:3000稀释的抗GluR1（Millipore）、抗GluR2/3（Millibore生物科学研究试剂）和1:1000稀释的抗磷酸-GluR1 Ser845（Millipore）对膜进行检测。将膜在1:3000稀释的适当辣根过氧化物酶偶联二级抗体中孵育1小时，然后使用Western Lightning Chemillumination试剂Plus（PerkinElmer Life Sciences）对蛋白质进行增强化学发光检测。为了确保载荷相等，还用1:3000稀释的抗肌动蛋白抗体（Sigma）对膜进行了探测。用NIH ImageJ软件定量蛋白质的免疫印迹密度。

细胞溶质和膜组分的制备。

如前所述制备细胞溶质和膜组分(Morozov等人，2003年)神经结扎后1周。简言之，ACC样品在裂解缓冲液（10 m）中均质米Tris，pH 7.4，300 m米蔗糖和1米米EDTA）含蛋白酶抑制剂混合物，然后在8000×克持续5分钟。丢弃含有核和碎片的颗粒（P1）。然后将上清液（S1）在40000×克持续30分钟，以获得上清液（S2）中的胞浆提取物和颗粒中的粗膜（P2）。将含有细胞膜的颗粒（P2）重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中。使用Bio-Read蛋白质试剂测定蛋白质浓度。Western blot检测GluR1和GluR2/3亚基的表达。肌动蛋白和钙粘蛋白的表达分别在细胞溶质和细胞膜提取物负载相等的情况下进行检测。

插管手术和微量注射。

用异氟烷（根据需要，1–3%）吸入30%氧气和氮气平衡的异氟醚对小鼠进行麻醉。剃去头皮，然后用碘（三碘乙烷）和酒精清洗。将小鼠头部固定在立体定向支架（Kopf 962型）上的立体定向适配器上，并在眼睛上涂抹润滑剂（人造泪液）。在头骨上开了一个切口，露出了表面。在ACC上方钻了两个小孔，硬脑膜被轻轻反射。放置引导套管，使微注射的最终坐标为前角0.7 mm，中线外侧0.3 mm，颅骨表面腹侧1.75 mm(Wei等人，2002年). 对于微注射，小鼠被限制在塑料锥内（Braintree Scientific），并在微注射导管上的塑料上切下一个小孔。取下假套管，将微量注射套管插入导管。使用30号注射套管，比导管低0.8 mm。使用电动注射泵（Razel Scientific Instruments）和Hamilton注射器进行微量注射。CNQX（1米米)通过套管将溶解在盐水中的溶液输送到左侧和右侧ACC（1分钟内500nL）。通过观察半月板沿一段校准的聚乙烯（PE10）管向下的运动来确定注射量。注射到大脑两侧后，将注射套管留在原位1分钟，以帮助防止任何溶液回流到导管。然后将套管缩回并插入大脑的另一侧。显微注射后，立即将动物送到一个透明的塑料圆筒中进行行为观察。

机械痛觉超敏试验。

将小鼠置于圆形容器中，让其适应30分钟后再进行测试。机械性痛觉超敏是根据后爪对冯·弗雷纤丝（斯托尔廷）应用于弯曲点的反应来评估的。积极的反应包括舔、咬和突然收回后爪。对阈值刺激进行了实验表征。在正常小鼠中，1.65根细丝的机械压力（力，0.008 g）是无害的。然后用这根细丝测试神经结扎后的机械性超敏反应。机械性痛觉超敏反应测试五次，试验间隔为10分钟。然后允许动物休息20分钟，然后再次测试机械性痛感超敏反应。共进行三个机械性痛觉超敏试验集作为基线（第5天），两个试验集（第6天）在药物输注后进行。结果表示为阳性反应的百分比。

数据分析。

结果以平均值±SEM表示。使用双向方差分析和学生的t吨测试。利用累积概率图对mEPSCs进行分析。重要性级别设置为第页<0.05。

结果

增强兴奋性突触传递

为了探讨神经损伤后ACC内的基础突触传递是否发生变化，我们在外周神经结扎小鼠ACCⅡ/Ⅲ层锥体神经元中记录了AMPA受体介导的EPSCs(Vadakkan等人，2005年). 记录的神经元被鉴定为锥体神经元，这是因为它们能够对长时间的去极化电流注入作出反应，表现出尖峰频率适应(Tsvetkov等人，2004年). 周围神经损伤后，AMPA受体介导电流的输入（刺激强度）-输出（EPSC振幅）曲线明显向左偏移(n个=7个神经元/5只小鼠），与对照组相比(n个＝6个神经元/4只小鼠，第页< 0.05) (图1A类). 这些结果表明，周围神经损伤后ACC兴奋性突触传递增加。

改变配对脉冲促进

为了研究突触前或突触后机制是否介导神经病理性疼痛小鼠ACC中增强的兴奋性突触传递，本研究检测了ACC神经元中的配对脉冲易化（PPF）。PPF是一种暂时的可塑性形式，通常用于测量突触前功能，在这种情况下，由于第一次刺激后突触前末端的残余钙，对第二次刺激的反应增强(福斯特和麦克诺顿，1991年). 在对照小鼠中，在35、50、75、100和150ms的不同刺激间隔下观察到PPF。神经结扎后，ACC神经元中的PPF显著降低(n个=19个神经元/7只小鼠）与对照小鼠相比(n个=17个神经元/7只小鼠，双向方差分析，第页< 0.05) (图1B类). 为了测试神经损伤后PPF的变化是否对ACC具有区域特异性，我们测试了ACC和运动皮层中PPF第V层的比率。结果表明，ACC第V层的PPF比率没有差异（神经门控组：n个=15/4只小鼠；对照组：n个=9个神经元/5只小鼠；双向方差分析，第页> 0.05) (图1C类)或在运动皮层中(n个=5）和控制(n个=5，双向方差分析，第页> 0.05) (图1D类)组。这些结果表明，神经损伤后，兴奋性突触传递的突触前增强选择性地发生在ACC的II/III层。

突触前递质释放概率增强

为了进一步确定周围神经损伤后ACC中PPF的降低是否可归因于突触前递质释放概率的增加，我们记录了在0.5μ米河豚毒素。周围神经损伤后，ACC神经元的mEPSC频率较对照组明显增加（对照组：0.9±0.1 Hz，n个=9个神经元/5只小鼠；神经结扎：2.3±0.5 Hz，n个=13个神经元/5只小鼠；第页< 0.05) (图2B类,C类). 此外，两组间mEPSCs振幅存在显著差异（对照组：11.2±0.8 pA，n个=9个神经元/5只小鼠；神经结扎：14.1±0.5 pA，n个=13个神经元/5只小鼠；第页< 0.01) (图2B类,C类).

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周围神经结扎后小鼠ACC中记录到mEPSCs。A类，在控制小鼠（左侧）和神经结扎小鼠（右侧）的ACC神经元切片中记录到具有代表性的mEPSCs，保持电位为−70 mV。B类，在对照小鼠的切片中记录的mEPSC的累积事件间隔（左）和振幅（右）直方图（开放圆圈；n个=9个神经元）和神经结扎小鼠（填满圆圈；n个=13个神经元）。C类mEPSC数据的汇总图。mEPSC参数的平均值：平均峰值频率（左）和振幅（右）*第页< 0.05; **第页< 0.01.

我们进一步测试了不可逆NMDA受体阻滞剂（+）-5-甲基-10,11-二氢-5的阻断率H（H）-二苯并[一,d日]环庚烯-5,10-马来酸亚胺（MK-801），用于对照小鼠和神经性疼痛小鼠。使用MK-801对NMDA受体介导的突触电流的阻断率来估计递质释放概率(Hessler等人，1993年;Weisskopf和Nicoll，1995年). 在保持电位为−10 mV时，在CNQX（20μ米)和苦毒毒素（100μ米)0.1 Hz。MK-801（35μ米)在获得稳定的NMDA受体介导的EPSC后进行灌注。我们的结果表明，MK-801逐步阻断NMDA受体介导的EPSCs，并在25分钟内完全抑制电流(图3A类,B类). MK-801在患有神经病理性疼痛的小鼠中对NMDA受体介导的EPSC的抑制作用的阻断率显著快于对照小鼠(图3A类,B类). 我们测试了在MK-801存在下NMDA受体介导的EPSCs峰值振幅衰减到初始值50%所需的时间。神经结扎小鼠的衰变时间明显加快（5.8±0.5 min；n个=8个神经元/6只小鼠）比对照小鼠（7.5±0.6 min；n个=7个神经元/2只小鼠；第页< 0.05) (图3C类). 总之，这些结果表明，神经损伤后ACC兴奋性突触传递增强归因于突触前神经递质释放概率增加和突触后反应性增加。

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在神经结扎小鼠中快速阻断NMDA受体介导的EPSCs的MK-801。A类在MK-801（35μ米)在对照组和神经型小鼠中。B类，MK-801阻断NMDA受体介导的EPSCs在对照小鼠和神经结扎小鼠中的时间进程图。打开圆圈，来自控制老鼠(n个=7个神经元）；神经结扎小鼠的填充圆圈(n个=8个神经元）。C类个体和统计数据显示，在MK-801存在下，NMDA受体介导的EPSC峰值振幅降低至初始值的50%所需的衰减时间。在神经结扎小鼠中观察到明显更快的时间(n个=8个神经元）与对照小鼠相比(n个=7个神经元）*第页<0.05。

GluR1调制

AMPA受体是由GluR1、GluR2、GluR3和GluR4亚基组装而成的异源多聚体(Sommer等人，1991年;霍尔曼和海涅曼，1994年). 为了进一步确定AMPA受体在神经损伤后ACC突触传递增强中的作用，我们检测了中枢突触AMPA受体的主要亚单位GluR1和GluR2/3的表达水平(Geiger等人，1995年;Lambolez等人，1996年)神经损伤后。通过Western blot，我们发现对照组小鼠和神经结扎组小鼠ACC中GluR1和GluR2/3受体的表达水平没有差异(第页> 0.05;n个= 6) (图4A类,B类). 这些结果表明，神经损伤并未改变AMPA受体GluR1和GluR2/3亚单位的总蛋白表达水平，ACC突触传递增强可能不是由AMPA受体总蛋白水平的变化引起的。

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神经损伤后ACC中GluR1磷酸化和AMPA受体介导电流校正指数发生改变。A类Western blot检测对照组和神经型小鼠ACC中GluR1的代表性表达以及GluR1和GluR2/3的磷酸化。B类，汇集的数据显示，在进行神经结扎的小鼠中，GluR1的磷酸化上调。C类在对照组和神经门控组的一个ACC神经元上分别记录了在−65、−5和+35 mV保持电位下诱发的AMPA受体介导的突触后电流的典型痕迹。AMPA受体介导的峰值电流整流的汇集数据显示出显著差异(*第页< 0.05). 开放条，来自对照小鼠的神经元(n个=12个神经元）；填充棒，神经结扎小鼠的神经元(n个=18个神经元）。整流指数=（−65 mV保持电位下的振幅）/（+35 mV保持电压下的振幅。D类，平均值I–V型对照组和神经型小鼠ACC神经元AMPA EPSCs曲线*第页< 0.05; **第页< 0.01.

AMPA受体GluR1亚单位的磷酸化对受体的突触表达、通道特性和突触可塑性至关重要(Esteban等人，2003年;Lee等人，2003年;Vanhoose等人，2006年). 接下来，我们测试了神经结扎小鼠ACC中PKA磷酸化位点（Ser 845）GluR1亚基的磷酸化水平。我们发现神经损伤后ACC中GluR1的磷酸化水平显著升高（1.79±0.12倍于对照值；第页< 0.01;n个=6只小鼠）(图4A类,B类). 数据表明，神经损伤可通过PKA信号通路增加GluR1的磷酸化水平。

GluR1介导的精馏

不含GluR2的AMPA受体是Ca2+渗透性和向内矫正(Geiger等人，1995年;顾等人，1996年;Washburn等人，1997年). 通过多胺的电压依赖性封锁实现向内整流(Washburn和Dingledine，1996年). 我们试图通过增加细胞内多胺浓度来加强内向纠正。为了确定神经损伤后ACC神经元中AMPA受体亚单位组成的改变是否导致其具有内向整流特性，我们检测了ACC神经元在−65、−5和+35 mV的保持电位下诱发的AMPA受体介导的EPSCs。我们发现，对照组与对照组在纠正AMPA受体介导的ACC传输方面存在显著差异(n个=12个神经元/5只小鼠）和神经门控(n个=18个神经元/6只小鼠；t吨测试，第页< 0.05) (图4C类)老鼠。一致地，当平均电流-电压(I–V型)绘制了两者之间的关系，在神经损伤小鼠的ACC神经元中发现了较少的内向电流(n个=18个神经元/6只小鼠）与对照小鼠相比(n个=12个神经元/5只小鼠）(图4D类). 这些结果表明，ACC神经元中的AMPA受体在神经病理性疼痛中具有内向整流特性。

膜GluR1表达

AMPA受体亚单位的转运被认为有助于痛觉过敏的突触可塑性(伍尔夫和索尔特，2000年). 据报道，疼痛刺激可以将AMPA受体GluR1亚单位募集到腰椎脊髓的神经元质膜上(Galan等人，2004年). 接下来我们研究了神经结扎后ACC中AMPA受体亚单位的分布。我们发现神经结扎引起的神经病理性疼痛与膜部分中GluR1亚单位丰度的增加和细胞溶质部分中相应水平的降低有关(第页与对照组相比，<0.05；n个=4只小鼠）(图5A类). 相反，神经结扎对ACC神经元中GluR2/3亚单位的细胞内分布没有影响(第页>0.05，与对照组比较；n个=4只小鼠）(图5B类). 数据表明，由于神经损伤，AMPA受体GluR1亚单位在ACC神经元中重新分布。

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神经损伤后ACC神经元AMPA受体GluR1亚单位的重新分布。A类，GluR1亚单位在ACC神经元膜和胞浆部分的亚细胞分布。神经损伤后，膜部分GluR1亚单位的丰度增加，而细胞溶质部分相应减少。B类神经损伤对ACC神经元中GluR2/3亚单位的亚细胞分布没有影响。神经结扎后1周制备细胞膜和细胞溶质部分*第页< 0.05;n个每组4只小鼠。C类，双侧微量注射CNQX（1 m米)在ACC中减少了机械性超敏反应(n个=6只小鼠）。D类，微量注射CNQX不会影响对照小鼠50%的缩爪阈值(n个=3只小鼠）。

ACC AMPA受体与痛觉超敏

我们已经证明，周围神经损伤导致GluR1和AMPA受体介导的突触传递在ACC中的分布增加。为了直接解决AMPA受体在神经病理性疼痛中的关键作用，我们接下来进行了ACC内输注CNQX（1 m）的实验米)一种非NMDA受体拮抗剂，用于神经损伤后的小鼠，然后测试痛觉超敏。在术后第1、3、5和6天测试机械性超敏反应。第6天，向小鼠微量注射CNQX(n个= 6) (图5C类). 我们发现，双侧微量注射CNQX可显著降低对侧和同侧的痛觉超敏，注射后2小时测试时，CNQX的作用消失(n个= 6) (图5C类). 作为对照，我们发现，在未进行神经结扎的小鼠的ACC中微量注射CNQX时，CNQX不会影响50%的爪-带牵引阈值(n个=3只小鼠；第页>与基线反应相比为0.05）。

AC1在突触前改变中的作用

我们之前已经证明AC1对慢性疼痛至关重要。例如，在AC1型−/−炎症性疼痛和神经病理性疼痛模型中发现慢性疼痛敏感性降低(Wei等人，2002年). 我们想知道AC1是否也参与了当前神经病理性疼痛模型中的行为和突触变化。我们发现同侧的机械性痛觉超敏反应显著降低(第页< 0.05;n个=4只小鼠）(图6A类)和对侧(第页< 0.05;n个=4只小鼠）(图6A类)敲除小鼠的神经损伤侧。此外，神经损伤后AC1型−/−在神经损伤后，野生型小鼠（对照组）没有表现出AMPA受体介导的EPSCs的PPF降低AC1型−/−,n个=7个神经元；AC1型−/−神经结扎小鼠，n个=9个神经元；第页> 0.05) (图6B类). 然后我们测试了mEPSCs的频率和振幅AC1型−/−小鼠神经损伤后。尽管野生型小鼠在神经损伤后ACC神经元中mEPSC的频率和振幅持续增加，但在AC1型−/−小鼠[频率AC1型−/−对照组小鼠：1.5±0.3 Hz，n个=5个神经元/2只小鼠；频率inAC1型−/−神经结扎小鼠：1.9±0.5 Hz，n个=11个神经元/4只小鼠；第页> 0.05 (图6C类,D类); 振幅inAC1型−/−对照组小鼠：16.9±0.5 pA，n个=5个神经元/2只小鼠；AC1型−/−神经结扎小鼠的振幅为15.4±1.7pA，n个=11个神经元/4只小鼠；第页> 0.05 (图6C类,D类)]. 这些结果表明，在神经性疼痛中，ACC兴奋性突触传递的突触前和突触后增强都依赖于AC1。

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配对脉冲对大鼠ACC神经元的促进作用AC1型−/−神经结扎小鼠。A类，减少机械性超敏反应AC1型−/−神经结扎小鼠(n个=4只小鼠）*第页<0.05。B类，野生型小鼠神经损伤后AMPA受体介导的EPSCs的PPF降低在AC1型−/−小鼠神经损伤后**第页< 0.01. 插图，ACC中记录的间隔为50 ms的PPF代表记录道。C类，在ACC神经元中记录的mEPSCs来自AC1型−/−神经结扎小鼠。图中所示为ACC神经元中记录的典型mEPSCsAC1型−/−控制小鼠（左）和神经损伤小鼠（右）的保持电位为-70 mV。D类mEPSC数据的汇总图。显示了mEPSC参数的平均值。所示为平均峰值频率（顶部）和振幅（底部）AC1型−/−对照小鼠(n个=5个神经元）和AC1型−/−神经结扎小鼠(n个=11个神经元；第页> 0.05).

AC1在突触后变化中的作用

接下来，对对照组和神经组的ACC进行GluR1和GluR2/3蛋白基础水平的Western blot分析AC1型−/−老鼠。我们发现GluR1和GluR2/3在ACC中的表达没有改变AC1型−/−小鼠与野生型小鼠的比较(第页>0.05；n个=4只小鼠）(图7A类). 数据表明交流1没有影响AMPA受体在ACC中的表达。然后我们测试了ACC中GluR1亚单位的磷酸化水平AC1型−/−神经性疼痛小鼠。我们发现磷酸化GluR1的基础水平在AC1型−/−小鼠与野生型小鼠的比较。然而，神经损伤诱导的GluR1磷酸化水平的增加在ACC中被阻断AC1型−/−小鼠与野生型小鼠相比（增加1.06±0.08倍AC1型−/−小鼠比野生型小鼠增加1.76±0.10倍；第页< 0.01;n个=4只小鼠）(图7B类). 这些结果表明AC1型没有改变磷酸化的GluR1的基础水平，AC1参与神经病理性疼痛期间ACC中GluR1受体的磷酸化。

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大鼠ACC神经元GluR1的表达及AMPA受体介导电流的校正指数AC1型−/−神经结扎小鼠。A类，野生型和野生型ACC中GluR1和GluR2/3的代表性Western blot交流1−/−神经结扎小鼠。B类、代表性Western blot和野生型小鼠ACC中Ser845处GluR1磷酸化的相应定量(n个=6），神经结扎野生型小鼠(n个= 6),AC1型−/−对照小鼠(n个=4），以及AC1型−/−神经结扎小鼠(n个= 4). 神经损伤后ACC中GluR1的磷酸化水平显著升高(**第页< 0.01;n个=6）在野生型小鼠中。神经损伤引起的GluR1磷酸化水平的增加在ACC中被阻断AC1型−/−小鼠与野生型小鼠的比较(##第页< 0.01;n个= 4).C类ACC中AMPA受体介导电流整流指数的代表性跟踪和汇总数据AC1型−/−控制和AC1型−/−神经结扎小鼠。

此外，我们还检测了ACC中AMPA受体的纠正AC1型−/−移液管中含有内精胺的小鼠，保持电位为−65、−5和+35 mVAC1型−/−控制(n个=7个神经元）和AC1型−/−神经结扎小鼠(n个=9个神经元）（双向方差分析，第页> 0.05) (图7C类). 这一结果表明，ACC神经元突触后GluR1的组成没有改变AC1型−/−神经病理性疼痛小鼠。总之，这些结果表明，突触前和突触后AC1可能在调节慢性神经损伤后ACC兴奋性突触传递增加方面发挥关键作用。

讨论

本研究基于我们之前的两项观察结果。首先，外周损伤会触发ACC的可塑性变化，包括一系列依赖活动的即时早期基因，并增强突触反应(Wei等人，1999年;Wu等人，2005年;Zhuo，2007年). 在神经损伤的情况下，尚未对ACC的突触前和突触后机制进行鉴定(Wu等人，2005年;Zhao等人，2006年). 其次，钙刺激的两种主要形式的AC1和AC8对动物模型中的慢性疼痛（包括神经病理性疼痛）至关重要(Wei等人，2002年;Vadakkan等人，2006年). 据我们所知，没有选择性或相对选择性AC1抑制剂的报道。因此，我们目前的研究结果为神经损伤后ACC中神经元可塑性变化的突触机制提供了证据，即突触前谷氨酸释放概率的增强，以及突触后AMPA受体介导的反应的增强。

LTP和慢性疼痛的突触前和突触后变化

突触前和突触后的变化都被发现与LTP有关(Malgaroli和Tsien，1992年;Bolshakov和Siegelbaum，1995年;尼科尔和马伦卡，1995年;坎德尔，2001年;马利诺和马伦卡，2002年;Nicoll和Schmitz，2005年). 根据大脑的中心区域和实验条件，谷氨酸释放的突触前增强或AMPA受体介导的反应的突触后增强可能是LTP表达的原因。例如，据报道，在海马CA3区，LTP在突触前表达，需要AC1的活性(Nicoll和Schmitz，2005年). 在海马CA1区，LTP的突触前和突触后机制一直备受争议，包括突触后AMPA受体的运输和插入，在某些情况下可能还需要逆行信使（见上文综述）。海马和海马相关的边缘结构被认为对空间学习和记忆至关重要(坎德尔，2001年). 与海马体不同，ACC对情感认知功能至关重要，包括决策、跟踪记忆、注意力和持续疼痛(卓，2007). ACC LTP可由不同的诱导方案诱导。我们最近的药理学和遗传学方法发现AMPA-GluR1受体对LTP的表达至关重要(丰田章男等人，2007年). 在本研究中，在神经病理性疼痛小鼠的ACC切片中，我们发现突触前和突触后谷氨酸的传递都在经历长期增强。损伤后观察到三种不同方法评估的突触前增强，表明突触前谷氨酸释放增强。在突触后部位，电生理和生化数据均表明AMPA受体GluR1介导的反应增强。虽然我们的研究不能得出GluR1受体可能插入的任何结论，但电生理数据确实表明了这种可能性。因此，我们的结果为ACC突触前和突触后的疼痛增强提供了证据，正常脑片中刺激诱导的LTP可用于模拟或模拟损伤诱导变化的突触后机制(Zhao等人，2005年).

钙刺激AC1在突触可塑性和疼痛中的作用

先前的研究表明AC1 mRNA在ACC中高度表达，AC1参与神经损伤和炎症的行为伤害性反应(Wei等人，2002年). 在缺乏AC1的小鼠中，我们发现慢性疼痛（包括神经病理性疼痛和炎症相关的超敏反应）显著减轻，而对有害的热或机械刺激的急性疼痛保持不变(Wei等人，2002年). 这些结果表明AC1选择性参与持续或慢性疼痛。在神经元中，有人提出AC1偶联NMDA受体诱导的胞浆Ca2+cAMP信号通路升高(切特科维奇和斯威特，1993年;Wong等人，1999年). 因为NMDA受体的激活有助于持续/慢性疼痛(Wu等人，2005年)，AC1可能从NMDA受体下游起作用，从而导致慢性疼痛(卓，2008). 其分子机制可能涉及AC1激活后PKA通路的激活，以及随后的磷酸化和GluR1向膜的募集。海马中也有类似的GluR1转运机制的报道(Lee等人，2003年;Derkach等人，2007年). 因此，ACC中的AC1是一种有吸引力的候选者，用于启动GluR1运输和慢性疼痛。

在本研究中，我们发现在AC1基因敲除小鼠中，AMPA受体介导的反应的突触前增强和突触后改变均被阻断，这表明AC1可能在突触前和突触后都参与ACC损伤诱导的可塑性变化，AC1的刺激对苔藓纤维LTP至关重要(Bolshakov等人，1997年;Villacres等人，1998年). 因为在AC1基因敲除小鼠中，突触的基本属性不受影响，包括配对脉冲易化、AMPA受体介导的反应和NMDA受体介导反应，我们认为AC1的参与是活动依赖性的，而不是其他非选择性的副作用。除皮质区外，AC1也可能参与脊髓可塑性。在以前的研究中，我们已经证明AC1基因缺失抑制配对训练方案诱导的脊髓LTP和福斯科林和5-羟色胺联合应用诱导的突触易化(王和卓，2002;Wei等人，2006年). 考虑到越来越多的证据表明脊髓LTP和慢性疼痛的下降易化性，可以想象脊髓AC1机制也可能导致痛觉超敏。

脚注

这项工作得到了EJLB-加拿大卫生研究院（CIHR）神经科学和心理健康主席迈克尔·史密斯（Michael Smith）、加拿大研究院主席、CIHR拨款CIHR84256和CIHR66975以及国立卫生研究院-国家神经疾病和中风研究所（National Institute of Health）NS42722对M.Z的拨款支持。L.-J.W.得到了加拿大CIHR和脆弱X基金会博士后研究金的支持。我们还要感谢Louis Muglia博士和Daniel R.Storm博士提供的AC1型−/−老鼠。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会