去除遮蔽素成分绕过RNAi进行着丝粒周围异染色质组装

消除Poz1绕过RNAi实现中心周围异染色质功能

为了证实Poz1的缺失确实可以恢复RNAi突变体的中心周围异染色质，我们构建了一个poz1Δdcr1Δ含有otríura4⁺.系列稀释分析证实：poz1Δdcr1Δ在不含尿嘧啶的培养基上生长较弱，但在含有FOA的培养基中生长强劲(图1A). 染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明poz1Δdcr1Δ细胞，着丝粒周围的异染色质标记dh公司重复序列，如H3K9me2和Swi6，恢复到接近野生型水平(图1B、C). 此外，ChIP分析表明Pol II被强烈排除在中心周围重复序列之外(图1D)表明异染色质形成于poz1Δdcr1Δ细胞能够沉默转录基因。

着丝粒周围异染色质是积累高水平凝集素所必需的，凝集素对有丝分裂期间的染色体分离至关重要(Bernard等人2001;Nonaka等人，2002年;Yamagishi等人，2008年). 异染色质受损时，如dcr1Δ，凝集素的丢失导致微管对着丝粒的附着缺陷，以进行生物定向。因此，细胞对微管毒素噻菌灵（TBZ）非常敏感(Hall等人，2003年;Volpe等人，2003年). 在poz1Δdcr1Δ通过凝集素亚基Rad21-Flag的ChIP分析测定的凝集素定位细胞和TBZ敏感性均得到了显著的挽救(图1A、E). 综上所述，这些结果表明着丝粒周围异染色质形成于poz1Δdcr1Δ细胞具有调节染色体分离的功能。

绕过RNAi需要在中心周围区域的RNAi非依赖性异染色质组装途径

在裂变酵母中，除了Dicer外，RNAi途径还涉及几个不同的复合物(Goto和Nakayama 2012). 我们还发现poz1Δ修复消音缺陷otríura4⁺和所有测试的RNAi突变体的TBZ敏感性，如RITS中的突变体(ago1Δ和chp1Δ)和RDRC(rdp1Δ) (图2A). 然而，poz1Δ无法挽救参与组蛋白修饰或识别的异染色质突变体的沉默缺陷和TBZ敏感性，例如clr4Δ,swi6Δ，或clr3Δ(图2B)这表明组蛋白修饰仍然是细胞内着丝粒周围异染色质组装的关键poz1Δdcr1Δ细胞。

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图2。

消除Poz1会绕过整个RNAi途径，但不会绕过组蛋白修饰，从而实现中心周围异染色质的组装和功能。(A类,B类)在指定培养基上生长的指定酵母菌株的十倍系列稀释分析，以测量otrŞura4型⁺以及对TBZ的敏感性。

在着丝粒周围区域异染色质的建立和维持都需要RNAi(Sadaie等人，2004年). 要区分是否poz1Δdcr1Δ我们介绍了拯救异染色质的维护或建立otrŞura4型⁺处于静默状态（来自野生型细胞）或停止状态（来自clr4Δ单元格）到poz1Δdcr1Δ遗传杂交细胞(图3A). 有趣的是，poz1Δdcr1Δ细胞有效保持沉默otríura4⁺当它从野生型细胞遗传而来，但当它从clr4Δ单元格(图3B). H3K9me2的ChIP分析也证实了这一结论(图3B).

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图3。

消除Poz1可以绕过RNAi维持着丝粒周围异染色质，但不影响其建立。(A类)实验设计示意图检查异染色质的维持和建立。(B类,C类,左边)对指定酵母菌株进行十倍系列稀释分析，以测量otríura4⁺. (赖特)H3K9me2水平的ChIP分析尿酸4⁺或中心周围dh公司重复，规格化为行为1数字是三个实验的平均值，误差条代表标准偏差。

在RNAi突变体中，尽管报告基因的沉默完全消失，但中心周围重复序列中仍保留大量H3K9me(图3C;Sadaie等人，2004年). 组蛋白脱乙酰化酶Clr3和Sir2与RNAi协同作用，在中心周围重复序列中建立异染色质，H3K9me2在clr3Δdcr1Δ和sir2Δdcr1Δ单元格(Yamada等人，2005年;Alper等人，2013年;Buscaino等人2013;Marina等人，2013年). 结果是poz1Δdcr1Δ细胞保持原有的异染色质，但未能重新建立异染色素，这表明残留的H3K9medcr1Δ单元格对于poz1Δdcr1Δ细胞保持着丝粒周围异染色质。事实上，两者都不是poz1Δdcr1Δclr3Δ也不是poz1Δdcr1Δsir2Δ细胞可以保持沉默otríura4⁺或中心周围重复的H3K9me水平(图3C)表明RNAi非依赖性途径对poz1Δdcr1Δ细胞保持着丝粒周围异染色质。

其他遮蔽蛋白成分的消除也绕过RNAi进行中心周围异染色质组装

Poz1是端粒相关保护蛋白复合物的成员(Miyoshi等人，2008年)保护染色体末端不被识别为DNA损伤部位，并防止复制过程中DNA丢失(Palm and de Lange 2008年;Jain和Cooper 2010). 端粒DNA由短串联DNA重复序列和单链悬垂组成(图4A). 在裂变酵母中，Taz1（哺乳动物TRF1/2的同源物）与dsDNA重复序列结合(Cooper等人，1997年)，并且Pot1–Tpz1复合物（与哺乳动物Pot1–TPP1同源）与ssDNA悬挑结合(鲍曼和切赫2001;Miyoshi等人，2008年). Rap1和Poz1构成了连接Taz1和Pot1–Tpz1复合体的桥梁(Miyoshi等人，2008年). Pot1–Tpz1与Ccq1联合招募端粒酶Trt1，后者使用相关RNA作为模板来延长端粒悬挑(Nakamura等人，1997年;Miyoshi等人，2008年;富田和库珀2008;Moser等人，2011年;Yamazaki等人2012). 通过ChIP分析，我们发现Poz1如预期的那样在端粒富集，但在中心周围重复序列中未检测到，即使在dcr1Δ单元格(图4B). 此外，Northern杂交分析表明，在poz1Δdcr1Δ单元格(图4C)表明Poz1通过RNAi非依赖性机制间接调节着丝粒周围异染色质组装。

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图4。

其他遮蔽蛋白成分的消除也绕过RNAi进行中心周围异染色质组装。(A类)端粒复合体示意图。(B类)亚中心区和近中心区Poz1-Flag水平的ChIP分析。这些数字是三个实验的平均值，误差线代表标准偏差。(C类)来源于中心体周围的siRNA的Northern blot分析dh公司重复。(D类)将所示酵母菌株的十倍系列稀释液培养在所示培养基上，以测量otríura4⁺以及对TBZ的敏感性。这个trt1Δdcr1Δ和ccq1-T93A dcr1Δ细胞是新鲜发芽的，以避免衰老相关的端粒重排。

因为我们筛选出的绕过RNAi的突变体也一直被确认rap1Δ（补充表S1），我们测试了其他庇护蛋白突变体的行为是否类似。我们发现了rap1Δ,taz1Δ、和ccq1Δ还挽救了RNAi突变体的缺陷otríura4⁺沉默和TBZ敏感性(图4D; 补充图S3）。同样，rap1Δdcr1Δclr3Δ和taz1Δdcr1Δclr3Δ未能保持着丝粒周围异染色质沉默（补充图S4），表明需要RNAi非依赖性着丝粒附近异染色素途径。相反，trt1Δ和accq1-T93A型突变体，减弱Trt1向端粒的募集(Moser等人，2011年;Yamazaki等人，2012年)，对该过程没有影响(图4D). 我们推断ccq1Δ和ccq1-T93A型因为Ccq1也是参与端粒沉默的SHREC复合体的一部分(Sugiyama等人，2007年;Motamedi等人，2008年)，不受ccq1-T93A型突变(Moser等人，2011年;Yamazaki等人，2012年). 与这个想法一致，我们还发现sde2Δ导致端粒沉默的选择性缺失(Sugioka-Sogiyama和Sugiyama 2011)，能够绕过RNAi以形成中心周围异染色质（补充表S1；图4D). Pot1和Tpz1是端粒末端保护所必需的。因此，电位计1Δ或tpz1Δ细胞很快失去端粒，只能通过使所有三条染色体循环来生存(鲍曼和切赫2001;Miyoshi等人，2008年). 尽管如此，着丝粒周围异染色质在电位计1Δdcr1Δ和tpz1Δdcr1Δ单元格，如所示otríura4⁺沉默和TBZ敏感性(图4D).

遮蔽素调节端粒异染色质的能力是绕过RNAi的关键

绕过RNAi的端粒相关突变体的常见表型之一是它们都会影响端粒沉默(Cooper等人，1997年;Nimmo等人，1998年;Kanoh和Ishikawa 2001;Sugiyama等人，2007年;Moser等人，2009年). 然而，遮蔽素使异染色质聚集成核的机制尚不清楚。由于Taz1和Pot1对庇护素募集独立起作用，因此很难检测这些因子在天然端粒募集的顺序。我们构建了与Gal4 DNA结合域（Rap1-GBD）在其内源性染色体位置融合的Rap1。Rap1-GBD足以在具有邻近Gal4结合位点的报告基因处诱导异位异染色质组装(每侧3 GB⁺)在Swi6轻度过度表达的条件下（补充图S5）。沉默取决于Poz1而非Taz1(图5A)这表明Poz1在端粒异染色质组装中作用于Taz1和Rap1下游。

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图5。

保护素介导的端粒沉默缺失是绕过RNAi进行中心周围异染色质组装所必需的。(A类)将所示酵母菌株的十倍系列稀释液培养在低腺嘌呤培养基上，以测量每侧3 GB⁺. (B类)Western blot分析用于测量Poz1-myc蛋白水平。(C类)进行Southern blot分析以测量端粒长度。基因组DNA用EcoRI酶切，端粒重复序列作为探针。（*）控制波尔1碎片。(D类,E类)将所示酵母菌株的十倍系列稀释液培养在所示培养基上，以测量TELбura4电话⁺H3K9me2水平的ChIP分析尿酸4⁺或中心周围dh公司重复，标准化为行为1数字是三个实验的平均值，误差条代表标准偏差。

为了区分端粒长度控制和端粒沉默在绕过RNAi中的作用，我们在内源性poz1（poz1）基因座，并筛选特异性影响端粒沉默而不影响端粒长度稳态的突变（补充图S6）。最后，我们分离出一个对Poz1蛋白水平没有影响的W209A突变，如Western blot分析所示(图5B)Southern blot分析表明，对端粒长度稳态几乎没有影响(图5C). 然而，它在Rap1-GBD介导的异染色质组装中引起缺陷，如poz1Δ单元格(图5A). 我们还测试了poz1-W209A型端粒附近的沉默。由于多种途径协同调节端粒异染色质的组装，包括遮蔽素、RNAi（通过细胞内的重复序列）tlh1型⁺基因）和TAS的未知机制(Kanoh等人，2005年)，我们使用了尿酸4⁺报告者在微小染色体上插入近端粒重复序列(TELбura4电话⁺) (Nimmo等人，1994年)缺乏tlh1型⁺基因和TAS，使遮蔽素在沉默中的作用更加明显（补充图S7）。的确，poz1-W209A型导致该记者失去了强烈的沉默，同时在该位置失去了H3K9me，其程度与poz1Δ和clr4Δ单元格(图5D). 值得注意的是，poz1-W209A型还挽救了心脏周围异染色质的组装dcr1Δ单元格(图5E)，如在otríura4⁺报告人和H3K9medh公司重复。因此，端粒沉默受损是保护素缺失拯救与RNAi突变体相关的中心周围异染色质组装缺陷的原因。

抑制RNAi突变体沉默缺陷的突变筛选

如前所述，在Singer RoToR HDA钉扎机器人的帮助下，将查询菌株与裂变酵母缺失库进行配对(Roguev等人，2007年). 裂变酵母缺失文库是用KanMX4公司对基因素产生耐药性的盒（Bioneer）。两株报告菌株(otríura4⁺或otríade6⁺)通过插入国家MX6在着丝粒I异染色质的右侧边界有约400个碱基对（bp）的暗盒，对诺色霉素具有抗性。这个dcr1Δ和ago1Δ查询菌株是用hphMX6型盒，赋予潮霉素抗性。这个otríura4⁺或otríade6⁺记者和dcr1Δ将其依次导入缺失文库，并选择产生的单倍体细胞并固定在选择性培养基上，以测量细胞生长或菌落颜色。

ChIP分析

如前所述进行ChIP分析(Hou等人，2010年). 使用的抗体为H3K9me2（Abcam）、Swi6(Reddy等人，2011年)、Pol II（Covance）、myc（Covance）和Flag（Sigma）。在ABI 7300实时PCR系统中使用Maxima SYBR Green qPCR主混合液（发酵剂）进行定量实时PCR（qPCR）。使用DNA系列稀释液作为模板，生成每对引物的标准扩增曲线，并相应地计算目标序列的相对浓度。安行为1以片段为参考，计算每个靶序列的ChIP相对于全细胞提取物的富集度。根据安捷伦酵母ChIP-on-ChIP分析协议进行ChIP芯片分析。使用的微阵列是安捷伦S.pombe公司全基因组ChIP-on-ChIP微阵列（G4810A），带有包含着丝粒的额外探针，由于这些DNA序列的重复性，最初阵列中没有着丝粒。

RNA分析

根据制造商的方案，使用MasterPure酵母RNA纯化试剂盒（Epicenter）从对数期细胞中分离出总细胞RNA。使用Power SYBR Green RNA-to-CT一步法试剂盒（Applied Biosystems）进行实时RT-PCR定量。以RNA系列稀释液为模板，生成每对引物的标准扩增曲线，并据此计算目标序列的相对浓度。安行为1碎片用作标准化样品浓度的参考。野生型中每个目标基因的浓度被任意设置为1，并作为其他样本的参考。如前所述进行siRNA的Northern印迹(Reddy等人，2011年).

我们感谢中山俊一、罗宾·奥尔希尔、迈克尔·基奥和中村彻提供的酵母菌株、质粒和抗体，以及艾莉森·科恩提供的技术援助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的支持，分别向S.J.和F.Q.拨款R01-GM085145和R01-GM098943。X.T.得到富布赖特学者计划的支持。B.R和S.P.K.得到了NIH培训拨款T32-GM008798的支持。F.Q.得到了Dimes March of Dimes颁发的Basil O'Connor Starter学者研究奖和美国心脏协会颁发的初始补助金的支持。