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神经科学杂志。2010年7月21日；30(29): 9771–9781.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.0700-10.2010
预防性维修识别码：下午3点842479分
PMID：20660259

哺乳动物脑室管膜下区干细胞和前体细胞的沉默和激活与不同的细胞和细胞外基质信号有关

Ilias Kazanis公司，通讯作者1,* 贾斯汀·拉提亚，1,2,* 特吉·J·瓦达坎，三 埃里克·拉博恩，4,5,6 瑞钱湾，2 穆罕默德·穆加尔，2 D.马克·埃克利，7 佐佐木孝子，8 布鲁斯·巴顿，9 马克·马特森，2 凯伦·赫斯基（Karen K.Hirschi），4,5,6 玛丽·迪金森，三和查尔斯·费伦奇常数1,10
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

侧脑室室管膜下区（SEZ）是成人大脑中的一个区域，神经干细胞（NSC）通过快速分裂的前体不断生成新的神经元。该神经源性生态位是一个复杂的细胞和细胞外微环境，与非神经源性心室周围区域相比，具有高度的血管化，其中神经干细胞和前体细胞表现出不同的行为。在这里，我们研究了细胞外基质分子及其受体调节这种差异行为的可能机制。我们发现，神经干细胞和前体细胞通过成年雄性小鼠SEZ内相同区域的有丝分裂进行，而神经干细胞靠近室管膜细胞，并且与血管的距离相比，与心室的距离是神经原性活动的一个更强的限制因素。此外，我们发现神经干细胞和前体细胞嵌入富含层粘连蛋白的细胞外基质中，它们都可以对其起作用。重要的是，它们表达不同水平的细胞外基质受体，NSC表达低水平的α6β1整合素、syndecan-1和路德兰，以及体内阻断β1整合素可选择性诱导前体细胞增殖和异位迁移。最后，当神经干细胞在前体细胞耗尽后被激活以重建生态位时，层粘连蛋白受体的表达上调。这些结果表明，成人神经干细胞和前体细胞的独特行为不一定是通过暴露于不同的细胞外信号来调节的，而是通过其与微环境相互作用的内在调节。

介绍

干细胞生态位是由支持细胞和脊椎动物血管构建的保护性微环境，其中包含干细胞及其部分后代(斯加登，2006年;Kiel等人，2007年). 成年啮齿动物大脑中的神经源性干细胞生态位是侧脑室（LVs）侧壁的室管膜下区（SEZ）。这里，星形胶质样神经干细胞（NSCs，也称为B型细胞）通过传递扩增前体细胞（TaPs，或C型细胞）生成神经母细胞（NBs，或A型细胞）和少突胶质前体细胞(Doetsch等人，1999年). 神经干细胞及其下游更坚定的祖细胞（统称为“前体”）在生态位内的细胞周期行为是不同的。在正常的中枢神经系统中，神经干细胞相对静止，而前体细胞活跃增殖(Morshead等人，1994年). 然而，在前体消融后，神经干细胞被激活并迅速生成新的TaP群。然而，决定这些不同行为的内在和外在信号仍然难以捉摸。

确定这些信号身份的必要第一步是建立NSC和TaP的细胞和细胞外环境。以前的研究表明，经济特区的增殖细胞与血管密切相关(Shen等人，2008年;Tavazoie等人，2008年)和分形(Kerever等人，2007年)细胞外基质（ECM）结构被认为是血管基底膜的连续体，神经干细胞嵌入室管膜细胞之间，在心室壁形成特定的钉轮细胞结构(Mirzadeh等人，2008年). 然而，这些研究并没有检查NSC和TaP在接近室管膜细胞和血管方面是否存在差异，这是制定假设的关键信息，即哪种细胞类型为每个干细胞/前体细胞群产生信号。此外，ECM的作用也不是通过测定其成分及其受体的表达来检测的。在这里，我们进行了这项分析，并表明，虽然干细胞和前体细胞与血管的距离相等，但干细胞也与室管膜细胞非常接近。层粘连蛋白在整个生态位表达，但只有前体在正常中枢神经系统中表达层粘连结合整合素，功能研究表明，这些整合素调节增殖和迁移。在再生过程中，神经干细胞也表达整合素，因此，我们的研究首次显示了层粘连蛋白如何在维持和再生过程中调节生态位中不同种群的增殖。

材料和方法

组织制备和免疫染色。

实验是根据《动物（科学程序）法案》（1986年）进行的。成年（4-6个月）C57BL/6和129sv雄性小鼠被固定在PBS中4%的多聚甲醛中。冷冻器（6μm）或震动器（70μm）脑切片从前角延伸至后方2.0mm的区域切下。为了进行免疫染色，用0.1%Triton X-100和10%正常山羊血清（Sigma）在PBS中处理切片，然后在4°C下与适当的一级抗体孵育过夜（使用的抗体列在补充表1中，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。对于层粘连蛋白免疫染色，切片也用丙酮固定（10分钟），封闭缓冲液中含有3%BSA（Sigma）。使用Alexa Fluor 350、488、568和647（Invitrogen）作为第二抗体。为了鉴定缓慢分裂的BrdU保留细胞，小鼠每天接受2次BrdU注射（Sigma；50 mg/kg体重），持续3天，40天后处死。按照上述方法对大脑进行处理和分析，并在37°C下加入2N HCl预处理30分钟。HCl处理导致大多数层粘连蛋白和层粘连素受体的免疫染色发生显著变化；因此，只有BrdU/β1整合素双重染色结果被纳入分析。使用奥林巴斯IX50或蔡司荧光显微镜和徕卡SP5共焦显微镜采集图像，并使用MagnaFire和Photoshop（Adobe）软件进行处理。如前所述，使用DeltaVision成像分析三重标记(Lathia等人，2007年). 简单地说，奥林巴斯IX60倒置显微镜被用作图像采集平台（Applied Precision）。堆栈构建的接口是通过SoftWorx采集模块（Resolve3D）完成的。图像堆栈的中心由Resolve3D的自动对焦功能确定，图像使用自定义脚本从该平面向外自动编译为交错的颜色堆栈。Tiff是通过SoftWorx命令生成的，并导出到Adobe Photoshop进行图形装配。每个实验图像都是用60倍物镜采集的，每个细胞20片，每片100 nm。使用中等强度快速投影功能显示图像。

为了进行结构分析，使用了冠状振动切片，而不是SEZ整体支架，以便将神经源性生态位与相邻的非神经源性纹状体和心室周围区域进行比较。虽然这是有利的，但我们考虑了冠状切面的使用带来的两个可能的局限性，即由于切面的分离导致邻近结构（如血管）的丢失，以及由于切面体积有限，微血管密度不具有代表性的可能性。为了分析分裂细胞的位置，所有工作都是用共焦显微镜进行的z（z）-在测量细胞核与最近血管的距离时，我们排除了那些距离血管边缘<10μm的细胞核z（z）-如果到血管的距离大于20μm，则可叠加，对于这些细胞，最近的血管可能不在z（z）-堆栈。根据我们的测量，经济特区内的船只密度为2.5%。因此，在冠状切面上切断血管产生的误差为～3%。此外，由于我们排除了边界上的细胞，因此可能由冠状截面有限尺寸引起的邻近度测量误差进一步减小。当计算微血管密度时，它们并不完全相等z（z）-尽管如此，这种变异性也存在于整个坐骑中，我们使用冠状面切片和全坐骑切片测量的平均血管密度没有显著差异（数据未显示）。

使用共焦显微镜（LSM 510 META，卡尔蔡司）和Plan-Apochromat 63 X/1.4油DIC物镜对染色进行成像。使用自动图像处理软件FARSIGHT分析图像(查伯德和摩尔，2005年). 多通道图像中的细胞类型如下所述。首先，使用FARSIGHT对图像中所有DAPI染色的细胞核进行计数。在核标记的情况下，对相应通道中超过一定强度阈值的所有核进行计数。对于膜标记物，检查DAPI染色的细胞核的边界像素，如果像素高于或低于强度阈值，则将细胞核视为阳性或阴性。SEZ中细胞类型的分数定义为不同图像中计数的细胞核总数与相应图像中DAPI染色细胞核总数的比值。这些细胞类型是从经济特区的2200个细胞池中进行分类的。为了测量各种细胞类型到血管的距离，如上所述分割细胞核，然后分割血管，并使用FARSIGHT测量细胞核质心到血管表面的距离。使用MATLAB编写的自定义程序测量血管密度，使用LSM图像浏览器从60z（z）-厚度为10–45μm的堆叠。所分析的每个图像的大小为143μm（平行于侧脑室）×20μm（与脑室的距离）。使用Imaris 5.0.3进行涉及GFAP免疫染色的测量。

AraC治疗和β1整合素阻断实验。

将成年小鼠麻醉，并将套管（BIK-II，Alzet）固定在颅骨上（前角外侧1mm），连接至皮下植入的微型渗透泵（1007D，Alzet）。对于AraC治疗，将4%的AraC（Sigma）或生理盐水单独注入大脑表面4天，并在灌注结束后的不同时间点处死动物(Kazanis等人，2007年). 在β1整合素阻断实验中，在一个心室内注射等型控制或阻断抗体（克隆Ha2/5，BD Biosciences PharMinen）3 d，并在治疗后1或4 d处死小鼠。

荧光激活细胞分类和神经圈分析。

10～12周龄杂合子Sox2:EGFP的SEZ(Ellis等人，2004年)将CD1雄性小鼠显微解剖成DMEM/F12（Sigma）。样品用木瓜蛋白酶（沃辛顿）消化30–45分钟，偶尔再悬浮(Panchision等人，2007年;Coskun等人，2008年). 样品通过40μm过滤器，以排除未消化的组织和大碎片，细胞浓度调整为106细胞/100μl用于染色。将细胞悬液与与Alexa Fluor 700（Biolegend）结合的β1整合素抗体以1:100的浓度在冰上孵育20分钟。在分选前至少10分钟，添加碘化丙啶（1:100），以排除死亡或正在死亡的细胞。实验是在BD FACSaria机器上进行的。将野生型小鼠的样品用作阴性对照，以设置电压并建立正负门（补充图1，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。使用FACSdiva软件收集数据，并使用Flowjo软件进行分析。以克隆密度（50个细胞/厘米2) (Coskun等人，2008年)神经球培养基（含FGF2和EGF）。第3天后添加新鲜培养基以保持生长因子浓度，并在第7天评估球体形成潜力。将单个初级球体放置在96 well板的单个孔中，并分解成单个细胞，以评估次级球体的形成。

结果

神经源性生态位的结构特征

SEZ神经源性生态位是一个狭窄的脑室周围区域，延伸到左室壁外侧的成熟脑组织中几微米，其中中部和腹部是薄而致密的区域，背部更宽，以迁移的NB大簇为主(图1和补充图2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。我们比较了左心室外侧的SEZ结构和位于SEZ内侧（中部和背部）的非神经源性区域(图1)，专注于室管膜细胞、星形胶质细胞和血管系统。室管膜细胞形成一个单层，排列在心室中，在室管膜层下面的内侧，多个星形胶质细胞形成一层平行于心室壁的突起(图1，插图1）。这种室管膜-星形胶质细胞结构在SEZ没有观察到，在那里星形胶质细胞突起呈放射状或随机运行(图1，插图2）。SEZ生态位的特点还包括广泛的血管网络，许多血管与心室平行（补充图3，见网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。使用图像处理软件（见材料和方法），我们比较了背腹和口唇水平范围内（从前角（0 mm）到吻侧2.0 mm）外侧和内侧的血管网络(n个=6只小鼠）。SEZ中的血管网位置更靠近心室（平均距离为12.06±4.07μm，内侧为21.15±10.43μm，第页<0.02（使用Kruskal–Wallis试验），血管与心室的最短距离也明显更小（10.21±2.56μm，而内侧20.07±8.64μm）。因此，壁龛周围区域的血管明显多于内侧（外侧血管占组织体积的2.48±1.65%，内侧血管占0.42±0.39%；第页尽管血管的平均直径相似（内侧5.75μm±1.85，外侧4.64μm±1.8 5），但使用Kruskal–Wallis试验得出的结果为<0.01。根据上述绘图，经济特区的血管似乎呈分层，可分为四层（出于分析原因），每层厚度为5μm。第一层由室管膜细胞层组成，完全没有血管。第二层显示出与SEZ血管的主要差异，但与非神经原性血管无明显差异。然而，在这两个区域，第三层和第四层都具有高度的血管性。

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经济特区的结构特征。显示了显示成年小鼠大脑整个侧脑室的冠状切片的两个低倍视图，左侧为Ki67的单幅标记（红色），右侧为Ki67和GFAP的双幅标记（绿色）。如图所示，内侧偏左，外侧偏右。请注意，增殖（KI67+细胞）仅发生在紧邻心室外侧的位置，几乎延伸到心室外侧的整个长度，增殖的基本界限由箭头标记。GFAP标记揭示了两者的结构差异；在内侧（非神经源性）侧，室管膜细胞以星形细胞突起为底纹（方框1，插图1中以高倍显示，箭头显示GFAP+星形细胞突触），神经源性侧缺少细胞构筑（方框2，插图2中以高倍数显示，注意没有星形细胞突入与心室表面平行）也可以在血管周围看到GFAP+过程（方框3，插图3中以更高的倍数显示）。请注意，增殖细胞位于血管旁边，但仅在距离心室一定距离处可见，这是因为它们不在血管的外侧（如插图3中的箭头所示）。比例尺，100μm。

NSCs和前体的有丝分裂活性发生在SEZ的相同微结构域中

在确定了室管膜细胞和血管在经济特区内的位置后，我们接下来问，NSC和TaP相对于这些结构成分的位置是否表明两者在为神经发生提供细胞环境方面起着主导作用。首先，我们使用自动物体识别软件（FARSIGHT）确定了经济特区内不同类型细胞的数量：室管膜细胞（33%）、TaPs（12%）、NBs（23%；常见于集群）、星形胶质细胞（包括NSC）（16%）、神经元（11%）和未识别细胞（5%）（有关细胞类型特异性标记，请参阅补充图2，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）-与先前研究结果密切一致的数字(Doetsch等人，1997年).

然后，我们的分析主要集中在有丝分裂细胞（即“实时”神经原活动，而不是可能处于G区的细胞1以磷酸化组蛋白3（PH3）的表达为标志。我们使用GFAP的表达来区分TaPs和NBs（GFAP阴性）与NSC（GFAP阳性）的组合群体，以便使用PH3抗体和层粘连蛋白（识别血管）进行必要的三重标记实验进行结构分析。针对进一步区分TaP和NB的标记物添加抗体，导致信号水平不足以进行分析。鉴定了来自7只小鼠的157个有丝分裂细胞，并将其分离为潜在的NSCs（共表达GFAP）或更多的前体（GFAP阴性）。为了分析不同细胞类型的位置特征，测量了每个PH3+细胞的细胞核中心到心室和最近血管的最短距离（补充图4，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），使用FARSIGHT。正如预期的那样，绝大多数有丝分裂细胞都是GFAP阴性（91±2%），它们在所有口胃和背腹水平上都能观察到，尽管在壁龛中部的平均密度较低，而在腹侧SEZ中没有观察到GFAP+有丝分裂的细胞（补充图4，见网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

所有有丝分裂细胞都位于心室附近一个20μm宽的区域内。室管膜细胞之间很少有有丝分裂核（距离心室表面<5μm；占所有有丝分裂细胞的7%），其中包括近一半分裂的星形胶质细胞（40%的GFAP+/PH3+细胞）和一小部分有丝分裂的GFAP−细胞（6%的GFAP-/PH3+细胞。在第二层细胞层（距离心室表面5-10μm）观察到更多有丝分裂细胞（占所有有丝分裂的细胞的43%），属于GFAP+（60%的GFAP+/PH3+细胞）和GFAP−（42%的GFAP−/PH3+）细胞。反映出这一点，有丝分裂GFAP+细胞（NSC）与心室的平均距离为7.2±1.5μm，而有丝分裂的GFAP-前体细胞与心室的距离为10.7±4.3μm(第页=0.316，使用非参数Friedman检验）。第三层和第四层细胞（10–20μm）含有大量GFAP−有丝分裂细胞核（分别占GFAP−/PH3+细胞的35%和17%），但没有有丝分裂星形胶质细胞，尽管这些细胞层富含非分裂星形细胞（包含所有SEZ星形胶质细胞的25%，另有9%位于20μm以外）。因此，这些数据表明，神经原性活动（神经干细胞或下游前体细胞）发生在脑室周围区域，GFAP+有丝分裂细胞（NSC）局限于心室附近的10μm处，而GFAP−细胞（前体）分散在SEZ的20μm深处。

在确定了上述SEZ的神经原区域比非神经原区域更有血管后，我们接下来检查了有丝分裂细胞相对于血管的位置。有丝分裂神经干细胞、有丝分裂前体细胞和非有丝分裂星形胶质细胞与最近血管的平均距离无统计学差异（神经干细胞：16.6±15.4μm，前体细胞：13.7±10.6μm，非有丝裂星形胶质细胞：16.8±10.7μm；第页使用非参数Friedman检验=0.12），我们在距离最近血管>20μm处观察到大量有丝分裂神经干细胞和前体细胞（神经干细胞：20%0–5μm，30%5–10μm，50%>20μm；前体细胞：29%0–5微米，19%5–10微米，6%10–15μm，23%15–20μm，以及23%>20μm）。事实上，当使用非参数配对Wilcoxon检验比较每个有丝分裂细胞与心室和最近血管的距离时，发现有丝分裂神经干细胞和前体细胞都非常靠近心室，而不是血管(第页=0.007，对于NSC和第页=0.013（对于前体），尽管后者中的许多人距离心室10–20μm。

神经原微环境富含层粘连蛋白

在确定了神经干细胞和前体细胞在经济特区内的分布不同之后，我们接下来询问这是否导致了两个种群细胞外基质环境的差异。我们重点关注层粘连蛋白，因为这些分子在其他生态位中发现，并且之前已经证明在经济特区的分形中存在。层粘连蛋白是由一条α链、一条β链和一条γ链组成的三聚体，我们使用可用的链特异性抗体检测了这些链的表达，详见表1壁龛的血管对许多层粘连蛋白链以及agrin、IV型胶原和纤维连接蛋白呈免疫阳性(表1). 在SEZ内的血管和邻近纹状体区域内的血管之间，未检测到ECM图谱的差异（数据未显示）。血管检查显示层粘连蛋白的表达局限于血管的外表面，GFAP+细胞经常与血管的层粘连丰富区紧密接触（补充图3A类，B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。室管膜和室管膜下区域的薄壁组织也对相同的层粘连蛋白呈免疫阳性(表1). 相反，在邻近纹状体区，层粘连蛋白免疫反应主要与血管相关。免疫反应在SEZ内弥漫，但在室管膜层以及TaP和NB簇周围显著增高（补充图5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料和未显示的数据）。此外，还观察到免疫阳性的分形结构(表1; 补充图5，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。重要的是，在这些区域中的任何一个区域之间都没有发现所表达的链的差异。因此，总的来说，这些数据表明，与相邻的非神经源性区域相比，神经源性生态位的特点是层粘连蛋白浓度较高，神经干细胞和前体同样暴露于该ECM中，并且根据特定链的表达判断，三聚体组成没有差异。

表1。

ECM分子在正常和再生SEZ中的表达谱

正常
AraC后
室管膜细胞层经济特区b.v.公司。法语。上皮细胞层经济特区b.v.公司。
层粘连蛋白α1n个n个n个n个n个n个n个
层粘连蛋白α2弥漫的弥漫的高第页弥漫的n个高
层粘连蛋白α3n个n个n个n个n个n个n个
层粘连蛋白α4弥漫的弥漫的高第页弥漫的n个高
层粘连蛋白α5弥漫的弥漫的高第页弥漫的n个高
层粘连蛋白β1弥漫的弥漫的高第页弥漫的星形胶质细胞相关高
层粘连蛋白β2n个低高n个弥漫的n个高
层粘连蛋白γ1弥漫的弥漫的高第页弥漫的n个高
层粘连蛋白γ2弥漫的弥漫的高第页弥漫的n个高
层粘连蛋白γ3弥漫的弥漫的高（～5%）第页弥漫的n个高（～5%）
阿格林n个n个高n个n个n个高
胶原蛋白IVn个n个高n个n个n个高
纤维结合蛋白n个n个高n个n个n个高
CSPG公司弥漫的n个高n个弥漫的n个高
卡兰尼n个n个n个n个n个n个n个
尼多根-1n个n个n个n个n个n个n个
珀利坎n个n个n个n个n个n个n个

注意，经阿糖胞苷治疗后，SEZ层粘连蛋白免疫反应性降低。b.v.，血管；Fr.，分形；n、 负向；p、 积极的。

神经干细胞和祖细胞层粘连蛋白受体的差异表达

如果层粘连蛋白受体在两个群体上的表达不同，那么层粘连素的均匀表达仍然可以在茎和前体群体中产生不同的信号。因此，我们对层粘连蛋白的主要受体的表达进行了免疫组织化学分析：整合素（由一条α链和一条β链组成）、合癸糖、肌营养不良聚糖和作为层粘连素α5链特异性配体的路德兰。最广泛表达的层粘连蛋白受体是由血管、室管膜细胞和祖细胞表达的α6和β1整合素(表2). 双重免疫染色显示，这些亚基高度共定位（数据未显示），与层粘连蛋白α6β1-结合整合素的表达一致。β1-整合素和转录因子Sox2（在NSCs、前体和室管膜细胞上表达）的双重免疫染色显示，表达β1整合素的Sox2阳性细胞(图2A类). 为了确定整合素阴性人群，我们使用了细胞类型特异性标记。这些证实了室管膜细胞、TaPs和成神经细胞β1整合素阳性(图2)SEZ中所有活跃分裂的细胞都表达高水平的β1整合素(图3). 然而，有趣的是，星形胶质细胞的细胞体和突起不表达β1整合素(图2)表明整合素阴性的Sox2+细胞可能包括NSC人群。

表2。

层粘连蛋白受体在正常和再生SEZ中的表达谱

E类B类TaP公司注b.v.公司。
α3整合素n个n个n个n个n个
α4整合素n个n个n个n个n个
α5整合素n个n个n个n个n个
α6整合素高n个高高高
α7整合素n个n个n个n个高
β1整合素高n个高高高
新癸烷-1n个低高高低
路德教徒高n个高高高
代糖多糖n个n个n个n个高

注意，B型细胞在正常生态位中表达低水平或无法检测到的层粘连蛋白受体。E、 室管膜细胞；B、 B型星形胶质细胞；b.v.、血管；n、 消极。

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SEZ中β1整合素的细胞型特异性表达。采用冠状切片双重免疫染色法研究了不同类型SEZ细胞β1整合素的表达。Sox2标记生态位内的许多细胞(A类)，其中大多数对β1整合素呈免疫阳性，尽管也观察到一些Sox2+/β1整合素阴性细胞(A类，箭头）。通过Mash1表达鉴定的传递扩增前体(B类箭头表示1例）和PSA-NCAM阳性神经母细胞(C类)共表达β1整合素。星形胶质细胞不表达可检测的β1整合素水平(D类，箭头表示2β1整合素阴性星形胶质细胞）。室管膜细胞（所有面板中的箭头表示）和血管（位于C类和D类)还表达高水平的β1整合素。在所有图像中，侧脑室都在右侧。比例尺，30μm。

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β1整合素表达与细胞周期。抗磷酸组蛋白3免疫标记的主动分裂细胞(A类，箭头指示1个PH3+细胞）或抗Ki67抗体(B类，2 Ki67+细胞用箭头表示）表达β1整合素第1页，A2类，地下一层、和B2级，显示了单通道免疫标记。在A3号和地下三层，它们以绿色与PH3/Ki67合并，以红色与整合素合并。蓝色表示DAPIA3号相反，在最后一次注射后40天保留BrdU的缓慢分裂的细胞β1整合素为阴性（如箭头所示C类和D类). 注意在BrdU保留细胞附近存在多个β1整合素+细胞。在D类，BrdU保留细胞也是GFAP+，与NSC身份相容。C3类和第4天以绿色显示与BrdU合并的图像，以红色显示整合素，以第4天，GFAP为蓝色。比例尺：A类，B类，D类，10微米；C类，5微米。

NSC不表达β1整合素的发现令人惊讶，因为据报道，这种整合素在其他干细胞上高度表达。因此，我们进一步从两个方面验证了这一结论。首先，我们进行了标记研究，其中小鼠被给予累积剂量的BrdU，并在40天后死亡。这确定了将在其中发现NSC的缓慢分裂的细胞群，而快速分裂的前体稀释了BrdU，因此未标记。与我们的初步结果一致，我们发现90%的BrdU保留细胞为β1整合素阴性(图3). 作为确认这一结论的第二种方法，我们使用了一种神经圈分析。神经球是包含干细胞、前体细胞和分化程度更高的细胞的混合物的三维（3D）聚集体，这些细胞从单个干细胞生长而来，可以通过传代形成次级神经球，因此提供了一种半定量方法来评估分离细胞群中的干细胞数量。我们使用荧光激活细胞分选（FACS）收集细胞亚群，从成年Sox2-EGFP小鼠显微解剖的SEZ中分离，并用β1整合素结合抗体进行免疫染色(n个= 4). 在这些小鼠中，EGFP报告子已被证明准确地代表内源性Sox2表达(Ellis等人，2004年)通过比较EGFP表达和Sox2免疫反应性，我们在成年SEZ中验证了这一点(图4A类). 在FACS分析中，根据EGFP和β1整合素的高或低表达将四个群体进行分类，其中EGFP+β1整合素−群体包含假定的GFAP+NSC(图2A类，D类，​,44B类)，每一个都被收集并播种到生长培养基中，以评估神经圈的形成(图4C类). 对60000多个细胞进行了检测，结果显示，几乎所有具有神经球形成能力的细胞都是Sox2+，但β1整合素阴性，833个球体中有830个是由Sox2+/β1整合素组成的。次级球体由该种群83%（75/90）的初级球体形成。因此，这些结果证实，经济特区的Sox2+/β1整合素−人群高度富集NSC，因此我们得出结论，正常经济特区的绝大多数NSC不表达可检测的β1整合素。

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SEZ的Sox2+/β1整合素阴性细胞具有较高的神经球形成能力。A类，Sox2抗体免疫荧光（红色）显示与EGFP报告子（绿色）在成年Sox2:EGFP小鼠的SEZ中共定位。B类，典型的FACS数据显示表达Sox2（EGFP）和/或β1整合素的人群的门控。可以区分四个人群。C类，图中所示四个群体中形成神经球的细胞百分比B类注意，只有Sox2+细胞产生神经球，主要是那些Sox2+/β1整合素阴性的细胞。图中的数据表示平均值和SEM。

对其他层粘连蛋白受体的检查表明，路德兰与β1整合素共定位（补充图6，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。Syndecan-1在TaP和NB上表达（补充图7，可在网址：www.jneurosci.org但与β1整合素相比，在室管膜细胞层仅观察到低水平表达。此外，与β1整合素和路德兰相比，部分星形细胞胞体和进程（10±1.5%，n个=3只小鼠）表达syndecan-1。最后，血管对α7整合素和dystroglycan也呈免疫阳性(表2).

对于NSCs不表达可检测水平的β1整合素的结果，有两种可能的解释。首先，β1整合素可能仅在分裂细胞上表达，并且由于绝大多数NSCs处于静止状态，它们是β1整合素阴性的。第二，神经干细胞和前体细胞的整合素表达可能不同，因此，无论其细胞周期状态如何，神经干公司总是β1整合素阴性。理论上，通过检查分裂的神经干细胞，可以在正常生态位中区分这两种可能性，但这是非常罕见的细胞。因此，为了区分这些可能性，我们利用了SEZ的再生特性，在SEZ中，大量的NSC被激活并重新进入细胞周期，在用细胞毒药物AraC消融后重建TaP和NB群体。将阿糖胞苷注入大脑表面4天，并在治疗结束后立即处死小鼠（第0天，n个=5）和2或4天后(n个=每个时间点5）。共鉴定出184个PH3+细胞。正如所料，在再生的最初阶段，大多数是星形胶质细胞，其百分比随后下降（数据未显示）。值得注意的是，现在观察到一些有丝分裂星形胶质细胞距离心室10μm以上（与正常SEZ相比），但从未超过心室20μm（分布如下：11%0–5μm，63%5–10μm，22%10–15μm，4%15–20μm）。与正常的SEZ一样，这些细胞更靠近心室，而不是血管（距离心室8.6±3.4μm，距离血管15.8±10.5μm；第页<0.05（使用非参数Wilcoxon检验）。有丝分裂GFAP−细胞在AraC治疗结束后立即非常稀少，但此后其数量增加，其分布与正常生态位相似（离心室20%0–5μm，36%5–10μm，34%10–15μm，10%15–20μm）。阿糖胞苷输注结束后，SEZ星形胶质细胞上lutheran和syndecan-1的表达立即上调(图5)而a6β1整合素的表达仍未检测到。然而，2天后，当成神经细胞仍然缺失且TaP池仅部分重建时，GFAP阳性细胞上的β1整合素表达上调。三重免疫染色显示，这些β1整合素+/GFAP+星形胶质细胞也是Sox2+，证实SEZ小生境中的NSC在有丝分裂激活时上调β1整合素(图5E类，F类). 我们得出结论，整合素的表达与有丝分裂状态相关，而不是干细胞和前体细胞之间的差异。

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正常和再生SEZ中的层粘连蛋白受体。冠状切片SEZ的特征图像免疫染色GFAP（绿色）和syndecan-1或β1整合素（红色），DAPI为蓝色。A、 B类正常SEZ星形胶质细胞syndecan-1和β1整合素的表达很低。(C、 D类)，在抗核分裂药物AraC治疗结束后（第0天，C类和D类)，syndecan-1在星形胶质细胞上的表达上调（如C类)而β1整合素仍仅在室管膜细胞和血管中表达(D类). 注意由于阿糖胞苷治疗导致TaPs和NBs的缺失导致整体β1整合素免疫反应性降低（比较B类和D类). AraC治疗两天后，当神经干细胞有丝分裂以再生生态位时，SEZ星形胶质细胞上β1整合素的表达也上调（syndecan-1和β1整合蛋白阳性星形胶质细胞的例子如E类和F类）。在的右侧D类图中显示了三层标记截面的高倍视图，显示了GFAP+/β1整合素+/Sox2+细胞，因此该细胞是NSC。在所有图像中，侧脑室都位于左侧。比例尺，20μm。

有趣的是，尽管血管和室管膜细胞相关的层粘连蛋白免疫反应以及分形点的出现不受AraC治疗的影响，但弥漫性实质层粘连素表达水平显著降低(图6). 这表明TaPs和NBs（占生态位中细胞总数的～35%）为生态位微环境的这个隔间贡献层粘连蛋白。除了与星形胶质细胞突起和胞体共定位的层粘连蛋白β1的高水平表达外，层粘连素表达没有其他变化(图6).

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层粘连蛋白在正常和再生SEZ中的表达。来自不同层粘连蛋白链免疫染色的冠状切片的SEZ特征图像。在正常的SEZ（如左上三个面板所示），层粘连蛋白免疫反应性（绿色，DAPI为蓝色）在细胞簇周围较高。顶部面板中的白色箭头表示SEZ背角的层粘连蛋白-α1免疫反应，而中间面板中的星星表示SEZ中用层粘连素-γ1和层粘连蛋白质β1免疫染色后的小细胞簇。室管膜细胞层层粘连蛋白的表达也很高（侧脑室位于底部的中间面板中的箭头）。AraC治疗后（如右上三个面板所示），导致TaPs和NBs消融，壁龛的层粘连蛋白含量降低（顶部的黄色箭头和中间面板中的星星表示类似于左侧所示区域的细胞群），尽管室管膜细胞周围层粘连素含量仍然很高（箭头）。一个例外是层粘连蛋白β1的表达，其免疫反应保持不变（如图中最低的一组面板所示），并与GFAP+过程共定位，如图底部的三个面板所示，其中一个部分被双重标记为层粘连素β1（红色）和GFAP（绿色）。比例尺，10μm。

阻断β1整合素导致前体细胞增殖和迁移增加

在证明β1整合素在有丝分裂干细胞和前体细胞上表达后，我们询问这些整合素的功能是什么，方法是将阻断抗体注入心室3天，并在注射结束后1或4天牺牲小鼠。给予两种不同浓度的阻断抗体。高剂量（1μg/d）导致室管膜细胞层明显紊乱，心室内出现大簇NB(图7A类，B类)，不允许执行任何进一步的分析。注入低剂量的阻断抗体（100 ng/d）并不会对组织造成如此严重的破坏，尽管在LV内仍观察到一些NB簇。当Ki67阳性（增殖）细胞的百分比与正常生态位的百分比相比较时，治疗后第4天发现显著增加（18.6±4%，而注入SEZ的同种抗体占总细胞的13.0±5%；第页<0.05（使用单向方差分析）。阻断整合素-β1后，几乎只在高Sox2表达细胞群体中观察到增殖细胞百分比的增加。Sox2-high/Ki671+细胞占正常生态位总细胞的1.9±1%，使用β1整合素阻断抗体4d后增加到4.8±2%(第页<0.05使用t吨测试）。相反，Sox2-low/Ki67+细胞的百分比没有显著变化：正常生态位中细胞总数的11.1±2.4%，第4天时为13.7±2.7(第页=0.54使用t吨测试）。正常SEZ中，As～85%的分裂细胞是表达Dcx和低水平Sox2的神经母细胞（补充图8，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），而表达高水平Sox2的其他15%主要是TaP（NSC和室管膜细胞也是Sox2高表达细胞，它们只是偶尔分裂或静止）（补充图8，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），我们得出结论，大多数增加的增殖存在于TaP细胞中。由于β1整合素表达缺乏，我们可以预测，增殖星形胶质细胞的数量没有增加（在正常和注入的小生境中，其数量均小于总细胞的0.5%）。因此，这些结果证实了β1整合素在调控经济特区TaP增殖中的作用。他们还显示了迁移表型，心室内侧的Dcx阳性细胞和增殖细胞增加(图7)通常只有很少的迁移细胞。

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阻断β1整合素的作用。A、 B、D在侧脑室中注射β1整合素阻断抗体3 d，导致心室壁破裂，心室内出现Dcx+成神经细胞簇(A类)和心室底部（箭头位于D类)以及心室壁突起(B类)由GFAP+星形胶质细胞和分裂细胞（Ki67+）组成。C–F类，此外，它导致内侧增殖细胞的出现增加（图中箭头C类，D类); 这些细胞主要是Dcx+神经母细胞[E类和F类显示心室内侧壁的高倍放大率，与图中所示部分相邻C类和D类分别为；请注意，中Dcx+细胞（红色）的数量增加了F类]. 比例尺，50μm。

讨论

干细胞在其生态位中的准确位置对细胞行为的调节至关重要，因为它将决定干细胞暴露于哪些细胞外线索。在SEZ神经源性生态位的情况下，心室（脑脊液、室管膜层）和血管系统都参与了神经发生的调节(Sawamoto等人，2006年;Mirzadeh等人，2008年;沈等，2008;Tavazoie等人，2008年). 与此相一致，我们的分析表明，与非神经源性区域相比，发生神经源性的脑室周围区域的血管生成量显著增加，这是由于靠近脑室的血管网络穿透所致。壁龛血管系统的这种专门化可能不仅对稳态神经发生（即未受损CNS中的转换）非常重要，而且对损伤后的再生反应也非常重要，自从先天性小胶质细胞和血管来源的浸润性T细胞介导的炎症被证明调节NSC和前体行为以来(Pluchino等人，2008年;Ekdahl等人，2009年). 然而，有趣的是，在3D SEZ微环境中，正常组织和再生组织中有丝分裂细胞的分布与血管没有紧密联系，NSC或前体细胞在距离血管<5μm到>30μm的不同距离进行有丝分裂。这并不是说神经干细胞不接收来自血管的信号，因为先前的研究表明，星形胶质细胞的精细过程可以延伸相当长的距离来接触血管(Mirzadeh等人，2008年). 然而，随着与心室壁的距离成为一个强大的限制因素，所有有丝分裂活动都被限制在靠近心室的20μm厚的区域内，我们得出结论，室管膜细胞层产生的信号在调节稳态和再生生态位中干细胞和前体细胞的有丝分裂活动方面，可能至少与血管系统一样重要。

这些信号的性质仍有待确定，因为之前只确定了少数可能的室管膜衍生的神经发生调节因子，如色素上皮衍生因子(Ramírez-Castillejo等人，2006年)和骨形态发生蛋白途径的分子(Lim等人，2000年;Colak等人，2008年). 有趣的是，为了支持室管膜细胞为神经发生提供关键信号的假设，在非神经源性脑室周围区域观察到一层额外的星形细胞突起与室管膜平行。因此，只有在神经发生区内，室管膜下区域才由室管膜细胞单层与心室分开。此外，室管膜细胞的特定亚型（如E2双髂细胞）仅在心室壁的神经源性区域观察到(Mirzadeh等人，2008年). 然而，室管膜细胞在成年神经干细胞调节中的可能作用仍存在争议，因为海马神经发生发生在一个没有室管膜神经元的小生境中(Riquelme等人，2008年)，尽管一种通过与经济特区不同的中间祖细胞产生不同类型的神经元(Seaberg和van der Kooy，2002年;Seri等人，2004年). 因此，在未来，将这种结构研究扩展到其他中枢神经系统生态位，并在分析中包括其他细胞类型，如小胶质细胞，这些细胞类型已被证明调节神经元祖细胞的行为，将是非常重要的(Walton等人，2006年).

先前的实验工作表明，SEZ富含ECM分子，如纤维连接蛋白、层粘连蛋白β1和γ1(Mercier等人，2002年)，硫酸软骨素蛋白多糖(托马斯等人，1996年;秋田等人，2008)和tenascin-C(Peretto等人，2005年;de Chevigny等人，2006年;Kazanis等人，2007年). 在这里，我们表明神经干细胞和前体细胞暴露于生态位内许多额外的层粘连蛋白链的高水平，包括层粘连素α5。层粘连蛋白对神经元祖细胞的增殖和存活至关重要(Barnabé-Heider等人，2005年;霍尔等人，2008年)以及海马再生(Grimpe等人，2002年)并调节经济特区的生长因子浓度(Kerever等人，2007年). 此外，最近体内研究表明，血管内皮细胞和其他来源产生的层粘连蛋白，尤其是层粘连素511（α5β1γ1三聚体），在皮肤成体干细胞的调节中发挥作用(Paquet-Fifield等人，2009年)和胰腺(Otonkoski等人，2008年).体外工作还证明了α5层粘连蛋白在胚胎干细胞存活和增殖中的作用(Yoshihara等人，2007年;Domogatskaya等人，2008年;Evseenko等人，2009年;Vuoristo等人，2009年). 因此，层粘连蛋白可能在SEZ内成人NSC的调节中发挥重要作用。

我们的实验表明至少有三种不同来源的层粘连蛋白。前体细胞消融后，壁龛层粘连蛋白含量显著降低，这表明NSC谱系细胞是这些分子的主要来源之一。相反，在AraC治疗后，室管膜细胞和血管周围的层粘连蛋白免疫染色保持稳定，表明这两个额外的含源细胞都不受抗核分裂治疗的影响(Doetsch等人，1999年)-不依赖于前体的存在而产生层粘连蛋白。最后，经AraC治疗后，SEZ实质层粘连蛋白β1的表达得以保留，并与星形胶质细胞胞体和突起共定位，这表明SEZ星形胶质细胞可能是第四个来源，表现出只有在损伤后才会出现的层粘连素的细胞型特异性表达模式。

NSCs和前体如何与来源于生态位所有细胞成分的ECM相互作用？我们发现神经干细胞和前体细胞表达不同水平的层粘连蛋白受体，后者表达高水平的α6β1整合素、syndecan-1和路德兰，而前者不表达这些相同受体的可检测水平。特别是β1整合素，在通过Sox2和β1整合素的表达水平对SEZ细胞进行FACS分离后，通过神经球生成分析证实了这一结果。β1整整素以前被确定为活跃分裂神经祖细胞的标志物(Campos等人，2004年;Nagato等人，2005年;霍尔等人，2006年). 因此，我们认为ECM受体（如α6β1整合素）的表达可能是神经干细胞用来调节其活性的机制(图8). 尽管NSCs和前体存在于相似的生态位领域(Mirzadeh等人，2008年)因此，在正常条件下，神经干细胞与其微环境的相互作用有限（由于受体表达较低），因此保持相对静止。在β1整合素阻断实验中，对NSC行为没有任何影响，这一结论得到了支持。当神经干细胞受到刺激变得活跃，在AraC输注后补充耗尽的生态位时，它们相对于心室和血管系统的位置保持不变，但它们上调α6β1整合素、路德兰和syndecan-1的表达，从而增加它们与细胞和细胞外环境的相互作用(图8). β1整合素已被证明能介导与层粘连蛋白511的相互作用(Otonkoski等人，2008年;Evseenko等人，2009年;Vuoristo等人，2009年)而路德兰是层粘连蛋白α5特异性受体(Rahuel等人，2008年). Syndecan-1以前被证明可以促进乳腺癌细胞的增殖(Blaess等人，2004年)并增强FGF2活性(Filla等人，1998年)通过旁分泌活动，在某些情况下与整合素协同发出信号(Banerjee等人，2006年). 成人神经干细胞活性水平与层粘连蛋白-整合素相互作用改变之间的相关性令人想起最近在卵泡干细胞生态位中的发现果蝇属卵巢(O'Reilly等人，2008年)毛囊干细胞通过两步过程自主控制其自我更新行为：首先通过产生层粘连蛋白，其次通过上调整合素表达。

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正常和再生SEZ中的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用。在正常壁龛（左）中，室管膜细胞、血管和前体产生层粘连蛋白（橙色轮廓）并表达层粘连素受体（蓝色和红色星），而神经干细胞不表达可检测到的层粘连肽受体水平。TaPs和NBs耗竭后（由AraC治疗第0天，中间），除了NSC产生的层粘连蛋白β1和与血管和室管膜细胞相关的层粘联蛋白外，生态位微环境中的层粘着蛋白立即耗竭。此外，神经干细胞上调syndecan-1和lutheran的表达。两天后（第2天，右），当神经干细胞有丝分裂以再生生态位时，神经干细胞上的β1整合素表达也上调，可能调节增殖以及与相邻层粘连阳性细胞的相互作用。BV，血管；E、 室管膜细胞。

β1整合素在活化的神经干细胞和前体细胞上的作用是什么？抗体阻断β1整合素活性后前体增殖增加，与之前抗体阻断α6整合素后获得的结果相似(沈等，2008)提示整合素的一个重要功能可能是控制活跃分裂细胞的增殖水平。在这里，观察到高水平Sox2表达的细胞增殖增加，表明受影响的人群是TaP而不是NB，但进一步使用特定TaP标记物，如Mash1和Olig2(哈克等人，2005年)以及活化的NSC和TaP的细胞表面标记物，如EGF受体(Pastrana等人，2009年)将被要求对此进行确认。在肠成体干细胞生态位中，β1整合素的扰动也导致祖细胞增殖增加，部分原因是Shh信号缺陷(Willaime-Morawek等人，2006年). 整合素功能的另一个方面是控制细胞迁移，研究表明，β1整合素的基因缺失或阻断会导致嘴侧迁移流结构的破坏(Blaess等人，2004年)以及NB迁移的改变(埃姆斯利和哈格，2003年). 与此一致，我们发现阻断β1整合素导致左室内侧NB异位迁移增加。

总之，我们的描述性和功能性研究强调了SEZ细胞和细胞外结构在调节干细胞行为方面的三个重要特性：第一，有丝分裂细胞与室管膜细胞的距离比血管更近；第二，在NSC激活和生态位再生期间，这种结构缺乏变化；第三，神经前体细胞产生自己的ECM微环境，其相互作用取决于激活状态和受体表达水平的变化。认识到室管膜细胞可能是除血管外调节NSC行为的重要信号源，并且NSC在成功再生过程中改变其与微环境的相互作用不是通过接触不同的ECM，而是通过改变其受体表达，在再生医学和任何移植神经干和前体细胞（进入退化区域）的尝试中都具有重要意义，同时为它们提供保持自我更新能力和促进修复所需的信号。

脚注

J.D.L.得到了美国国立卫生研究院（NIH）剑桥研究生合作计划的支持。B.L.P.得到了NIH（NS40759）和国家科学基金会（9876771）的资助。C.ff.-C.由威康信托基金会和医学研究理事会支持。这项工作得到了美国国立卫生研究院-美国国家生物医学成像和生物工程研究所量子赠款项目（1P20EB00706）和美国国家老龄研究所院内研究计划的支持。我们感谢Badrinath Roysam博士分享FARSIGHT软件，感谢L.Sorokin博士（瑞典隆德隆德大学）和J.Miner博士（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）提供的抗体。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会