大肠腺瘤性息肉病（APC）抑癌基因的突变是大多数散发性结肠癌的早期步骤空气污染指数遗传性家族性腺瘤性息肉病（FAP）的突变导致该病的早期发病(青木和武藤2007;麦卡特尼和Näthke 2008)。APC定位于细胞膜、肌动蛋白细胞骨架、有丝分裂纺锤体和细胞核，以调节细胞极性、粘附、迁移和表观基因组的状态(2009年考德威尔和卡普兰;Lui等人，2012年;Hammoud等人，2013年)。APC还作为典型Wnt信号通路的负调控因子控制肠上皮细胞的稳态(Stamos and Weis 2013年)。在Wnt信号缺失的情况下，APC与Axin支架蛋白在蛋白水解酶破坏复合体中发挥作用，以控制β-catenin的周转，β-catentin是Wnt通路的转录辅激活子和细胞的核心亚单位：细胞粘附连接(Clevers and Nusse 2012年)。在这个复合物中，Axin通过S45的酪蛋白激酶1（CK1）和S33/S37/T41的糖原合成酶激酶3β（GSK3β）促进β-catenin磷酸化，从而产生Skp1/Cul1/F-box识别的磷酸化子βTrCP（βTrCP）E3泛素（Ub）连接酶复合物。磷酸化的β-连环蛋白随后从Axin转移到APC，APC将β-连环素磷酸化简并子从PP2A磷酸酶中屏蔽(Ha等人，2004年;Su等人，2008年)并促进其泛素化和降解。在信号细胞中，Wnt配体与Frizzled和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（Lrp5/6）细胞表面受体结合，并破坏βTrCP与Axin破坏复合物的结合(Li等人，2012年)或者，从Axin释放β-catenin(Kim等人，2013年)以防止破坏。新稳定的β-连环蛋白随后进入细胞核并与LEF-1/TCF HMG蛋白结合以激活典型Wnt靶基因，包括MYC公司，CCND1号机组、和AXIN2型(Valenta等人，2012年).
APC是一种多域支架蛋白，包含七个犰狳（ARM）重复序列、三个15-氨基酸重复序列（15Rs）、七个20-氨基酸重复片段（20Rs），一个连环蛋白抑制域（CID/片段B）、三个SAMP重复序列、一个EB1（末端结合蛋白-1）结合和微管附着位点，以及一个C末端PDZ结合域(Stamos and Weis 2013年)。APC突变体中CID的存在或缺失可能有助于将Wnt信号调节到对不同组织中肿瘤形成最有利的水平(Kohler等人，2009年)。大多数结肠癌表达含有15Rs和20R1但缺乏20R2-CID区域的APC C末端截断突变体。20R2-CID结构域高度保守，在β-catenin的APC定向蛋白水解中起关键作用(Roberts等人，2011年)。然而，β-catenin不与APC 20R2–CID结构域结合，其在蛋白水解中的功能尚不清楚。
在细胞-细胞粘附物连接处，β-连环蛋白与α-连环蛋白相互作用，α-连环蛋白将肌动蛋白细胞骨架连接到粘附复合体(Stamos and Weis 2013年)。与作为癌基因发挥作用的β-连环蛋白不同，α-连环素是乳腺癌和结肠癌的有效抑癌剂，其在侵袭性和晚期癌症中的下调或缺失与转移相关(Vasioukhin等人，2001年;本杰明和纳尔逊2008)。除了在细胞粘附中的作用外，α-连环蛋白还通过Wnt、Ras、NF-κB和Hedgehog途径抑制信号传导。最近的研究已经确定α-catenin在Hippo激酶级联中的关键作用(Schlegelmilch等人，2011年;Silvis等人，2011年)，通过Yes相关蛋白YAP1控制器官大小和细胞接触抑制。YAP1在许多信号系统中是一个有效的辅活化因子，也与TBX5复合物中的β-连环蛋白一起作用，以调节结肠癌中的抗凋亡基因(Rosenbluh等人，2012年)。在高细胞密度下，磷酸化的YAP1积聚在细胞质中，并被α-catenin隔离，抑制Wnt信号传导(Imajo等人，2012年)。YAP1同源物TAZ被APC复合体降解，是许多Wnt靶基因表达所必需的(Azzolin等人，2012年)。YAP1在TGFβ/SMAD信号转导中的作用机制研究进一步揭示，它既刺激转录，又促进靶基因上辅激活物和辅抑制物复合物的交换(Alarcón等人，2009年;Aragon等人，2011年)。因此，α-catenin将细胞粘附信号与YAP1失活和细胞增殖抑制联系起来。
在细胞核中，β-连环蛋白与LEF-1/TCF DNA结合蛋白相互作用，并通过一个独特的C末端激活域激活Wnt靶基因。β-catenin的N末端ARM重复序列与BCL9/Legless和Pygopus相关，后者是一种PHD指蛋白，结合H3K4me2并在靶基因启动子处促进H3K4me3(Clevers和Nusse 2012;Valenta等人，2012年)。我们之前的研究表明，APC在途径激活后也被招募到Wnt靶基因中，并调节β-catenin和TLE1/Gro辅阻遏物复合物的周期性交换(Sierra等人，2006年)。这种活性在APC突变的结肠癌细胞中丢失，全长APC的重新表达导致转录抑制、H3K4me3的丢失以及靶基因处LEF-1/TCF复合物中β-catenin的快速释放。由于APC与LEF-1竞争与β-catenin的结合，目前尚不清楚APC如何在体内选择性靶向Wnt应答元件（WRE）。
为了进一步了解APC在Wnt信号传导中的作用，我们使用多维蛋白识别技术（MudPIT）分析了几个Wnt调节复合物的组成。这里我们报道了α-连环蛋白与APC肿瘤抑制因子相关。这种相互作用是通过CID介导的，CID是结肠癌APC缺失的主要热点。重要的是，α-连环蛋白通过APC破坏复合物控制β-连环素的磷酸化和Ub依赖性蛋白水解。此外，我们发现α-连环蛋白与β-连环素结合到LEF-1/TCF DNA结合蛋白，并在与CtBP:LSD1的复合物中招募APC，以抑制转录并控制靶基因的β-连环素占用。慢病毒shRNA-介导的α-catenin敲除导致Wnt靶基因在人类胚胎干细胞（hESCs）信号传导中无法关闭，从而导致内胚层特异性基因的分化和上调。这些发现表明α-连环蛋白在APC调节的转录抑制和β-连环素的蛋白水解酶破坏中具有不可怀疑的作用。
结果
α-连环蛋白、β-连环素、APC和LEF-1/TCF复合物的MudPIT蛋白质组学分析
为了检测Wnt调节复合物的组成，分离稳定的HEK293细胞系，表达标记的人α-连环蛋白、β-连环素、LEF-1和TCF4，用于亲和纯化和MudPIT分析。由于APC的异位表达抑制细胞生长，我们使用了一个截短的Flag:APC（氨基酸1–2227）蛋白，该蛋白保留3x15R、CID、7x20R和SAMP重复序列。亲和纯化的Flag:APC（氨基酸1-2227）复合物的质谱分析(; 补充图S1A、B）显示了与CtBP复合物的强结合，包括CtBP、REST辅阻遏物1（RCOR1）和LSD1 H3K4me1/2脱甲基酶。此外，我们检测到GNB2L1/RACK1、α-连环蛋白（CTNNA1）、蛋白酶体亚单位和低水平的β-连环素（CTNNB1），但未检测到Axin。免疫印迹证实α-catenin、CtBP和LSD1与天然APC复合物的强结合().
α-连环蛋白与APC CID相互作用。(A类)亲和纯化Flag:APC复合物的MudPIT分析，来自HEK293细胞。(B类)使用抗血清对来自全细胞HEK293裂解物的天然APC复合物进行免疫印迹/co-IP分析正确的每个面板的。(C类)用控制特异性或β-连环蛋白特异性siRNA处理的HEK293细胞中天然APC复合物的免疫印迹/co-IP分析。(D类)用控制特异性或α-连环蛋白特异性siRNA处理的HEK293细胞中天然APC复合物的免疫印迹/co-IP分析。(E类)用控制特异性或α-连环蛋白特异性siRNA处理的HEK293细胞中天然β-连环素复合物的免疫印迹/co-IP分析。(F类)通过免疫印迹（co-IP）分析HEK293细胞中转染Flag:APC片段的因子相互作用位点定位。(G公司)通过免疫印迹（co-IP）分析转染Flag:APC框内缺失突变体对HEK293细胞进行因子相互作用位点定位。CtBP:LSD1和α-catenin的APC结合位点如示意图所示。
先前的研究在APC破坏复合体中检测到α-catenin(Su等人，1993年;Layton等人，2012年)，但尚不清楚其是否具有功能性作用。由于α-连环蛋白与APC的间接结合不能解释其在复合物中的流行，我们询问α-连环素与APC结合是否需要β-连环素。经对照siRNA处理的HEK293细胞的天然APC复合物中容易检测到α-连环蛋白和β-连环素()。令人惊讶的是，在相反的实验中，在α-连环蛋白敲低的细胞中，β-连环蛋白与APC的结合显著减少()而CtBP的结合不受影响。因此，α-连环蛋白选择性地稳定β-连环素与APC复合物的结合。类似地，α-catenin的缺失减少了APC和CtBP与β-catenin的关联()。与当前模型相反，这些数据强烈表明α-catenin有助于将β-catenin-栓系到APC破坏复合体。
尽管β-catenin可以通过3x15R或GSK3β-磷酸化7x20R结构域直接结合APC(Stamos and Weis 2013年)β-catenin破坏不需要3x15R结构域，而是由APC 20R2-CID结构域介导(Kohler等人，2009年;Roberts等人，2011年)。由于β-catenin不与20R2或CID直接相互作用，因此尚不清楚它是如何靶向APC复合体进行破坏的。
α-连环蛋白与APC CID相互作用
为了研究α-catenin如何识别APC，在HEK293细胞中表达部分重叠的Flag:APC片段，并通过共免疫沉淀（co-IP）分析其结合位点。如前所示，外源性表达的β-catenin与APC 3x15R和ARM结构域弱结合。然而，CtBP和LSD1与3x15R片段的结合更加紧密()因此可能排除β-catenin与内源性APC复合物中该位点的结合。值得注意的是，α-连环蛋白不识别3x15R片段，而是与包含20R1–R3重复序列和CID（氨基酸1237–1542）的相邻片段结合。进一步用包含野生型序列或3x15R、20R2或CID结构域精确帧内缺失的较大APC片段（氨基酸995–1551）进行映射，确定α-catenin识别62氨基酸CID基序，而CtBP、RCOR1和LSD1与3x15R结构域相互作用(; 补充图S1C，D）。在本实验中使用的严格条件下，我们没有检测到β-catenin与Flag:APC（氨基酸995–1551）的结合。我们得出结论，α-catenin以CID为靶点，有助于稳定β-catenin与APC复合物的结合。因为APC CID对β-连环蛋白泛素化和蛋白水解至关重要(Kohler等人，2009年;Roberts等人，2011年)这些发现强烈提示了α-catenin在破坏复合体中可能的功能作用。
α-连环蛋白调节β-连环素泛素化和蛋白水解
APC的一个关键作用是保护β-catenin磷酸化子免受PP2A磷酸酶的去磷酸化作用(Su等人，2008年)，通过保留βTrCP1的结合位点促进泛素化。为了确定α-连环蛋白是否参与这一过程，使用GSK3β抑制剂因子XV在HEK293细胞中瞬时诱导β-连环素(Atilla-Gockcumen等人，2006年)，并且在蛋白酶抑制剂MG132存在下提取因子XV后检测到泛素化蛋白。通过抗Ub免疫沉淀物的免疫印迹观察到高分子量Ub结合的β-连环蛋白复合物()。重要的是，天然β-catenin的泛素化在α-catenin-缺失细胞中受到强烈抑制，类似于在APC敲除细胞中观察到的情况。敲除APC或α-catenin也降低β-cateninS33磷酸化()。因此，α-连环蛋白在APC破坏复合物中发挥作用，促进β-连环素的泛素化。
α-连环蛋白通过APC破坏复合物促进β-连环蛋白的蛋白水解。(A类)用对照特异性（si-CTL）、α-连环蛋白特异性（siα-catenin）或APC-特异性（sic APC）siRNAs处理的HEK293细胞核提取物中的β-连环素和S33-磷酸化β-连环素的抗Ub免疫沉淀物的免疫印迹。在与每个siRNA孵育48小时后，用10 nM因子XV诱导β-catenin 12小时，并在含有MG132的新鲜培养基中孵育细胞，培养时间为所示时间在上面每条车道。(B类)用控制特异性或α-连环蛋白特异性siRNA处理HEK293细胞后转染Flag:β-连环素的免疫印迹和co-IP分析。如图所示，用HA-Ub共转染细胞并用MG132处理。(C类)半衰期的测量(吨1/2)核提取物中天然β-catenin的含量。HEK293细胞与CHX孵育指定时间，并转染所示的控制特异性（si-CTL）、α-连环蛋白特异性、APC特异性或βTrCP特异性siRNA。每个siRNA的敲除效率通过免疫印迹在底部面板（裂解液）。(D类)野生型和点突变型（T120A和Y142A）的免疫印迹/co-IP标记：β-catenin在HEK293细胞中表达。(E类)野生型和点突变型（T120A和Y142A）的免疫印迹/co-IP标记：β-catenin在HEK293细胞中表达。用HA-Ub共转染细胞并用MG132处理。(F类)野生型和点突变（T120A和Y142A）的TOP-FLASH报告基因分析标志：转染HEK293细胞中的β-连环蛋白活性。(G公司)半衰期的测量(吨1/2)核提取物中野生型和点突变Flag:β-连环蛋白的表达。将转染的HEK293细胞与CHX孵育指定时间。
为了证实这些发现，在用控制特异性或α-catenin-特异性siRNA处理的细胞中，用HA标记的Ub（HA-Ub）与Flag标记的β-catenin共同转染，并用抗HA抗体对Flag：β-catentin免疫沉淀物进行免疫印迹，观察泛素化蛋白()。重要的是，α-连环蛋白缺失细胞中HA-Ub结合的β-连环素水平显著降低。用磷酸特异性抗体进行的免疫印迹进一步显示，这些细胞中的β-catenin S33磷酸化降低，并与βTrCP1结合。这些数据表明，α-连环蛋白在一定程度上通过保护β-连环蛋白磷酸降解子和与βTrCP1的结合来促进泛素化。
为了确定α-连环蛋白是否影响β-连环素蛋白的稳定性，使用翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）阻断从头合成蛋白质。β-catenin在不同时间点的免疫印迹显示，HEK293细胞中天然蛋白的半衰期为～33分钟(; 补充图S2A）。有趣的是，α-连环蛋白的敲除延长了β-连环素的半衰期，其程度与在APC或βTrCP1缺失的细胞中观察到的相似，而β-连环素的稳定性不受对照siRNA的影响。免疫印迹证实了每种蛋白的敲减效率。我们得出结论，α-连环蛋白是APC调节的β-连环素泛素化和蛋白水解所必需的。
β-连环蛋白水解需要与α-连环素结合
α-连环蛋白与磷酸化子附近的β-连环素N末端（氨基酸118–146）结合(Stamos and Weis 2013年)。为了解决β-连环蛋白水解是否需要这种相互作用，我们在co-IP实验中确定了该区域（T120A和Y142A）中破坏与α-连环素结合的两个点突变()。这些蛋白与HA-Ub在MG132处理的细胞中的共表达表明，这两种突变都极大地削弱了β-连环蛋白的泛素化，而不影响整体蛋白表达()。此外，这些突变体在S33磷酸化和与βTrCP1结合方面存在缺陷()并且在TOP-FLASH报告试验中比野生型β-连环蛋白更活跃()。CHX处理细胞核提取物中Flag:β-catenin蛋白水平的免疫印迹分析显示，每个突变的半衰期显著高于野生型蛋白(; 补充图S2B）。因此，β-连环蛋白与α-连环素的结合对于APC复合物依赖于Ub的蛋白水解也是必要的。
Y177处的α-连环蛋白酪氨酸磷酸化破坏与APC的结合
同时，我们还绘制了与APC结合所需的α-连环蛋白的结构域。β-连环蛋白识别α-连环素N末端的α-螺旋基序（氨基酸117–143）(Huber等人，1997年)在co-IP实验中，我们发现α-连环蛋白（Δ氨基酸1–128）的N端截断消除了与β-连环素的结合()。有趣的是，该突变体保留了结合APC的能力，证实了α-连环蛋白可以独立于β-连环素结合APC。然而，进一步将α-连环蛋白截断为氨基酸189破坏了与APC的结合，表明β-连环素和APC识别α-连环素VH1结构域内的相邻位点。全球磷酸蛋白质组学数据库的检查(网址：http://www.phosphosite.org)表明该区域包括多个转化细胞系中α-catenin酪氨酸磷酸化（Y117）的主要位点。与这种可能性相一致的是，内源性α-连环蛋白免疫沉淀和纯化的Flag:HEK293细胞中的α-连环素组分可以用抗磷酸酪氨酸特异性抗体的免疫印迹检测到，并且信号被血清增强()。此外，该位点的点突变（Y177F）阻止了磷酸化，而不影响整体蛋白表达(，顶面板），磷酸化也被Src家族激酶抑制剂Dasatinib以剂量依赖的方式抑制(，底部面板）。因此，Y177是体内α-连环蛋白酪氨酸磷酸化的一个显著位点。
α-catenin的酪氨酸磷酸化调节与APC的结合。(A类)在10%血清中培养的HEK293细胞中使用在正确的每个面板的。(B类)野生型（WT）或Y177F突变Flag的免疫印迹：HEK293细胞中的α-catenin。(顶部面板）如有指示，细胞在0.1%（−）或10%（+）血清中培养24小时。(底部小组）用来自HEK293细胞（10%血清）的抗对-Tyr抗血清对天然α-catenin进行免疫印迹分析。按指示用达沙替尼处理细胞。人类α-catenin的结构域如底部. (C类)表达野生型（WT）或点突变型（Y177F）Flag:α-catenin的转染HEK293细胞中TOP-FLASH报告基因活性的抑制。如有指示，用β-catenin表达载体共同转染细胞。α-连环蛋白表达在正确的. (D类)野生型（WT）和Y177Fα-catenin对HCT116细胞内源性Wnt靶基因的抑制。用qRT-PCR测定mRNA水平。(E类)标记：α-catenin在HEK293细胞中表达的野生型和点突变体（Q176A、Y177F和K178A）的免疫印迹/co-IP。(F类)野生型和点突变（Q176A、Y177F和K178A）的TOP-FLASH报告基因分析标志：转染HEK293细胞中α-连环蛋白对β-连环素活性的影响。
为了研究酪氨酸磷酸化是否影响与APC的结合，对标记的α-连环蛋白野生型和Y177F蛋白进行了co-IP实验。值得注意的是，α-连环蛋白Y177F突变增强了与APC的结合，而不影响与β-连环素的相互作用()。因此，Y177磷酸化显著抑制HEK293细胞中α-catenin与APC的结合。为了支持这一发现，在TOP-FLASH报告分析中，Y177F突变体也是Wnt/β-catenin反式激活的更有效的阻遏物()内源性Wnt靶基因()。类似地，达萨替尼增强了α-catenin与APC的结合（补充图S3A）和转录抑制（补充图53B）。进一步分析表明，Y177、Q176（Q176A）附近残基的点突变，减少了co-IP实验中α-catenin与APC的结合，并破坏了体内转录抑制()。在细胞增殖测定中，异位α-连环蛋白Y177F强烈抑制细胞生长，而Q176A突变体则没有（补充图S3C）。K178突变（K178A）的影响不大。因此，α-连环蛋白Y177磷酸化破坏与APC的结合，并进一步增强转化细胞中β-连环素的反式激活。
Wnt3a信号细胞中α-连环蛋白与β-连环素结合到LEF-1/TCF复合物
我们之前发现APC伴随β-catenin靶基因关闭基因的转录和信号传导(Sierra等人，2006年)。由于β-catenin:LEF-1/TCF复合物不能直接结合APC，因此尚不清楚APC是如何针对WRE的。我们目前的研究结果表明，APC可以通过α-连环蛋白间接靶向β-连环素。虽然β-catenin被广泛认为是与LEF-1/TCF结合的单体，但在细胞核中检测到α-catenin，它是转化细胞中Wnt靶基因的有效阻遏物(本杰明和纳尔逊2008).
为了检查LEF-1/TCF和β-catenin复合物的组成，在缺乏和存在因子XV的情况下，从稳定的HEK293细胞系中亲和纯化Flag:β-catentin、Flag:LEF-1和Flag:TCF4复合物，以稳定和促进β-catening的核进入。纯化的复合物经过MudPIT，相互作用蛋白根据肽谱计数按相对丰度排序(; 补充图S4A）。在亲本HEK293细胞的模拟Flag免疫沉淀中检测到的非特异性蛋白质或在无关的Flag标记蛋白质的制备中检测到非特异性蛋白被排除在进一步考虑之外。Flag:β-catenin MudPIT数据集中的最高标记蛋白包括α-catenin、CTNNBIP1/ICAT抑制剂、钙粘蛋白、肌动蛋白细胞骨架蛋白、APC破坏复合物成分（APC、Axin1、GNB2L1/RACK1、GSK3β、CK1α1、CtBP1和CtBP2），以及HMG DNA-结合蛋白TCF7L2/TCF4和LEF-1(; 补充图S4A）。
β-连环蛋白将α-连环素：APC复合物招募到LEF-1/TCF复合物。(A类)亲和纯化Flag:β-catenin和Flag:LEF-1复合物的MudPIT分析，分别从不含和含100 nM因子XV的HEK293细胞中分离。图中所示为根据质谱法鉴定的肽总数和蛋白质序列覆盖率的百分位数对已鉴定的相互作用蛋白质进行丰度排序的子集。(B类)如图所示，对从未经处理和100 nM因子XV诱导的HEK293细胞分离的Flag:β-catenin、Flag:LEF-1和Flag:TCF4复合物进行SDS-PAGE和银染分析。(C类)Flag:LEF-1复合物的免疫印迹/共-IP分析，其从用对照特异性（si-CTL）、α-连环蛋白特异性或β-连环蛋白特异性siRNA转染的HEK293细胞亲和纯化。(底部面板）通过裂解物的免疫印迹分析每个siRNA的敲除效率。如有指示，用100 nM因子XV处理细胞4小时。(D类)Wnt3a信号HEK293细胞中天然LEF-1免疫沉淀物的免疫印迹时程分析。将细胞与Wnt3a条件培养基培养至指定时间。输入核部分的免疫印迹分析如底部面板。(E类)ChIP分析AXIN2型，DKK1（丹麦克朗），或SP5标准用Wnt3a条件培养基处理HEK293细胞中指定时间的基因。使用指定的特异抗血清测量WRE（黑色）或编码（灰色）区域的因子占有率在上面每个面板。条形图表示三次重复实验的平均值。
同时，从模拟处理或因子XV处理的细胞分离的亲和纯化Flag:LEF-1和Flag:TCF4复合物也接受MudPIT。正如预期的那样，β-catenin在从因子XV刺激细胞分离的Flag:LEF-1和Flag:TCF4组分中高度富集。然而，令人惊讶的是，这些组分还含有非常高水平的α-连环蛋白。相反，在LEF-1/TCF4复合物中未发现其他β-连环蛋白相互作用蛋白，包括CTNNBP1/ICAT和钙粘蛋白。与β-连环蛋白一样，在缺乏信号传导的情况下，在LEF-1和TCF4复合物中未检测到α-连环蛋白。引人注目的是，通过SDS-PAGE和银染色也可以观察到α-连环蛋白和β-连环素的近化学计量水平()免疫印迹证实了这种强烈的信号依赖性相互作用(; Flag:LEF-1和Flag:TCF4复合物的补充图S4B），从因子XV处理的细胞中纯化。在β-catenin击倒细胞中，α-catenin:LEF-1与Flag:LEF-1的关联被消除，而在相反的实验中，β-catentin:LEF 1的相互作用不受α-catentin击倒的影响()。因此，β-连环蛋白向Flag:LEF-1复合物招募高水平的α-连环素。
回收的多肽数量之多以及相应的银染带的强度表明，α-catenin存在于绝大多数组装的β-catenin:LEF-1/TCF复合物中。为了证实这些结果，我们分析了Wnt3a诱导的HEK293细胞中的天然LEF-1复合物。免疫印迹实验显示β-catenin:LEF-1/TCF复合物中α-catenin水平较高，这是Wnt3a诱导的反应()或系数XV（补充图S4B）。进一步分析表明，α-catenin存在于HEK293细胞的细胞核和细胞质中，并且与Wnt3a配体接触()或因子XV（补充图S4C）选择性增加细胞核中的β-连环蛋白水平，而不影响α-连环素的水平或亚细胞分布（补充图C4D）。此外，在HCT116结肠癌细胞的天然LEF-1复合物中发现高水平的α-连环蛋白（补充图S4E），其表达野生型APC和组成稳定的β-连环素蛋白。因此，α-catenin是Wnt3a信号细胞中β-catenin:LEF-1/TCF复合物的组成部分。
为了进一步探索APC复合物，我们还检查了亲和纯化的HEK293 Flag:α-连环蛋白复合物的组成（补充图S4F）。MudPIT分析检测到这些组分中的细胞粘附和细胞骨架蛋白、14-3-3蛋白、β-连环蛋白、γ-连环素、LEF-1、TCF4、CTNNBIP1/ICAT和APC（补充图S4F）。这些组分中β-catenin的水平远高于APC，这与HEK293细胞中α-cateninY177磷酸化破坏与APC结合的观察结果一致。然而，内源性APC可以在Wnt3a信号细胞免疫沉淀的LEF-1复合物中容易检测到().
β-连环蛋白将α-连环素招募到Wnt靶基因
在绝大多数Wnt3a诱导的LEF-1复合物中存在α-连环蛋白，这表明它可能与β-连环蛋白一起被募集到内源性Wnt靶基因中。Wnt3a信号HEK293细胞中的染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实了这种可能性。值得注意的是，α-连环蛋白和β-连环素结合的动力学与AXIN2型，DKK1（丹麦克朗）、和SP5标准Wnt3条件培养基培养细胞中的基因WREs()。APC也被招募到诱导基因中，而LEF-1在信号传导之前和之后都与WRE结合。此外，α-连环蛋白与β-连环素一起被招募到AXIN2型因子XV诱导的细胞WRE（补充图S4G）。APC、α-连环蛋白、β-连环素和LEF-1的ChIP信号仅在WRE处检测到，而在下游区域未检测到。因此，APC和α-catenin被招募到靶基因WRE，以响应Wnt3a信号。
α-连环蛋白将APC招募到Wnt靶基因
研究结果表明，α-catenin可能将APC导向β-catenin:LEF-1/TCF复合物，以终止该基因的转录，并介导辅激活物和辅抑制物复合物的交换。正如预期的那样，HEK293细胞中的α-catenin敲低诱导内源性Wnt靶基因(AXIN2型，DKK1（丹麦克朗）、和SP5标准)在不影响β-catenin mRNA水平的情况下（补充图S5A），并增加稳态β-catentin蛋白水平（补充图S5B）。与早期关于α-连环蛋白抑制Wnt/β-连环蛋白反式激活的报道一致(本杰明和纳尔逊2008)，异位α-catenin也以剂量依赖的方式抑制TOP-FLASH报告活性（补充图S5C）。
接下来，我们进行了一系列RNAi-ChIP实验，以研究这些因子是如何被招募到AXIN2型体内WRE。ChIP分析显示α-连环蛋白和β-连环素在AXIN2型HCT116结肠癌细胞中的WRE和α-catenin敲除细胞中β-catenin-占有率不受影响()。在相反的实验中，β-连环蛋白和α-连环素在AXIN2型β-catenin击倒细胞中的WRE降低，表明β-catentin将α-catenin-招募到DNA上的LEF-1/TCF复合物中。此外，β-连环蛋白或α-连环素的耗竭显著降低了APC在AXIN2型WRE公司()表明α-catenin在体内将APC招募到β-catenin:LEF-1复合物。在c-MYC公司HCT116细胞中的基因（补充图S5D，E）。重要的是，在软琼脂集落生长实验中，α-catenin、APC或LSD1的缺失显著增加了凤尾鱼非依赖性细胞的生长（补充图S5F），表明这些因素中的每一个都抑制HCT116细胞中的内源性Wnt信号。
α-catenin介导的Wnt靶基因抑制的RNAi-ChIP分析。(A类)RNAi-ChIP分析AXIN2型用控制特异性（si-CTL）、β-连环蛋白特异性或α-连环素特异性siRNA处理的HCT116细胞中的WRE（黑色）和编码区（灰色）。染色质免疫沉淀，显示抗血清在上面每个面板。(右下角面板）用免疫印迹法测定击倒效率。(B类)qRT-PCR分析表达空载体（灰色）或α-catenin（黑色）的稳定PC-3细胞系内源性Wnt靶基因mRNA水平。每个条形代表三个独立实验的平均值。(赖特面板）用免疫印迹法检测α-连环蛋白和β-连环素的表达。(C类)ChIP分析AXIN2型使用所示抗血清在对照PC-3（灰色）和α-catenin-表达（黑色）PC3细胞中的WRE在上面每个面板。
在α-catenin-null PC3转移性前列腺癌细胞中也检测了Wnt靶基因的调控。在这些细胞中重新表达α-连环蛋白（PC3-α-catenin）强烈增强细胞粘附并抑制细胞生长(Inge等人2008)。定量RT-PCR（qRT-PCR）实验证实Wnt靶基因受到广泛抑制(AXIN2型，KLK3号机组，cMYC公司，HMG1型，DKK1（丹麦克朗）、和CCND1号机组)PC3-α-catenin细胞与对照PC3细胞的比较()，而β-阳离子，E2F1系列、和MAML2号机组mRNA水平未受影响。ChIP实验表明，α-catenin恢复了APC和LSD1与AXIN2型WRE，伴有H3K4me3缺失和β-catenin占用率降低()。在cMYC公司PC3-α-catenin细胞中的WRE（补充图S5G）。重新表达的α-连环蛋白降低了核β-连环素蛋白水平，而不影响mRNA水平（补充图S5H）。此外，LSD1的敲除上调AXIN2型Wnt3a信号HEK293细胞中的mRNA水平（补充图S5I，左侧面板）。ChIP分析显示，LSD1入住率在AXIN2型WRE对Wnt3a信号的反应，以及LSD1的敲低降低了该基因的H3K4me2/3水平（补充图S5I，右图）。因此，α-catenin招募APC和LSD1在AXIN2型基因。
为了确定靶向WRE的APC域，野生型和突变型Flag：APC蛋白在DLD1结肠癌细胞中体外表达，并通过ChIP检测其与内源性AXIN2型WRE公司。DLD1细胞含有双等位基因空气污染指数表达缺乏CID的APC突变蛋白并组成性激活Wnt靶基因的截短。ChIP分析显示β-连环蛋白、α-连环素和LEF-1与AXIN2型这些电池中的WRE（补充图S5J）。如前所述(Sierra等人，2006年)，新表达的标志：APC快速绑定到AXIN2型WRE和ChIP可以使用抗标记抗体轻易检测到。有趣的是，Flag:APC（氨基酸1–1551）突变体保留了CID并可以抑制Wnt/β-catenin反式激活（补充图S5K），有效地针对轴2WRE公司。相反，较短的Flag:APC（氨基酸1–832）突变体缺乏CID并且不能抑制β-catenin活性（补充图S5K），它没有与AXIN2型基因（补充图S5J）。因此，α-catenin和CID都是将APC靶向AXIN2型体内WRE。
APC和α-连环蛋白调节Wnt靶基因的β-连环素转换
接下来我们研究了α-catenin是否像APC一样影响β-catenin-AXIN2型撤销因子XV后。ChIP实验显示，RNA聚合酶II（RNAPII）Ser5P在AXIN2型β-catenin诱导前HEK293细胞中的基因启动子（补充图S6A），表明存在暂停或无效延长的RNAPII复合物。基因激活伴随着启动子和轴2编码区域。因子XV的退出导致β-catenin和磷酸化RNAPII的快速丢失，而LEF-1仍与WRE结合。此外，α-catenin和APC在发出信号后被招募到该基因中，并在因子XV退出后迅速释放。
值得注意的是，α-连环蛋白的敲除强烈延迟了β-连环素从轴2因子XV提取后的基因()。此外，组蛋白H2Bub、H3K4me3和RNAPII-Ser2P延伸复合物水平在这些细胞中保持较高水平，尽管撤回了诱导剂。β-catenin和相关辅活化子在AXIN2型WRE与α-连环蛋白击倒细胞中泛素化的丧失和β-连环素蛋白稳定性的增加相一致().
α-连环蛋白和APC控制Wnt靶基因的β-连环素占用。(A类)RNAi-ChIPAXIN2型用控制特异性（灰色）或α-连环蛋白特异性（黑色）siRNA转染HEK293细胞中的WRE。在提取因子XV并在新鲜培养基中培养指定时间之前，用20 nM因子XV模拟处理（M）或刺激细胞12小时在下面每个面板。显示了用于ChIP的抗血清在上面每个面板。组蛋白H3作为输入进行测量。(B类)使用在正确的每个面板的。如有指示，在提取细胞并在含有或不含MG132的新鲜培养基中培养之前，用20 nM因子XV诱导细胞12小时。使用HA特异性抗体检测泛素化蛋白。使用β-连环蛋白S33特异性抗体检测磷酸化β-连环素（P-β-catenin）水平。(C类)HEK293细胞核提取物抗Ub免疫沉淀物中天然β-连环蛋白的免疫印迹。用20 nM因子XV诱导β-catenin蛋白12 h，然后提取并在新鲜培养基中孵育（含或不含MG132），孵育时间为指定时间。(D类)纯化Flag的免疫印迹/co-IP：从HEK293细胞分离的LEF-1复合物，经控制特异性（si-CTL）、APC-特异性（si APC）或βTrCP特异性（siβTrCP）siRNA处理。用因子XV诱导细胞，如C类通过免疫印迹法评估siRNA敲除效率底部面板（输入）。(E类)纯化Flag的免疫印迹/co-IP分析：如图所示，从转染了控制特异性（si-CTL）或α-连环蛋白特异性（siα-catenin）siRNA的HEK293细胞中分离出的LEF-1复合物。细胞被模拟处理（M）或用因子XV诱导，如C类通过免疫印迹法评估siRNA敲除效率底部面板（输入）。
我们还注意到，在co-IP实验中，因子XV的退出诱导了Flag:LEF-1复合物中α-连环蛋白和β-连环素的快速释放（补充图S6B）。用MG132处理这些细胞阻止了Flag:LEF-1珠中α-连环蛋白和β-连环蛋白的释放，伴随着β-连环蛋白S33磷酸化的增加和假定的泛素化，如HA-Ub标记蛋白的免疫印迹所示()。抗Ub免疫沉淀物的β-连环蛋白免疫印迹证实这些组分中存在高水平的泛素化β-连环素()。因此，APC破坏复合物可能调节α-连环蛋白：β-连环素：LEF-1复合物的分解。与这种可能性一致，APC或βTrCP1的敲除阻止β-catenin:Flag:LEF-1复合物的分离()与用对照siRNA处理的细胞相比。最重要的是，在缺乏α-连环蛋白的细胞中获得了相同的结果()。因此，α-catenin与APC和βTrCP1一起作用，调节可溶性部分和染色质中的β-catenin:LEF-1复合物水平AXIN2型WRE公司。
α-catenin敲除延长Wnt信号传导并促进hESC内胚层分化
转化细胞中的细胞黏附复合体经常被破坏，导致α-连环蛋白和β-连环素在细胞质和细胞核中的积累水平显著高于原代细胞中的水平。因此，我们询问α-catenin和APC是否也存在于hESCs中的Wnt增强子复合物中，Wnt增效复合物通过Wnt3a配体或GSK3β抑制剂诱导分化为中胚层和内胚层细胞命运(Wray和Hartmann，2012年)。如所示用Wnt3a配体或因子XV治疗H1-hESCs强烈诱导典型Wnt靶基因(AXIN2型和SP5标准)随后是内胚层标记基因的延迟激活(CRCX4系列，SOX17标准、和FOXA2公司)48小时亚细胞分馏分析显示，β-连环蛋白和α-连环素主要定位于这些细胞的细胞质和细胞膜，而LEF-1为核，APC分布于细胞质和核部分（补充图S7A）。与转化细胞中的情况不同，细胞核中的β-连环蛋白和α-连环素水平较低，与因子XV孵育4小时后几乎没有增加（补充图S7A），这表明hESCs中的功能破坏复合物更为有限。然而，在诱导后48小时和72小时，β-catenin水平在较长的时间间隔内明显增加，尤其是在核部分（补充图S7B）。因此，功能性APC复合物在诱导的人胚胎干细胞早期似乎受到限制，但足以快速诱导Wnt靶基因。
α-连环蛋白抑制Wnt/β-连环素诱导的转录和hESC分化。(A类)50nM因子XV处理的人胚胎干细胞典型Wnt靶基因和内胚层分化标记基因的时序qRT-PCR分析(顶部面板）或重组Wnt3a(底部面板）。mRNA水平根据GAPDH标准化。(B类)ChIP分析AXIN2型和SP5标准模拟处理细胞（未诱导，灰色）或用50 nM因子XV处理6小时的细胞（黑色）中的hESCs基因。显示了用于ChIP的抗血清在上面每个面板。H3K27me3和H3K4me3水平SP5标准该基因被归一化为总组蛋白H3。(C类)典型Wnt靶基因和内胚层分化标记基因的qRT-PCR分析。在稳定表达控制特异性或α-连环蛋白特异性shRNA的人胚胎干细胞系中测量mRNA水平。细胞用因子XV处理24小时（灰色），然后取出并用新鲜培养基培养24小时（黑色）。位于的示意图正确的说明了用α-catenin shRNA处理但不控制shRNA的细胞如何无法终止Wnt诱导的内胚层分化基因转录，以及β-catenin信号通路如何进展以激活内胚层的分化途径。(D类)α-catenin在APC破坏复合体中作用的总结和模型（如顶部以及将APC复合物招募到Wnt靶基因的β-catenin:LEF-1复合物。详见正文。
ChIP分析AXIN2型和SP5标准基因证实β-catenin在因子XV诱导hESCs后迅速被招募，基因激活伴随着RNAPII Ser2P和H3K4me3水平的增加以及H3K27me3的丢失()。APC和LSD1也被β-catenin招募到AXIN2型hESCs中的WRE。这种结合在WRE对LEF-1是特异性的，在对照基因间区域没有观察到。为了研究APC破坏复合体在靶基因β-catenin周转中的作用，我们获得了稳定的表达APC或α-catenin-shRNAs的hESCs（补充图S7C）。因子XV退出后，稳定的α-catenin敲除或APC敲除hESCs中Wnt靶基因mRNA水平仍然升高（图S7D），这与β-catenin和RNAPII Ser2P在AXIN2型APC缺失的hESCs中的基因（补充图S7E）。重要的是，α-catenin击倒细胞也诱导Wnt分化基因(SOX17标准，CXCR4系列、和FOXA2公司)β-catenin瞬时激活后的表达，与表达对照shRNA的细胞不同()。在本实验中，通过去除因子XV，在24小时后终止β-catenin的诱导。在对照细胞中，Wnt内胚层分化基因均未被激活。然而，在缺乏α-catenin的细胞中，Wnt靶基因无法关闭，分化基因受到强烈诱导。在Axin缺失的hESCs中也观察到类似的作用，这与α-catenin在破坏复合物中的作用一致（补充图S7F）。重要的是，在缺乏因子XV的情况下，α-连环蛋白耗竭不能激活靶基因，这表明这种作用对Wnt/β-连环蛋白诱导的转录是特异性的(，0小时）。我们得出结论，α-catenin是关闭Wnt靶基因表达和防止β-catenin-诱导hESCs分化所必需的。总之，这里报告的研究结果表明，α-连环蛋白与APC CID相互作用，并通过稳定破坏复合物和促进泛素化促进β-连环素蛋白水解。此外，我们发现α-catenin将APC复合物导向WRE以控制H3K4甲基化和协同调节复合物的交换().
讨论
在本研究中，我们证明α-连环蛋白与APC肿瘤抑制因子相互作用，抑制Wnt靶基因表达并促进β-连环素转录激活物的蛋白水解。这种相互作用是通过APC-CID介导的，APC CID是结肠癌中APC的一个突变热点，对β-catenin的破坏至关重要。α-连环蛋白与APC的结合不依赖于β-连环素，APC和β-连环素与α-连环蛋白N末端不同但相邻的位点结合。最重要的是，α-连环蛋白通过稳定β-连环素与APC破坏复合物的结合并保留磷酸化简，促进β-连环素的泛素化和蛋白水解。通过对Wnt调节复合物的MudPIT蛋白质组学分析，我们发现α-catenin与Wnt3a信号细胞中靶基因的LEF-1/TCF复合物中的β-catenin-伴随，并在包含CtBP:RCOR1:LSD1的大型复合物中招募APC。我们之前的研究表明，全长APC在HT29结肠癌细胞中重新表达时会快速定位于靶基因的WRE，并具有关闭转录和招募Gro/TLE辅阻遏物的功能(Sierra等人，2006年)。目前的研究结果表明，α-catenin将APC靶向β-catenin:LEF-1 WRE复合物()。α-catenin或APC的敲除可在信号终止时阻止LEF-1复合物中β-catenin的释放，并显著延长WRE中β-catanin的占用时间。最后，我们发现APC和α-catenin也被招募到Wnt靶基因中，以向hESCs发送信号。在敲低人胚胎干细胞中的α-连环蛋白后，未能关闭Wnt靶基因可能会上调内胚层分化基因。因此，α-连环蛋白通过APC控制Wnt靶基因的β-连环蛋白稳定性和活性。
α-catenin在APC破坏复合体中的作用
一些观察结果支持α-catenin在APC破坏复合体中具有重要功能作用的观点。首先，点突变（T120和Y142）和siRNA-介导的α-连环蛋白敲除强烈抑制了β-连环素的泛素化和蛋白水解。其次，需要α-catenin来保存β-catenin-磷酸化简并与βTrCP1结合。这些结果支持了早期的观察结果，即全长APC（而不是癌症相关突变体）保护β-连环蛋白磷酸降解子免受PP2A磷酸酶的影响(Su等人，2008年)β-连环蛋白磷酸化的APC调节发生在包含α-连环素的复合物中(Layton等人，2012年)。第三，我们发现α-catenin识别APC CID并选择性稳定β-catenin与天然APC复合物的结合。α-catenin:APC相互作用是直接还是通过其他因素介导尚待确定。尽管体外表达的β-catenin可以识别APC 3x15R，但全长APC蛋白的蛋白水解并不需要该结构域(Kohler等人，2009年;Roberts等人，2011年)。此外，3x15R结构域与CtBP:RCOR1:LSD1复合物强烈相互作用，这可能会阻止β-catenin进入天然复合物中的该位点。相反，我们发现α-catenin有助于在破坏复合物和与WRE结合的LEF-1/TCF复合物中将β-catenin-连接到APC。最近的研究表明，β-catenin在一个大的Axin1-蛋白酶体复合物细胞质中降解(Li等人，2012年)α-catenin可能在这个破坏复合体中具有额外的联系和功能。
全球磷酸化蛋白质组研究表明，转化细胞中α-catenin中的APC结合位点经常在Y177处酪氨酸磷酸化(网址：http://www.phosphosite.org)。我们表明，α-catenin Y177磷酸化选择性地破坏与APC的结合，但不破坏与β-catenin的结合，并且该位点的点突变（Y177F）阻断磷酸化，并强烈增强与APC结合和Wnt靶基因的抑制。相反，Q176A突变既减少了α-catenin与APC的结合，又破坏了其抑制转录和细胞生长的能力。β-连环蛋白的酪氨酸磷酸化先前被认为可以抑制癌细胞中E-钙粘蛋白和α-连环蛋白的结合(Ji等人，2009年)。因此，酪氨酸激酶可能通过多种机制来增加细胞核中的β-连环蛋白水平，并破坏Wnt靶基因的抑制。在癌症进展的后期，α-连环蛋白经常被启动子甲基化（这将完全稳定β-连环素并组成性激活Wnt靶基因）删除或抑制，同时细胞黏附丧失和转移增加。确定负责α-catenin Y177磷酸化的酪氨酸激酶非常重要，因为抑制这一步骤可能有助于抵消EGFR-阳性癌症和其他表达野生型APC的癌症中致癌的β-catenin-活性。
α-catenin和APC在β-catenin:Wnt靶基因的LEF-1/TCF复合物中的作用
我们的发现也对α-连环蛋白在Hippo激酶级联中的作用有着有趣的启示，Hippo蛋白级联通过下调Wnt、GPCR和其他信号通路来控制器官细胞生长、凋亡和细胞接触抑制(Tsai等人，2012年;Yu等人，2012年;于和关2013)。WREβ-catenin:LEF-1复合物中α-catenin的存在()提示转录复合物的排列类似于细胞粘附复合物，但β-catenin与LEF-1/TCF而非E-cadherin结合。APC还可以通过与细胞粘附连接的结合影响细胞粘附(滨田和比恩茨2004)。因此，重要的是评估α-catenin Y177磷酸化是否破坏APC与细胞膜的联系，并与Wnt靶基因的阻遏损失协调地削弱细胞粘附。更广泛地说，细胞密度可能通过改变α-catenin Y177磷酸化或CtBP:RCOR1:LSD1和α-caterin:APC复合物的亚细胞定位和活性来控制转录。我们之前的研究表明，在β-catenin蛋白水平下降的几个小时之前，该基因的APC活性(Sierra等人，2006年)，表明它直接起到关闭转录的作用。另外，α-连环蛋白和APC敲除对β-连环素占用的影响可能反映了β-连环素在细胞质中被破坏所建立的热力学平衡。因为APC结合磷酸化的β-连环蛋白，所以评估这种修饰是否在LEF-1复合物和WRE中保存，以及βTrCP介导的泛素化是否也可能发生在基因中，这与UB-蛋白酶体系统在调节转录中的广泛作用是一致的，这一点很重要(Geng等人，2012年).
APC与CtBP直接相互作用(滨田和比恩茨2004)我们的研究表明，它也是包含RCOR1和LSD1的更大复合体的支架。FAP患者早期腺瘤中CtBP蛋白水平上调，表明它也是APC破坏复合物的重要底物(菲尔普斯等人，2009年;Rai等人，2010年)。CtBP是许多肿瘤抑制剂的有效阻遏物(Chinnadurai 2009年)并抑制视黄醇脱氢酶的产生和视黄酸的生物合成，从而干扰早期腺瘤的肠分化(菲尔普斯等人，2009年;Rai等人，2010年)。然而，CtBP在Wnt靶基因的表达中起着复杂的作用，因为它既能抑制基础基因的表达，又能增强β-连环蛋白的反式激活(Fang等人，2006年)。这增加了APC复合体的某些亚单位也需要打开Wnt靶基因的可能性。有趣的是，TBL1/TBLR1复合物对CtBP的泛素化调节核受体基因的辅因子交换(Perissi等人，2008年)。TBL1/TBLR1蛋白也控制Wnt靶基因的β-catenin占有率(Li和Wang 2008)，了解APC是否参与此步骤将很有意义。其他APC破坏复合物底物是YAP1同源TAZ(Azzolin等人，2012年)和Ras(Jeong等人，2012年)。APC突变体降解CtBP、TAZ和Ras的失败进一步表明，α-连环蛋白可能调节这些其他底物的破坏，并可能解释为什么α-连环素的消融提高了小鼠肠上皮细胞中Ras-MAPK激酶的活性(Vasioukhin等人，2001年).
机制研究表明，α-连环蛋白通过将YAP1/TAZ转录辅激活子隔离在细胞质中的非活性复合物中来抑制转录(罗宾逊和莫伯格2011;Schlegelmilch等人，2011年;Silvis等人，2011年;Imajo等人，2012年;Rosenbluh等人，2012年)。我们的数据表明，α-catenin可能直接在Wnt靶基因上调节TAZ活性，或将其护送至细胞质以被APC复合物破坏。由于α-catenin和APC是通过β-catenin招募到靶基因的，因此必须调节它们的转录活性，以防止转录提前终止。一种有趣的可能性是，α-连环蛋白的Y177磷酸化可能在激活RNAPII延伸复合物之前阻止APC的对接。TGFβ信号转导的转录偶联转换分析确定了SMAD3的P-TEFb/CDK9和CDK8磷酸化在YAP1招募和DNA辅激活物复合物释放中的作用(Alarcón等人，2009年;Aragon等人，2011年)。活性RNAPII延伸复合物的组装同样可以通过α-catenin:APC复合物触发β-catenin的释放和核输出。鉴于核肌动蛋白在基因表达中起着关键作用(Gieni和Hendzel 2009年)α-catenin和APC调节肌动蛋白和相关蛋白的能力(青木和武藤2007;麦卡特尼和Näthke 2008)，包括Arp2/3复合体(本杰明和纳尔逊2008;Benjamin等人，2008年)也可能在APC复合体的转录活性中发挥重要作用。
在靶基因上，β-连环蛋白与调节H3K4甲基化的几个蛋白质相互作用。β-catenin的N末端靶向BCL9/Legless和Pygopus PHD指蛋白辅活化子，后者结合H3K4me2并刺激H3K4me3(Fiedler等人，2008年)C末端激活域与MLL1:Menin复合物相关，后者介导H3K4me3(Sierra等人，2006年)。β-catenin的N末端也与α-catenin结合，后者招募与CtBP:RCOR1共抑制因子和LSD1 H3K4me1/2脱甲基酶结合的APC复合物。因此，α-catenin:APC:CtBP:LSD1和Bcl9:Pygopus复合物与β-catenin上的相邻位点结合，并可能竞争与H3K4me2的结合以在开和关状态之间切换转录。有趣的是，MLL1和H3K4me3也调节辅活化子：辅升压因子在霍克斯9该步骤在致白血病MLL1易位蛋白中被永久禁用(Wang等人，2010年)。因此，H3K4甲基化步骤以不同的方式被破坏，以确保白血病和结肠癌细胞中构成性癌基因的表达。
最后，我们证明α-连环蛋白是人胚胎干细胞中β-连环素反式激活的强烈抑制剂，它通过分化内胚层和中胚层细胞命运来响应Wnt信号(Wray和Hartmann，2012年)。尽管这些细胞的核质室中α-连环蛋白和β-连环素水平较低，但Wnt靶基因在Wnt3a或GSK3β抑制剂的作用下快速诱导，我们发现α-连环素、APC和LSD1伴随β-连环蛋白诱导基因。β-catenin短暂诱导后，在缺乏α-catenin的细胞中Wnt靶基因无法关闭，α-catentin强烈上调下游内胚层基因并促进hESC分化。相反，慢病毒shRNA敲除α-catenin不足以在非信号细胞中诱导Wnt靶基因，这与在小鼠上皮细胞中条件敲除α-catenin也无法激活该通路的观察结果一致(Vasioukhin等人，2001年)。因此，该系统将有助于分析Wnt信号转导和内胚层分化的调控机制。
总之，α-连环蛋白与APC的相互作用在β-连环素泛素化、蛋白水解和Wnt靶基因的β-连环素转换中起着重要作用，并被α-连环蛋白Y177磷酸化所破坏，从而阻止转化细胞中Wnt靶基因的抑制。与APC结合也可能影响α-连环蛋白介导的细胞粘附和肌动蛋白细胞骨架的重排，从而导致癌症中这些过程的失调。
材料和方法
细胞培养和DNA转染
HEK293和HCT116细胞在补充有2 mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM中培养2（5%）37°C培养箱。PC-3细胞在含有2mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI1640中培养。通过添加最终浓度为500μg/mL的G418进行G418选择。对于载体DNA的异位表达，按照供应商的指示，使用LipoD293TM DNA体外转染试剂（SignaGen Laboratories）将4μg DNA转染到HEK293细胞中。补充材料中描述了TOP-FLASH报告分析、细胞分离、免疫沉淀和免疫印迹程序。
siRNA转染
siRNA是从生命科技公司获得的。按照供应商的指示，用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂进行siRNA转染。转染后48小时进行检测。对于阴性对照siRNA，使用Silencer阴性对照#1 siRNA（Life Technologies）。使用的特定siRNA序列可根据要求提供。
逆转录和qRT-PCR
使用Trizol试剂（Life Technologies）分离总RNA，并根据制造商的说明，使用SuperScript III（Life Technologies）和寡核苷酸对3μg提取的RNA进行反转录。使用SYBR Green混合母液（Life Technologies）对cDNA进行三次PCR测量。在ABI7300（应用生物系统）中进行扩增，在95℃下进行10分钟的DNA变性步骤，然后在95℃和60℃下进行40个周期的15秒和60秒。使用比较CT方法将技术重复的平均值归一化为GAPDH水平。图中显示了至少三个实验的平均值和标准偏差。补充材料中列出了qRT-PCR引物。
标记蛋白复合物的亲和纯化及MudPIT分析
使用G418选择在HEK293细胞中建立标记的全长人β-连环蛋白、TCF4、LEF-1、α-连环素和APC（氨基酸1–2227）的稳定表达。使用免疫沉淀缓冲液（50 mm HEPES-NaOH，pH 7.9，300 mm NaCl，1%NP-40，10 mm MgCl）从15个150 mm培养皿中提取细胞2，15%甘油）与蛋白酶抑制剂混合至最终体积为15 mL，并在细胞溶胀后均质以进行核提取。通过离心（14000）澄清提取物克在4°C下保持15分钟）。Flag-M2珠粒（Sigma）与上清液在4°C的滚筒上以80μL浆液（浆液中50%珠粒）与6mg总蛋白的比例孵育4小时。在免疫沉淀洗涤缓冲液（25 mM HEPES-NaOH，pH 7.9，300 mM NaCl，0.2%NP-40）中洗涤珠子四次，在4°C下洗涤3分钟，然后在Flag-elution缓冲液（25mM Tris-HCl，pH 7.5，50 mM NaCI）中洗涤两次。最后，将样品与200μg/mL Flag肽（Sigma）在洗脱缓冲液中在室温下旋转培养30分钟。补充材料中详细介绍了MudPIT蛋白质的鉴定方法和分析。原始数据文件将在网址：http://www.yeastrc.org出版后1年内。
ChIP实验
补充材料中描述了用于ChIP研究的程序、引物和抗血清。
hESC的维护
H1-hESCs在mTeSR1中在Matrigel-coated（BD Biosciences）组织培养板上培养。在用1 mg/mL dispase处理后，每5–7天以1:3的分离比将培养物手动传代为团块。每天更换培养基。在实验中，使用Accutase以1:6的分裂比将团块分解为单个细胞。将小鼠重组Wnt3a或GSK3抑制剂因子XV（Millipore）分别以最终浓度100 ng/mL和50 nM添加到mTeSR1培养基中。
