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EMBO J。2000年5月15日；19(10): 2181–2192.
数字对象标识：10.1093/emboj/19.10.2181
预防性维修识别码：项目经理384367
PMID：10811609

哺乳动物Ufd1和Npl4的复合物将AAA-ATP酶p97连接到泛素和核转运途径

海姆·H·迈耶,1 詹姆斯·G·肖特,1 约阿希姆·西曼,1 达里尔·帕平,2和格雷厄姆·沃伦1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

AAA-ATP酶p97/Cdc48p参与了从膜融合到泛素依赖性蛋白降解的许多不同途径。p47复合物的结合引导p97在高尔基体膜有丝分裂后融合中发挥作用。我们现在描述另一种包含哺乳动物Ufd1和Npl4的结合复合物。酵母菌Ufd1p是泛素依赖性蛋白质降解所必需的，而酵母菌Npl4p与核转运有关。在大鼠肝细胞液中，Ufd1和Npl4形成二元复合物，它们要么单独存在，要么与p97结合。Ufd1/Npl4与p47竞争结合p97，因此抑制高尔基体膜融合。这表明它参与了p97催化的另一种细胞功能，最有可能是有丝分裂期间的泛素依赖性事件。事实上，p47和Ufd1/Npl4的结合是互斥的，这表明这些蛋白复合物作为适配器，将基本的p97活性导向不同的细胞途径。

关键词：AAA-ATP酶/CDC48/DiGeorge/泛素/UFD1L

介绍

顾名思义，AAA家族的蛋白质（与不同细胞活动相关的ATP酶）参与了大量的细胞过程，包括膜融合、细胞器生物生成、蛋白质降解和细胞周期调控（综述于Patel和Latterich，1998年). 它们的特征是由230-250个氨基酸的保守序列定义的共同基序。它包括对ATP结合和水解很重要的Walker A型和B型盒，以及AAA蛋白特有的其他相似区域。

一种广泛研究的AAA-ATP酶是哺乳动物p97（最初称为VCP，用于含缬氨酸的蛋白质；科勒和布朗斯坦，1987年)及其在酿酒酵母（Cdc48p）(Moir等人，1982年) (Fröhlich等人，1991年),非洲爪蟾(Peters等人，1990年),嗜酸热浆菌（增值税）(Pamnani等人，1997年)以及许多其他生物（见Patel和Latterich，1998年). 一些证据表明p97/Cdc48p参与了多种细胞过程。其基因最初在酵母中被鉴定为细胞分裂周期（CDC）突变，导致有丝分裂停滞，有大量的芽细胞和跨越母子连接的细长细胞核(Moir等人，1982年). 在生化水平上，它被认为在同型膜融合事件中起作用，包括酵母内质网的融合(Latterich等人，1995年)哺乳动物高尔基池由有丝分裂细胞溶质产生的碎片重组而成(Rabouille等人，1995年)或特定药物(Acharya等人，1995年). 另一系列证据表明p97/Cdc48p与泛素依赖性蛋白降解有关。在酵母中，已经证明Cdc48p是降解泛素融合报告蛋白所必需的(Ghislain等人，1996年)，它首先用于识别一种涉及其他几个基因的泛素依赖性降解途径（UFD1），称为UFD1到UFD5(约翰逊等人，1995年). 据报道，在哺乳动物细胞中，p97参与IκBα的降解，并与蛋白酶体共纯化。这导致了人们猜测p97在泛素化步骤和蛋白酶体最终降解蛋白质之间提供了联系(Dai等人，1998年).

p97/Cdc48p的显著功能多样性很可能是由于在广泛的细胞过程中部署了一种基本活性。这种基本活动可能是蛋白质的去折叠或蛋白质复合物的分解(Patel和Latterich，1998年). p97/Cdc48p是一种II型AAA-ATP酶，具有两个结合ATP的AAA结构域D1和D2，以及一个N末端（N）结构域。它形成了一个六边形的桶形结构(Peters等人，1992年)有点像细菌GroEL chaparonin(Xu等人，1997年). 最近，研究表明，真核生物p97/Cdc48p的古老同源物VAT不仅能够折叠，而且能够打开模型底物在体外以依赖于ATP的方式(Golbik等人，1999年). 此外，N-结构域足以重新折叠不依赖于任何ATP酶活性的允许底物。有趣的是，这个结构域形成了一个凹槽，可以用来结合底物肽(Coles等人，1999年). NSF（NEM-sensitive factor，NEM敏感因子）也表现出了展开活性，NSF是另一种参与膜融合的AAA-ATP酶，其结构与p97相似(Whiteheart等人，1994年;Hanson等人，1997年). 它解开了高度稳定的SNARE复合体(Söllner等人，1993年)，一种也被提出用于p97的机制(Rabouille等人，1998年).

如果p97提供了一种未折叠酶或分解活性，那么问题就在于如何实现底物特异性以及该活性在膜融合和蛋白质降解等多种途径中的补充。在有丝分裂高尔基体片段的融合中，p47将p97连接到其底物t-SNARE，syntaxin 5上，然后人们认为它会展开(拉布耶等., 1998). 因此，p47可以被视为p97的膜融合特异性适配器。然后，替代适配器可以解释p97在其他展开事件中的作用。在酵母中，已经鉴定出Cdc48p的另外两种物理相互作用蛋白，它们都参与UFD途径(约翰逊等., 1995)因此，它们是潜在的因素，可以指导Cdc48p在泛素依赖性降解中发挥作用。第一个是E4多泛素化因子Ufd2p(Koegl公司等., 1999)第二种是Ufd3p，一种生化功能未知的蛋白质(吉斯兰等., 1996). 然而，尚不清楚哺乳动物中是否存在这些复合物，以及它们的结构是否与p97/p47复合物相似。此外，还不清楚p97是否像上述适配器假设所要求的那样以互斥的方式与这些蛋白质结合。

在这里，我们介绍了由Ufd1和Npl4组成的复合物的鉴定和表征。我们证明Ufd1/Npl4复合物以与p47互斥的方式与p97结合。我们提出了一个模型，其中p47和Ufd1/Npl4代表将p97引导到不同路径的替代适配器模块，并帮助解释其功能多样性。随着Ufd1/Npl4复合物的鉴定，我们还揭示了泛素化和核转运过程之间的联系。

结果

大鼠肝细胞液中p97结合蛋白的分离

细胞溶胶p97在凝胶过滤柱上迁移M（M）第页600–800 kDa，比纯化蛋白大约150 kDa(Kondo等人，1997年). 这种差异表明p97与其他细胞溶质蛋白结合，我们能够将同三聚体p47识别为结合伙伴之一(Kondo等人，1997年). 为了鉴定其他成分，我们从含有p97复合物的胞浆中分离出高分子量部分，并用高盐处理该部分以释放结合蛋白。在添加固定化重组p97并降低盐浓度后，我们推断释放的蛋白质现在会与固定化p97结合，然后通过进一步的盐处理将其洗脱出来。

使用重组His标记的p97制备固定化p97（图​（图1A，1A、 车道1）。重组p97在结构和功能上与内源性p97相同。通过凝胶过滤和阴性染色，它是六聚物（数据未显示），它催化了高尔基体池从有丝分裂的高尔基体碎片再生（见下文）。将其生物素化后固定到链霉亲和素珠上。大鼠肝细胞溶质（RLC，图​图1A，1A、 泳道2）在Superose 6柱上进行凝胶过滤，并将高分子量组分（HMWF，图​图1A，1A、 收集到含有内源性p97的lane 3）。用750 mM KCl处理该部分以释放与内源性p97结合的蛋白质，然后添加固定化重组p97。然后通过将KCl浓度降至200 mM将结合蛋白转移到固定化p97。然后清洗p97珠，用1 M KCl洗脱结合蛋白并沉淀TCA（图​（图1A，1A、 车道5）。使用链霉亲和素珠作为对照进行相同的程序（图​（图1A，1A、 车道4）。五种主要蛋白质始终从p97微球中洗脱，但没有从对照微球中洗提。它们的表观分子量为130、97、67、47和42 kDa。此外，在M（M）第页可以观察到71 kDa（图中的星号​图1A，1A、 车道5）。将这些条带切除并进行胰蛋白酶消化，然后进行质谱分析。

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图1。用His标记的p97亲和纯化细胞溶质结合蛋白。(一个)考马斯蓝染色凝胶（CBB）的纯化步骤。将重组His-tagged p97（1巷1微克）生物素化并固定在链霉亲和素珠上。通过凝胶过滤分离大鼠肝细胞液（RLC，通道2中10µg）。对含有p97峰的高分子量部分（HMWF，第3通道中10µg）进行盐处理，以分离与内源性p97结合的蛋白质，然后单独与固定化His-p97或链霉亲和素珠培养。降低盐浓度以允许与固定化p97结合后，用盐洗脱结合蛋白，TCA沉淀并使用10%SDS-PAGE进行分离（通道4和5）。所示的谱带被切除并通过质谱分析。鉴定出的蛋白有：p97、p47、Ufd1（42 kDa）、Ufd2（130 kDa”）和一个与酵母Npl4p高度同源的67 kDa蛋白。详见正文。(B类)通过免疫印迹（IB）鉴定p97结合蛋白。如（A）所述，对10微克RLC、5微克HMWF和5%洗脱液进行SDS-PAGE。将蛋白质转移到硝化纤维素中，并与针对p97、p47的抗体以及针对Ufd1和Npl4产生的抗体一起孵育（见图​图3）。三). 抗Npl4抗体识别67和71kDa的双联体[（a）中的星号]。

正如预期的那样，47和97 kDa蛋白分别是p47和p97，后者要么是内源性p97，要么是从色谱柱中洗去的重组p97。对130 kDa带的胰蛋白酶肽进行测序，得到一个与Ufd2（DDBJ/EMBL/GenBank登录号：。AAD02233型)，酵母Ufd2p的人类同源物，参与UFD泛素化途径（参见引言）。酵母Ufd2p与Cdc48p相互作用(科格尔等., 1999). 因此，我们得出结论，Ufd2在哺乳动物中也与p97相互作用。42 kDa蛋白的胰蛋白酶肽模式与酵母Ufd1p的小鼠同源物Ufd1相匹配，再次参与UFD途径。其小鼠和人类同源物已被克隆，与先天性发育障碍DiGeorge综合征有关(皮祖蒂等., 1997).

67kDa蛋白质的肽模式与数据库中的任何已知蛋白质都不匹配。然而，其中一个肽的氨基酸序列与小鼠的两个EST序列相匹配（参见材料和方法），与酵母Npl4p高度同源，而酵母Npl4是一种已知的核膜完整性和核转运所需的蛋白质(DeHoratius和Silver，1996年). 由于Ufd1和Npl4这两种蛋白质或其同源物之前均未与p97或Cdc48p相互作用，因此我们决定详细研究这种相互作用。

大鼠Npl4高度保守，广泛表达，含有RanBP2锌指

为了克隆67kDa蛋白，设计了引物，从大鼠肝脏cDNA文库中扩增DNA片段，该文库表示使用肽1鉴定的EST序列。然后使用扩增产物筛选大鼠肝脏λgt11 cDNA文库。分离出四个克隆，其中一个长4.5kb，编码大鼠Npl4的整个开放阅读框。整个编码区的序列和推导出的氨基酸序列如图所示​图2A：。2A.在序列或质量上与质谱分析数据相匹配的肽分别用阴影或下划线表示。氨基酸序列与Npl4p高度同源酿酒酵母（33%相似性，37%一致性），但除此之外，C端还包含一个锌指（如图所示​图2A）2A） 在酵母Npl4p中未发现。然而秀丽隐杆线虫编码NPL4同源物的基因F59E12.5包含相同的锌指（图​（图2B）。2B） ●●●●。该基序在Prosite数据库（PS50199）中被归类为RanBP2锌指。它与RanBP2和Nup153的锌指具有同源性（图​（图2C），2C） ，核孔蛋白，可以通过这个基序结合RanGDP(Nakielny等人，1999年;Yaseen和Blobel，1999年). 多组织mRNA的Northern印迹分析显示，大鼠Npl4在所有组织中以4.5kb的单个mRNA普遍表达，尽管表达水平不同（数据未显示）。

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图2。大鼠Npl4序列。(一个)大鼠Npl4的核苷酸和预测氨基酸序列。通过67kDa带的质谱分析鉴定肽1（装箱和阴影），并匹配与酵母Npl4高度同源的两个小鼠EST克隆。EST序列用于筛选大鼠肝脏λgt11 cDNA文库，以分离此处显示的全长大鼠Npl4克隆。显示了与从67 kDa带获得的数据序列（阴影）或质量（下划线）匹配的肽。锌手指图案已装箱（见正文）。(B类)大鼠Npl4（Rat）与酵母（S.cer）Npl4p和线虫（C.eleg.）基因F59E12.5贯穿整个序列（33%和37%的同源性，分别为38%和29%的相似性），但只有大鼠和线虫序列包含锌指（ZF）。(C类)大鼠Npl4和Npl4同源锌指的对齐线虫F59E12.5与RanBP2和Nup153的值。

重组Npl4和Ufd1的表达及抗体的制备

哺乳动物Ufd1和Npl4在细菌中表达为GST和His标记的融合蛋白，然后用于生产和亲和纯化多克隆抗体。抗Npl4抗体在67 kDa时识别RLC和HMWF中的主要带（图​（图3，三以及71 kDa的次要频带。在用即时变性裂解缓冲液制备的组织培养细胞裂解液中也观察到了同样的双重性（数据未显示），这使得蛋白水解不太可能是原因。用抗Npl4抗体对这两种蛋白质进行免疫分离，然后进行质谱分析，发现重叠的胰蛋白酶肽模式。因此，71-kDa蛋白很可能代表细胞质中Npl4的另一种形式。

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图3。重组Npl4和Ufd1的表达及抗体的产生。大鼠Npl4和小鼠Ufd1均表达为GST融合蛋白和His标记蛋白。在兔子体内培养抗GST融合蛋白的抗体，并使用His标记抗原纯化亲和力。使用SDS-PAGE对RLC（10µg，第1和第4道）、HMWF（10μg，第2和第5道）、His-Npl4（20 ng，第3道）和His-Ufd1（20 ng、第6道）进行分离，并使用抗Npl4抗体（第1-3道）和抗Ufd1抗体（第4-6道）探测印迹。抗-Npl4识别RLC和HMWF中67和71 kDa的双链。Anti-Ufd1识别42 kDa的单个带。由于His-tag和His-Ufd1组分含有蛋白水解降解产物，这两种重组蛋白略大于内源性蛋白。

针对Ufd1的抗体在RLC和HMWF中识别出42 kDa的单一带（图​（图3，三，通道4和5），大于根据氨基酸序列推算出的34.5 kDa。由于His标签（第3道和第6道），两种重组蛋白都略大于内源性蛋白。这两种抗体用于确认在最初的亲和纯化中从固定化p97中洗脱出来的Npl4和Ufd1的身份（图​（图11B） ●●●●。

p97、Npl4和Ufd1形成三元络合物

使用p97珠对哺乳动物Npl4和Ufd1进行亲和分离并没有揭示这些蛋白是否直接或间接与p97相互作用。为了解决这个问题，对纯化的成分进行了结合实验，其中一个蛋白质通过特定标签被取下，并对结合的蛋白质进行了分析（图​（图4A–C）。4A–C）。生物素化p97固定在链霉亲和素珠上，将Ufd1拉下（图​（图4A），4A） ，但只有很少或没有Npl4。Npl4仅在存在Ufd1时与p97结合。同样，镍珠上的His-tagged Npl4也不能结合p97（图​（图4B）。4B） ●●●●。然而，His-Npl4约束GST–Ufd1，在GST–Ufd1存在的情况下，p97也约束。因此，当GST–Ufd1与p97或Npl4孵育并使用谷胱甘肽珠沉淀时，它独立地结合这两种蛋白质（图​（图4C）。4C） ●●●●。有趣的是，当p97和Npl4同时存在时，可以更有效地降低p97，这表明Npl4不仅与Ufd1结合，还增加了其与p97的亲和力。

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图4。p97、Npl4和Ufd1的配合物。（A–C）用纯化蛋白进行下拉实验，然后进行SDS–PAGE和考马斯蓝染色。左边的面板显示10%的输入，右边的面板显示下拉的材料。(一个)生物素化的His-p97与His-Npl4、His-Ufd1或His-Npl4/His-Ufd1孵育，并用链霉亲和素珠拉下。仅His-Npl4/His-Ufd1作为对照。(B类)将His-Npl4与GST–Ufd1、大鼠肝脏p97或GST–Ufd1和大鼠肝p97一起孵育，并用Ni-NTA珠将其拉下。GST–Ufd1和p97一起作为对照。(C类)GST-Ufd1与His-p97、His-Npl4或His-p97-His-Npl4一起孵育，并与谷胱甘肽珠一起拉下。GST单独与His-p97和His-Npl4作为对照。请注意，在His-Npl4存在的情况下，更多p97被拉下。(D类)用生物素化的p97或生物素化Npl4在覆盖层中探测p97结合蛋白的Far-Western blots。细胞溶质HMWF（5µg，通道2和7）和所示重组蛋白（通道3-5中50 ng，通道8-11中20 ng）通过SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素上，并覆盖生物素化p97（通道1-5）或生物素化Npl4（通道6-11）。结合探针使用链霉亲和素HRP进行可视化，然后进行化学发光。p97识别重组Npl4、Ufd1和p47，但仅识别来自胞浆的Npl4。重叠的Npl4结合HMWF中的内源性Ufd1和重组蛋白，但不结合p97、Npl4或p47。标记蛋白用作阴性对照（1号和6号通道、肌球蛋白、β-半乳糖苷酶、磷酸化酶b、血清白蛋白、卵清蛋白、碳酸酐酶，各100ng）。

在重叠探针HMWF和转移到过滤器上的纯化重组蛋白中，还通过生物素化p97和Npl4的远Western印迹检查结合情况（图​（图4D）。4D） ●●●●。与下拉实验的结果一致，覆盖层中的Npl4与细胞溶质和重组Ufd1（通道7和10）相互作用，但不能与p97（通道8）、p47（通道11）或自身（通道9）直接相互作用。当p97被用作覆盖层中的探针时，它与重组Ufd1和p47（通道4和5）发生了预期的相互作用。然而，这两种蛋白质与内源性、细胞溶质形式的反应非常微弱，只有在长时间接触后才可见（第2道）。相反，令人惊讶的是，p97与重组和胞质Npl4（通道2和3）的相互作用非常强烈。因此，Npl4含有p97的强结合位点，可在过滤器上变性的Npl4中获得，这表明Npl4在某些条件下也可以在溶液中直接与p97结合。

细胞溶胶有两个独立的复合物，包含Npl4和Ufd1

细胞质中的大多数（如果不是全部）p47与p97结合(Kondo等人，1997年). 为了确定Npl4和Ufd1是否存在这种情况，用p97抗体及其结合蛋白的免疫印迹法分析RLC凝胶过滤部分。如预期，Npl4、Ufd1和p47均与p97共分馏M（M）第页600–800 kDa（图​（图5A）。5A） ●●●●。然而，Npl4和Ufd1的分布是双相的，第二个峰值在～200 kDa，表明第二个复合物缺乏p97。Npl4和Ufd1在两种蛋白质的单体形式预期的后期组分中均未发现。为了研究这两种复合物，在低严格性条件下从两个峰部分免疫沉淀Ufd1，并通过考马斯亮蓝染色的SDS–PAGE凝胶和免疫印迹进行分析（图​（图5B）。5B） ●●●●。当从p97峰分数（分数12）中沉淀Ufd1时，可以分离出含有Ufd1、Npl4和p97的络合物（图​（图5B，5B、 车道4）。当从200 kDa峰值（分数15）沉淀时，只有Npl4与Ufd1（车道5）共沉淀，表明含有Npl4和Ufd1的独立络合物。当从总细胞溶质中沉淀时，所有三种蛋白质都存在，尽管相对数量反映了两种复合物都存在的事实（通道2）。如前所述，Npl4在这两种配合物中均表现为双峰。

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图5。细胞溶胶包含两个独立的络合物：二元Ufd1/Npl4和三元p97/Ufd1/Npl4络合物。(一个)在Superose 6柱上通过凝胶过滤分离大鼠肝细胞液（RLC）。通过SDS-PAGE和p97分离等分样品，并通过免疫印迹分析其结合蛋白。几乎所有的p47都与600–800 kDa的p97峰相结合。相比之下，Npl4和Ufd1同时出现双相分布，第一个峰值与p97共存，第二个峰值在～200kDa。(B类)从RLC凝胶过滤部分免疫沉淀Ufd1复合物。用单克隆抗Ufd1抗体对总RLC和（A）中鉴定的选定凝胶过滤部分进行低强度免疫沉淀。作为对照，使用非免疫小鼠IgG（第1道）从总RLC进行免疫沉淀，使用抗Ufd1（第7道）从缓冲液进行免疫沉淀。沉淀通过SDS-PAGE进行分析，然后使用特异性兔抗体进行考马斯蓝染色（CBB）或免疫印迹（IB）。Npl4和p97均与来自总RLC的Ufd1共免疫沉淀（车道2）。当从高分子量峰值（通道4）沉淀时，Ufd1同时降低Npl4和p97，而从200 kDa峰值（通道5）沉淀时仅结合Npl4。请注意，Ufd1并不是从馏分17（通道6）中沉淀出来的，此处预期会出现单体Ufd1。HC、IgG重链；LC，IgG轻链。

Ufd1/Npl4和p47在胞浆中竞争p97结合并形成替代复合物

由于p47和Ufd1/Npl4在胞浆中与p97形成稳定的复合物，我们想了解它们是否可以同时结合。进行了两种类型的实验。其中一个涉及使用特定抗体从胞浆中免疫沉淀所有三种结合蛋白，并通过免疫印迹分析共沉淀成分（图​（图6A）。6A） ●●●●。与之前的结果一致，抗Ufd1和抗Npl4抗体拉下了包含Ufd1、Npl4和p97的复合物，但没有拉下p47（第3和第4道）。当使用抗p47血清时，沉淀物中只能检测到p47和p97，而不能检测到Ufd1或Npl4（通道6）。因此，细胞溶胶p97包含至少两种替代络合物：p97/p47和p97/Ufd1/Npl4。

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图6。Ufd1/Npl4和p47在胞浆中竞争p97结合并形成替代复合物。(一个)RLC中p97复合物的免疫沉淀及其成分分析。使用纯化的IgG、纯化的Ufd1或Npl4抗体、免疫前血清（pre-）或抗p47血清对总RLC进行低强度免疫沉淀（IP）。使用SDS-PAGE对沉淀进行分级，然后使用抗p97、Npl4、Ufd1和p47的抗体进行免疫印迹（IB）分析。HMWF（5µg）作为参考加载（通道1）。注意，抗-Ufd1沉淀Npl4和p97，但不沉淀p47，而抗p47沉淀p97，但不沉淀Npl4或Ufd1。除了抗Npl4外，兔抗体用于IP，小鼠抗体用于免疫检测，这解释了高背景。(B类)使用纯化蛋白质的竞争实验。如图所示，在缺乏或存在更多替代结合伙伴（摩尔过量：0、1、5和25倍）的情况下，用p97培养GST–p47（通道1–12）或GST–Ufd1（带或不带Npl4（通道13–20））。GST融合蛋白用谷胱甘肽微球拉下，结合复合物用SDS-PAGE分析，然后用考马斯蓝染色。下部面板显示10%的输入，上部面板显示结合蛋白。注意每条车道上的p97下拉量。

第二种实验是竞争实验。GST–p47与p97在Ufd1、Ufd1/Npl4或Npl4单独增加的情况下孵育。同时，GST–Ufd1与p97在不存在或存在Npl4的情况下孵育，并增加p47的量作为竞争物。取下GST融合蛋白，并使用考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶分析沉淀物（图​（图6B）。6B） ●●●●。Ufd1单独与p47竞争绑定到p97（通道1-4），但在Npl4存在的情况下，它的绑定效率更高（通道5-8）。仅Npl4不影响p47与p97的结合（9–12车道）。相反，当使用GST–Ufd1时，p47可以非常有效地抑制Ufd1与p97的结合（13–16车道）。当Npl4存在时，效率降低（17–20车道）。Ufd1/Npl4对p97/p47形成的影响与p47对p97/Ufd1/Npl4形成的影响相同。我们得出结论，p47和Ufd1/Npl4复合物以相似的亲和力竞争p97结合。Ufd1足以绑定到p97，但当它与Npl4处于复合物中时，绑定会增强。

Ufd1/Npl4在p97介导的有丝分裂高尔基体膜融合中不起作用

p97介导的有丝分裂高尔基体碎片（MGFs）池再生对p47的需求已得到充分证实(近藤等., 1997). 由于Ufd1/Npl4与p97和p47形成类似的复合物，我们想知道它是否也能促进高尔基体膜融合。为了避免从大鼠肝细胞液中纯化p97的需要，我们在高尔基体重组试验中使用了细菌表达的p97。对比实验表明，重组蛋白具有功能性，其行为与内源性蛋白非常相似（数据未显示）。

通过与有丝分裂HeLa细胞液孵育，从大鼠肝高尔基体生成MGF。它们通过0.5 M蔗糖垫沉淀以去除内源性因子，并在37°C下与重组p97及其结合蛋白的不同组合孵育60分钟。对反应进行电子显微镜（EM）处理，并测定池再生量（图​（图7A）。7A） ●●●●。只有p97和p47的组合才能促进重组。p97与Ufd1和Ufd1/Npl4均无显著影响。Ufd1/Npl4和单独的蛋白质都没有。在相同条件下，当添加更多Ufd1或Ufd1/Npl4时，p97/p47存在时，池再生受到抑制（图​（图7B）。7B） ●●●●。这一观察结果最好解释为p97的两个蛋白复合物之间的竞争，只有p97/p47能够促进融合。与单独使用Ufd1相比，Ufd1/Npl4对p97的亲和力更强。因此，在这两种复合物中，只有p47可以引导p97介导膜融合。

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图7。Ufd1/Npl4在高尔基体膜融合中不作为p97辅因子发挥作用。(一个)通过0.5M蔗糖缓冲液分离的MGF与p97/p47、p97、p47、p97/Ufd1/Npl4、p97/Ufd1、Npl4或Ufd1在37°C下孵育60分钟。对EM进行孵育，并测定池中膜的百分比。结果以池再生百分比表示，其中0%表示开始的MGF，100%表示p97/p47的影响。数值代表平均值±SEM(n个= 3). (B类)在Ufd1单独或Ufd1/Npl4（超过p47的1、5、10和20摩尔过量）增加的情况下，将MGF与p97/p47如（A）所示孵育。

组织培养细胞中的亚细胞定位

使用几种细胞系和固定条件，通过免疫荧光显微镜在指数增长的组织培养细胞中测定Npl4、Ufd1和p97的亚细胞分布（图​（图8）。8). Npl4在BSC-1和NRK细胞中的染色模式相同（图​（图8A8A和B），大多数染色局限于细胞核。这与在中观察到的Npl4p的模式相同面包酵母(DeHoratius和Silver，1996年). 在使用两种单克隆抗体的相同细胞系中，Ufd1的染色模式非常相似（图​（图8C8C和D）和多克隆（数据未显示）抗体。

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图8。免疫荧光显微镜显示Npl4、Ufd1和p97的定位。猴BS-C-1细胞(一个,C类,E类和F类)和正常大鼠肾细胞(B类和D类)用亲和纯化的Npl4和p97抗体以及所示的Ufd1单克隆抗体进行染色。用多聚甲醛/甲醇（A、C、D和E）或甲醇（B和F）固定细胞。C和E是同一细胞中Ufd1和p97的双重染色。注意，p97的染色模式取决于固定方法（见正文）。

正如之前报道的那样，p97染色模式取决于固定条件(彼得斯等., 1990). 使用多聚甲醛（图​（图8E），8E） ，虽然胞质中染色较多，但其染色模式与Ufd1和Npl4相似。使用甲醇固定（图​（图8F），8F） 相对于细胞核，细胞质的染色增强，并具有内质网特有的网状结构，包括核膜。这些数据表明，Ufd1和Npl4主要局限于细胞核，而p97则存在于细胞质中。

讨论

为了了解p97在不同细胞途径中发挥作用的机制，我们开始分离结合蛋白及其在膜融合中的辅因子p47。我们想看看是否存在替代性结合复合体，它们负责将p97导向其他过程。我们利用p97与其他蛋白质结合的盐敏感性建立了一个纯化系统，分离出三种蛋白质，即Npl4、Ufd1和Ufd2。Npl4是哺乳动物中以前未知的蛋白质（见下文）。

详细研究了Npl4和Ufd1与p97的结合。重组蛋白的结合实验表明，Npl4和Ufd1自身形成二元复合物，可以结合p97形成三元复合物。在溶液中，Ufd1可以独立地结合Npl4和p97，而Npl4和p97在不存在Ufd1的情况下不结合。因此，Ufd1在p97/Ufd1/Npl4复合体中形成桥。然而，有两条证据表明，这种相互作用更为复杂。首先，在下拉实验中，Npl4增强了Ufd1对p97的亲和力。其次，Npl4含有一个与p97结合的位点，这只有在用p97探测过滤器上变性的Npl4时才在重叠分析中发现。一种可能性是Ufd1将p97和Npl4结合在一起，从而在Npl4上暴露p97的结合位点。

二元Ufd1/Npl4和三元p97/Ufd1/Npl4作为独立的络合物存在于细胞液中。这通过凝胶过滤、随后免疫印迹和Ufd1复合物的免疫沉淀来显示。与p47不同，Npl4和Ufd1呈双相分布。从600–800 kDa峰免疫沉淀的复合物含有p97/Ufd1/Npl4，在～200 kDa的复合物仅含有Ufd1/Npl4。研究Ufd1/Npl4与p97的结合是如何调控的，这将是一件有趣的事情，尤其是因为p47的细胞池似乎几乎完全与p97结合。已经进行了初步实验，以测量Ufd1与Npl4单独结合以及与p97结合的化学计量比。免疫沉淀复合物通过SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色。密度分析得出p97:Ufd1:Npl4的比率为6:3:3。需要进一步的生物物理测量来确认这一化学计量，但值得注意的是，这一比率与p97/p47（6:3；近藤等., 1997)，表明存在类似的结构组织。

Ufd1/Npl4和p47与细胞溶质p97形成相互排斥的复合物。针对Ufd1的抗体从胞浆中拉下Npl4和p97，但不拉下p47。针对p47的抗体可降低p97，但不会降低Ufd1或Npl4。重组蛋白实验表明，Ufd1可以取代p97中的p47，尤其是在Npl4存在的情况下。p47可以取代p97中的Ufd1和Npl4。这些数据还表明，p47和Ufd1/Npl4与p97结合的亲和力相当。将这些实验扩展到其他潜在的适配器复合体，看看它们是否也以互斥的方式绑定，这将很有趣。我们对哺乳动物Ufd2p同源物（也与p97结合）的初步实验表明，在p97与Ufd1/Npl4或p47的复合物中没有发现它。

与p97/p47相反，p97/Ufd1/Npl4复合物在有丝分裂后高尔基体融合中不起作用。p97/Ufd1/Npl4和p97/Ufd1均不促进有丝分裂高尔基体片段的池再生。当将Ufd1/Npl4或Ufd1滴定到分析中时，p97/p47催化的融合被抑制。该观察结果至少排除了重组路径中p97/Ufd1/Npl4的功能在体外，这最好由两个适配器之间的竞争来解释。因此，我们认为Ufd1/Npl4代表p47的替代适配器，它将p97引导至另一种细胞途径，与p47引导其在高尔基体膜融合中发挥作用的方式相同。

Ufd1/Npl4引导p97的途径仍然未知，但对酵母和哺乳动物Ufd1p和酵母Npl4p的大量研究提出了一些明显的可能性。在酵母中，Ufd1p和其他四种蛋白质（Ufd2p–Ufd5p）在一个识别泛素作为降解信号的途径的基因筛查中被鉴定(约翰逊等人，1995年). 一种包含与β-半乳糖苷酶融合的N末端泛素的非生理融合蛋白被用作降解报告物。泛素融合降解（UFD）蛋白在该报告蛋白泛素化和降解途径的特定步骤中是必需的。同一屏幕还显示需要p97同源物Cdc48p(Ghislain等人，1996年). 该途径中的两种蛋白质，Ufd2p和Ufd3p，已经被证明与Cdc48p发生物理相互作用。高效的多泛素化需要Ufd2p(Koegl等人，1999年)虽然不清楚为什么它与Cdc48p结合，因为多泛素化也不需要Cdc48p在体外(Koegl等人，1999年)或体内(Ghislain等人，1996年). Ufd3p的功能尚未完全了解，但它在某种程度上影响了游离泛素的水平。将这些Cdc48p/Ufd复合物与哺乳动物中发现的那些进行比较将是有趣的。到目前为止，我们有证据表明Ufd2p的哺乳动物同源物与p97结合，但没有Ufd3p同源物。

虽然Ufd1p和Cdc48p在UFD途径中的确切生化功能尚不清楚，但它们在多泛素化后的途径中都起作用较晚。有趣的是，这两种蛋白质对生存能力都至关重要，条件突变导致在有丝分裂后期形成相互连接的子细胞(莫尔等., 1982;约翰逊等., 1995). 鉴于这些观察结果以及它们在哺乳动物中相互作用的事实，它们很可能在有丝分裂期间发生的泛素依赖过程中共同作用。事实上，Npl4在酵母中也是必不可少的，这表明它可能参与了相同的过程。然而，据我们所知，尚未测试Npl4是否参与UFD途径。Ufd2p和Ufd3p是Cdc48p的另外两种已知结合蛋白。然而，因为它们不是必需的(约翰逊等., 1995)它们不能解释Cdc48p在有丝分裂中的重要作用。

在人类中，Ufd1的基因编码，UFD1L公司与DiGeorge综合征有关(Pizzuti等人，1997年;Yamagishi等人，1999年)是一种先天性发育障碍，伴有心脏和颅面缺陷。尽管有争议UFD1L公司有人建议通过第三和第四咽弓神经嵴细胞中的蛋白质降解来调节未知关键底物的数量。该通路的缺陷会导致该区域的畸形（由巴尔迪尼，1999年;辛克和伊祖莫，1999年). 小鼠中UFD1L的纯合缺失是致命的(Lindsay等人，1999年). 如果Ufd1与该疾病有关，那么很有兴趣了解p97和Npl4是否也参与其中。

有趣的是，新复合物的第三个蛋白Npl4从未与p97/Cdc48p或泛素依赖性降解联系在一起。酵母Npl4p对核运输、蛋白质进口和信使核糖核酸出口都至关重要(DeHoratius和Silver，1996年). 其结构和功能特征导致其是核孔复合体（NPC）的组成部分。因此，一种可能性是Npl4参与p97/Ufd1导入细胞核。这与免疫荧光显微镜显示的细胞核中所有三种蛋白质的存在一致。在酵母中，Cdc48p的核导入依赖于其磷酸化和核定位信号的暴露(马迪奥等., 1998). 也许Npl4就是这种机制的一部分。

由于Npl4在没有p97的情况下也与Ufd1以复合物的形式存在，这进一步表明Ufd1/Npl4复合物可能参与其他核转运过程。

据报道，Ufd1p可以在酵母中结合Uba2p(德尔奥尔莫等., 1997)Uba2p被证明能激活泛素样蛋白Smt3p(约翰逊等., 1997). 哺乳动物Smt3p同源物SUMO-1与RanGAP的连接将后者导向核孔复合体(马哈扬等., 1997;马图尼斯等., 1998). 因此，Ufd1可能不仅在泛素依赖性降解中起作用，而且在涉及泛素样蛋白的其他途径中也起作用，包括通过Smt3p/SUMO-1调节核质转运。在这种情况下，Ufd1和Npl4的相互作用可能有助于解释Npl4在核运输过程中的作用。还需要进一步的工作来探索这些可能性。

我们还注意到酵母和哺乳动物Npl4之间的一个有趣的差异。哺乳动物Npl4及其同源物线虫，在酵母蛋白中未发现的C末端包含锌指基序的单个拷贝。该基序称为RanBP锌指，也在其他NPC蛋白中发现，包括RanBP2和Nup153。它被证明是GDP结合形式的小GTPase Ran的结合位点(Yaseen和Blobel，1999年;Nakielny等人，1999年). Npl4是否可以绑定Ran以及是否将其链接到p97的活动仍有待确定。

新p97结合复合物Ufd1/Npl4的鉴定和表征支持一种模型，其中p97通过替代适配器定向到不同的细胞途径。我们目前的工作假设是p97/Ufd1/Npl4参与泛素依赖过程，其活性在有丝分裂中是必需的。进一步的工作将集中于确定其在有丝分裂中的靶点，以及这一过程如何与有丝分裂高尔基体重组中p97/p47的功能联系起来。

材料和方法

结合蛋白的纯化

大鼠肝细胞溶质（RLC，400 mg）(回族等., 1998)在RB缓冲液中通过凝胶过滤分离[25 mM Tris–HCl pH 7.4，150 mM KCl，2 mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇（DTT），5%（v/v）甘油]，使用Superose 6 HR 10/30柱（Pharmacia Biotech）。收集通过蛋白质印迹测定的含有p97峰的HMWF。根据制造商的说明，使用EZ-Link（Pierce）对重组p97（1 mg，见下文）进行生物素化，将其与链霉亲和素珠结合（UltraLink，Pierce。HMWF（10 mg）调整为750 mM KCl，并添加固定化p97。用RBT（无KCl）将混合物稀释至200 mM KCl，并在4°C下搅拌培养2 h。使用珠子作为对照，执行相同的程序。然后用RBT清洗珠子，并用1 M KCl在RBT中洗脱。洗脱后的蛋白质用三氯乙酸（TCA）沉淀，用冰镇丙酮洗涤，并在还原SDS-PAGE样品缓冲液中溶解。将样品在10%SDS–PAGE凝胶上分离，Coommassie Blue染色，并切除感兴趣的蛋白质条带。

蛋白质的质谱分析

染色的蛋白质带从凝胶中切除，并用胰蛋白酶消化，基本上符合舍甫琴科等人（1996）隔夜消解后，直接从消解上清液中取样0.5–1µl等分样品，使用TofSpec 2E激光解吸飞行时间质谱仪（英国Micromass）进行肽质谱指纹（PMF）分析。使用MASCOT搜索程序根据OWL非冗余复合蛋白数据库（约350000条）筛选实验肽块(布莱斯比和伍顿，1990年) (Perkins等人，1999年). 用50%（v/v）aq的连续洗涤液（每次30µl）洗脱剩余的消化肽（>90%的总消化液）。乙腈/5%（v/v）三氟乙酸（三次），然后洗涤3×30µl乙腈。池水晾干真空中并衍生为N个-琥珀酰亚胺-2-吗啉醋酸盐（SMA），以提高硼离子丰度并促进串联质谱的序列分析(Sherman等人，1995年;Hoss等人，1999年). 对衍生肽进行测序从头开始的通过使用配备纳米电喷雾源的LCQ离子阱MS（ThermoQuest，CA）进行低能碰撞活化解离（CAD）(亨特等人，1986年;Wilm和Mann，1996年). 使用1 mTorr氦气进行CAD，碰撞偏置电压为全电压（5 V）的22%至38%。

大鼠Npl4 cDNA的克隆

通过分析67kDa带获得的肽1序列（HVDNIMFENHTVADR）与两个重叠的小鼠EST序列（DDBJ/EMBL/GenBank登录号AA015556型和AA020051型). 使用引物NPL4-1（5′-GATCGATCAATACTCCAGC-3′）、NPL4-2（5〃-CTGGTTCCGGTCTCTCC-3′），NPL4-3（5′-CGAGAGCTCCGCTCTCTC-3′）和NPL4-4（5′-AGAAGTCAAGGAAGCGGCAC-3′）从小鼠肝脏第一链cDNA文库（Origene，MD，USA）中扩增出一段350 bp的片段，命名为NPL4A。此段（表示图中的bp 453–802​图2A）2A） 用作筛选大鼠肝脏λgt11 cDNA文库（Clontech，CA，USA）的探针。筛选75万个斑块，分离出9个阳性克隆，其中4个已测序并显示与探针匹配。一个克隆长4.5 kb，编码大鼠Npl4的整个开放阅读框（DDBJ/EMBL/Genbank登录号。AF234600型).

p97、p47、Npl4和Ufd1的表达与纯化

对小鼠p97的开放阅读框（ORF）进行PCR扩增并克隆到细菌表达载体pQE9（Qiagen）中。重组His-tagged p97在大肠杆菌用IPTG诱导后。细胞在LyB（500 mM KCl，100 mM Tris pH 7.4，5 mM MgCl2、1 mM ATP、5%甘油、2 mMβ-巯基乙醇、20 mM咪唑），并与Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）结合。用25 ml WB（150 mM KCl，50 mM HEPES pH 7.4，5 mM MgCl）清洗树脂2、1 mM ATP、5%甘油、2 mMβ-巯基乙醇、20 mM咪唑）和5 ml 1 M KCl。用350 mM咪唑洗脱WB中的蛋白质，在蔗糖梯度上加载（WB中为5–30%），并在65000转/分的VTi65.1转子（Beckman）中离心75分钟。收集峰馏分，交换到存储缓冲液中（150 mM KCl，20 mM HEPES pH 7.4，1 mM MgCl2，5%甘油，1mM DTT），置于PD10柱（法玛西亚）上并快速冷冻。如前所述，从大鼠肝细胞液中纯化p97（近藤等., 1999). 所有缓冲液均含有蛋白酶抑制剂混合物（完整TM（TM），不含EDTA，Boehringer Mannheim）。

Ufd1的ORF(Pizzuti等人，1997年)用PCR从小鼠肝脏第一链cDNA文库（Origene，MD，USA）扩增并克隆到pBluescript II KS+（Stratagene）中进行序列验证。将Ufd1和Npl4的ORF克隆到pGEX-4T（Pharmacia）和pQE9（Qiagen）表达载体中，使用巴姆这两种情况下的HI位点都是为了生成这两种蛋白的GST和His标记版本。使用巴姆HI站点。重组GST-和His-tagged蛋白在大肠杆菌并按照His-p97进行纯化，无需蔗糖梯度步骤。GST标记的蛋白质与谷胱甘肽Sepharose（Pharmacia）结合，并用WB中的25 mM谷胱甘苷洗脱。His-p47如前所述制备(Kondo等人，1997年).

抗体

通过注射GST融合蛋白在兔体内制备了抗Ufd1、Npl4和p47的多克隆抗血清哈洛和莱恩（1988）使用固定在AffiGel（Bio-Rad）上的His标记抗原纯化针对Ufd1和Npl4的特异性抗体。产生抗GST–Ufd1的单克隆抗体1E6（免疫荧光）和5E2（免疫沉淀）。多克隆抗p97抗体N5已在前面描述(米勒等., 1999). 抗p47的单克隆抗体由近藤久雄提供。J.M.Peters提供了一种针对p97的单克隆抗体。

纯化蛋白质下拉实验

用携带不同标签的纯化蛋白进行结合实验。标记蛋白及其相互作用伙伴通过标记特异珠沉淀。蛋白质和树脂的组合如下：（i）使用链霉亲和素-Sepharose（Pierce）将His-p97与His-Npl4和His-Ufd1生物素化；（ii）使用磁性Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）的His-Npl4与大鼠肝脏p97和GST-Ufd1；（iii）GST–Ufd1与His-p97和His-Npl4使用谷胱甘肽–Sepharose（法玛西亚）。在200µl BB（25 mM Tris–HCl pH 8.0，200 mM KCl，2 mM MgCl2，1 mM ATP，1 mM DTT，5%甘油，1%Triton X-100，1 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂）在4°C下持续1小时。添加10微升珠子并孵育30分钟。用BB清洗珠子，用样品缓冲液洗脱结合蛋白，并用SDS-PAGE分析，然后用考马斯蓝染色。

竞争实验也以同样的方式进行。在0、1、5或25摩尔过量竞争对手存在的情况下，用4微克His-p97培养2微克GST-p47或GST-Ufd1，并用谷胱甘肽-Sepharose拉下。组合如下：GST-p47与His-Ufd1、His-Ufd1/His-Npl4或His-Np4竞争；GST–Ufd1，His-p47；GST–Ufd1/His-Npl4和His-p47。

SDS–PAGE和Western blotting

蛋白质样品在还原性SDS-PAGE样品缓冲液中溶解，煮沸3分钟，然后使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分析，然后使用考马斯亮蓝R-250染色。用半干吸墨纸对硝化纤维进行蛋白质印迹。在PBS加5%（w/v）低脂奶粉中进行封闭和抗体培养。所有次级抗体都是使用ECL（英国阿默沙姆生命科学公司）检测到的HRP结合物（英国白金汉塔哥）。

叠加实验

蛋白质样品通过SDS-PAGE分离，并通过半干印迹转移到硝化纤维上。OB[5%（w/v）低脂奶粉、0.5%Triton X-100、5 mM MgCl中的膜被堵塞2隔夜，多次更换缓冲液。然后将其与生物素化p97或生物素化Npl4在OB中以10µg/ml的浓度孵育2 h并清洗。结合探针用链霉亲和素结合的HRP（Vector，CA，USA）稀释1:2000培养1h后检测，清洗后用ECL Plus（Amersham Life Science，UK）观察。所有步骤均在4°C的OB中进行。

免疫沉淀

使用IPB（25 mM Tris–HCl pH 7.4，200 mM KCl，2 mM MgCl）将感兴趣的组分调整为500µl2、1 mM DTT、5%甘油、1%Triton X-100）。添加纯化抗体（1µg）、5µl抗血清或100µl杂交瘤细胞上清液，并在4°C下培养1 h。兔IgG与蛋白A结合，小鼠IgG结合蛋白G-琼脂糖30分钟。琼脂糖用IPB洗涤，蛋白质用样品缓冲液洗脱并用SDS-PAGE分析。

高尔基体重组试验

高尔基体重组分析如前所述进行(拉布耶等1995年b)经过修改(肖特和沃伦，1999年). 简言之，从纯化的大鼠肝脏高尔基体堆叠和有丝分裂HeLa胞质溶胶制备MGF，并通过0.5M蔗糖缓冲液离心以去除内源性p97及其结合蛋白。MGF与p97（70纳克/µl）、p47（35纳克/µl）、Ufd1（35纳克/µl）和Npl4（49纳克/µl）的预成型复合物在37°C下孵育60分钟，如图图例所示。固定样本并进行EM处理。使用标准体视学程序对水池再生进行定量(肖特和沃伦，1999年).

免疫定位

NRK细胞（正常大鼠肾脏）在DMEM/10%胎牛血清（Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA）和BS-C-1细胞（正常非洲绿猴肾脏）在MEM/10%胎牛血清中生长。用两种不同的方法处理细胞：（i）在PBS中的4%多聚甲醛中固定15分钟，在50 mM NH中培养15分钟4PBS中的Cl，在-20°C冷甲醇中渗透8分钟；或（ii）在冰镇甲醇中固定和渗透。将细胞与以下抗体孵育：针对p97的亲和纯化的兔抗体（N5）、针对Npl4的亲和纯化的兔抗体或针对Ufd1的单克隆抗体（1E6），然后是第二抗体Alexa Fluor 488山羊抗兔，Alexa Fluor 594山羊抗兔或Alexa Furo 594山羊抗鼠（Molecular Probes，Eugene，or，USA）。使用蔡司Axiover 100M倒置显微镜（德国Oberkochen的卡尔蔡司）进行荧光分析，并使用软件包Openlab 2.1（英国考文垂Improvision）在Orca 100 CCD相机（日本滨松市滨松）上拍摄图像。

致谢

我们感谢Brian Burke和Al Price的批判性阅读。这项工作得到了H.H.M.博士后研究金的支持，最初来自德国Forschungsgemeinschaft，后来来自人类前沿科学计划。J.S.得到了德国Forschungsgemeinschaft的博士后奖学金的支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团