ATR–通道1–APC/C^{加拿大存托凭证1}-复制应激下DNA损伤旁路需要Cdc7–ASK（Dbf4）激酶的依赖性稳定

需要ATR–Chk1信号来稳定Cdc7–ASK

当ATR–Chk1检查点信号被激活并有助于对复制压力的响应(Bartek和Lukas 2003)，我们询问ATR–Chk1级联是否在复制阻断时调节Cdc7–ASK的稳定性。与对照ATR阳性细胞相比，ATR基因敲除在复制应激条件下损害了Cdc7–ASK的稳定性，对细胞周期没有重大影响(图2A; 补充图2A、B）。接下来，使用shRNA或cep-3891（Chk1激酶的小分子抑制剂）沉默基因(Syljuasen等人，2004年,2005)，我们观察到HU治疗后Cdc7–ASK复合物的Chk1激酶依赖性稳定(图2B、C)，与细胞周期剖面无关（补充图2C、D）。与ATR–Chk1信号传导相反，在HU或MMC处理后，Chk2激酶的敲低不影响Cdc7–ASK的积累（补充图2E）。这些结果表明，在复制叉停滞时，ATR–Chk1通路是稳定Cdc7–ASK复合物（包括其染色质部分）所必需的。

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图2。

在复制块上稳定Cdc7–ASK需要ATR–Chk1信令。(A类)ATR缺失细胞中Cdc7–ASK的稳定性受损。U2OS-shATR细胞在添加或不添加Dox的情况下生长2 d，然后进行MMC处理指定时间。收集的细胞进行全细胞裂解或生化分离，然后通过免疫印迹分析。(B类)Chk1缺失细胞中Cdc7–ASK的稳定性受损。U2OS-shChk1细胞在添加或不添加Dox的情况下生长2 d，然后HU处理、收获、生物化学分离并通过免疫印迹分析。(C类)抑制Chk1活性后，Cdc7–ASK的稳定性受损。U2OS细胞与cep-3891预孵育或不孵育2 h，然后进行HU处理，并对采集的细胞进行生化分离和免疫印迹分析。

Cdc7–ASK复合物与Cdh1相互作用，并被APC/C降解^{加拿大存托凭证1}

在芽殖酵母中，Dbf4的蛋白质稳定性由APC/C泛素-蛋白酶体途径调节(Weinreich和Stillman 1999年；费雷拉等人，2000年). 因此，我们接下来研究了APC/C是否参与人类细胞复制阻断后Cdc7–ASK的稳定。首先，我们确认在蛋白酶体抑制剂MG132治疗后ASK适度增加（补充图3A）。由于ASK蛋白在G0-G1期细胞中不存在，在G1/S过渡期积累，在M晚期和G1早期下降（补充图3B，C），我们假设ASK可能是APC/C的靶点^{加拿大存托凭证1}G0/G1中活性的泛素连接酶(2008年斯卡尔和帕加诺)从G1/S边界到早期有丝分裂，通过细胞周期蛋白依赖激酶（Cdks）磷酸化Cdh1而失活(Zachariae等人，1998年；Lukas等人，1999年；Listovsky等人2000). 为了验证这个假设，我们评估了Cdh1和Cdc7–ASK之间的潜在交互作用。如所示图3A，内源性Cdc7和ASK与Flag-Cdh1结合。接下来，我们发现Cdh1的消耗导致Cdc7和ASK的丰度增加(图3B; 补充图3D）。尽管我们观察到，与对照细胞相比，Cdh1缺失的细胞中S期群体增加了约20%（补充图3E，F），但Cdh1缺失的细胞中染色质结合的ASK显著增加（增加约2.8倍，增加180%）不能归因于间接细胞周期效应，并表明人类ASK是APC/C的直接靶点^{加拿大存托凭证1}途径，类似于酵母。此外，我们观察到HU处理后Cdh1蛋白丰度降低，可能导致复制应激下Cdc7–ASK的稳定(图3B). 此外，使用myc-Cdh1可诱导表达的细胞系，我们证实异位myc-Cdh1阻止HU治疗后Cdc7–ASK复合物的稳定(图3C)尽管与对照细胞相比，异位的myc-Cdh1并没有显著改变细胞周期，但这可能是由于Cdh1诱导时间很短以及HU治疗后G1/S边界处的细胞积聚所致（补充图3G）。重要的是，Cdh1的缺失稳定了U2OS细胞中的ASK和Cdc7，正如放线菌酮处理后蛋白质周转较慢所证明的那样(图3D)。

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图3。

Cdc7的稳定性–ASK由APC/C调节^{加拿大存托凭证1}. (A类)Cdh1与Cdc7的相互作用–ASK。从稳定的U2OS细胞系中诱导表达Flag-Cdh1的裂解物，用抗Flag抗体进行免疫沉淀，并通过免疫印迹分析。(B类)Cdh1缺失细胞中染色质结合的ASK增加。用对照siRNA（siGFP）或用于Cdh1的siRNA（siCdh1）转染U2OS细胞；24小时后，用2mM HU处理细胞或不处理细胞24小时，然后进行生化分离并通过免疫印迹分析。(C类)异位Cdh1破坏Cdc7–ASK的稳定性。用或不用四环素培养2 d，诱导表达myc-Cdh1的U2OS细胞，用2 mM HU处理或不处理24 h，然后进行全细胞裂解(左边)或生化分馏(正确的)免疫印迹分析。（*）内源性c-myc。(D类)Cdc7和ASK蛋白在Cdh1缺失细胞中稳定。用1μg/mL环己酰亚胺（CHX）处理转染siGFP或siCdh1的U2OS细胞24小时，然后进行细胞裂解和免疫印迹分析。(左侧)Ponceau S染色作为负荷控制。(赖特)量化信号强度。(E类)ASK蛋白在两个D盒中突变，KEN盒更稳定。(顶部面板）D盒和KEN盒在人工ASK中的示意图。(左侧)转染表达标记ASK（野生型或突变型）的U2OS细胞用1μg/mL CHX处理指定时间，进行裂解，并通过免疫印迹分析。(赖特)量化信号强度。

APC/C基板^{加拿大存托凭证1}隐藏所谓的D-box和/或KEN-box识别序列(van Leuken等人，2008年). 事实上，我们在ASK中确定了两个假定的D框和一个KEN框(图2E，上图），并通过证明在所有三个识别序列中突变的ASK蛋白比野生型ASK更稳定来验证这些(图3E，底部面板）。有趣的是，内源性Cdc7蛋白在表达这种突变ASK的细胞中也更稳定，这可能是由于和更稳定的ASK形成复合物所致。这些结果表明，人类Cdc7–ASK复合物是APC/C的一个新靶点^{加拿大存托凭证1}以及ATR–Chk1信号传导途径。

APC/C失活需要Chk1激酶活性^{加拿大存托凭证1}复制应激时

鉴于对复制检查点信令和APC/C之间的任何关系缺乏了解^{加拿大存托凭证1}-介导的蛋白水解和我们对HU处理后Cdh1降低的观察(图3B)接下来，我们分析了Cdh1蛋白丰度对复制胁迫的响应动力学。HU处理期间U2OS细胞中Cdh1的丰度下降(图4A（左）、MMC、顺铂（CIS）和喜树碱（CPT）(图4AHU处理后，MRC5和HeLa细胞中的Cdh1也下降(图4B). 在这些实验中，由于Cdc25A磷酸酶的降解和Tyr15处Cdk的磷酸化导致Cdk失活，从而证明了检查点的影响(图4B)。

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图4。

Chk1激酶活性通过APC/C失活稳定Cdc7–ASK复合物^{加拿大存托凭证1}在复制块上。(A类)复制阻断后Cdh1蛋白水平降低。(左侧)细胞裂解物也用于图1A用于免疫印迹。(赖特)U2OS细胞用1μM MMC、2μM CIS或1μM CPT处理24 h；用免疫印迹法分析裂解产物。(B类)MRC5和HeLa细胞中复制检查点通路的激活。MRC5型(左边)和赫拉(正确的)细胞用2mM HU处理指定时间。用免疫印迹法分析全细胞裂解产物。(C类)复制阻断后Cdh1降解中的APC/C途径。将GFP siRNA或Cdc27 siRNA转染U2OS细胞。24 h后，将细胞暴露于2 mM HU中24 h。通过免疫印迹分析全细胞裂解产物。(D类)复制阻断后，Cdh1降解需要Chk1激酶活性。U2OS-shChk1细胞在添加或不添加Dox的情况下生长2 d，然后用2 mM HU处理24 h(左侧)用免疫印迹法分析全细胞裂解产物。用或不用cep-3891预孵育2 h的HeLa细胞分别用2mM HU处理或不处理24 h(赖特)用免疫印迹法分析全细胞裂解产物。(E类)Cdc7–ASK的稳定需要Chk1的激活。用HA标记野生型重组的U2OS-shChk1细胞(左边)或突变型Chk1（S317A[中间的]或S345A[正确的])加入或不加入Dox培养2d，然后用HU处理或不加入HU处理24h，通过免疫印迹分析细胞裂解产物。(F类)Cdh1耗尽会使Chk1耗尽细胞中的Cdc7–ASK重新激活。用siGFP或siCdh1转染U2OS-shChk1细胞。24 h后，细胞在添加或不添加Dox的情况下生长2 d，然后用HU处理或不处理24 h，并通过免疫印迹分析细胞裂解物。

因为Cdh1可以在未受干扰的细胞周期中促进自身降解(Listovsky等人2004)，我们在复制块上检查了这样的场景。事实上，敲低APC／C的重要成分Cdc27，损害了HU引起的Cdh1蛋白丰度的降低(图4C)而在对照siRNA（siGFP）处理的细胞和siCdc27处理的细胞中也观察到类似的细胞周期特征，这可能是由于相对较短的Cdc27耗竭和HU处理细胞的S期积累所致（补充图4A）。这些结果强烈表明，激活的检查点抑制APC/C^{加拿大存托凭证1}通过在复制胁迫下促进Cdh1自降解的途径，因为否则APC/C^{加拿大存托凭证1}由于检查点诱导的Cdk激酶抑制，即使在S期也可能变得活跃。事实上，我们发现shRNA-介导的Chk1敲除或化学抑制Chk1活性可削弱Cdh1对HU或CIS的反应(图4D; 补充图4B）。APC/C的已知底物始终如一^{加拿大存托凭证1}HU处理后，包括ASK、Cdc6和Cyclin A在内的细胞没有积累。相反，细胞周期蛋白E不是APC/C的靶点^{加拿大存托凭证1}，不受Chk1抑制的影响(图4D). 在补体分析中，诱导性异位HA标记的野生型Chk1，而不是激活磷酸化缺陷的Chk1突变体（S317A或S345A），可以完全挽救APC/C失活的能力^{加拿大存托凭证1}内源性Chk1缺失的细胞内(图4E). 此外，在Chk1缺失的细胞中，当复制阻滞时，Cdh1缺失恢复了Cdc7–ASK的稳定性(图4F). 这些发现表明，Chk1信号转导对复制应激的反应促进了APC/C介导的Cdh1降解，从而使APC/C失活^{加拿大存托凭证1}通路。

复制应激下人细胞的Cdc7激酶活性

鉴于Cdc7在DNA复制的启动和进展中的重要作用，有理由假设Cdc7的激酶活性被DNA复制检查点下调，以防止起源延迟触发。事实上，一些实验室报告称，当酵母和爪蟾鸡蛋提取物(Weinreich和Stillman 1999年；Costanzo等人，2003年；Zegerman和Diffley 2010). 在这里，我们发现，有点出乎意料的是，在人类体细胞中，DNA复制块上的染色质上存在活性的Cdc7–ASK激酶复合物。我们的数据与之前的一些观察结果一致(Tenca等人，2007年；Lee等人，2012年). 例如，Lee等人（2012）据报道，人类ASK在各种基因毒性损伤后被ATM/ATR磷酸化，这种磷酸化参与了检查点反应；然而，研究人员未能检测到Cdc7激酶活性的抑制。总之，这些研究提出了一个有趣的问题，即如何调和这些看似矛盾的结果。虽然不能完全排除卵母细胞与体细胞的种间差异和不同特性，但我们提出了另一种解释，同时考虑到Cdc7激酶复合体在整个进化过程中的高度保守性。因此，我们推测，暴露于复制应激的细胞中可能存在至少两个时空和功能上不同的Cdc7激酶组分：（1）一个受抑制的流动组分，从而有助于沉默晚期复制起源放电(Zegerman和Diffley 2010)（2）染色质结合的活性Cdc7–ASK（Dbf4）复合物，局部促进停滞复制分叉处的跨损伤合成（本研究）。还有可能是，在复制应激的初始反应期间，全球Cdc7–ASK激酶活性暂时受到抑制，以防止迟发性起源放电，然而，在长时间复制应激期间，部分Cdc7-ASK复合物可能被重新激活，以促进休眠性起源放电和损伤旁路。在这两种情况下，有趣的是，ATR/Chk1（及其酵母同源物）的活性将直接磷酸化Cdc7/ASK（Dbf4），以抑制其在一个组分中的活性，同时也触发Cdh1的降解，从而稳定ASK和我们本研究中描述的染色质结合的Cdc7/ASK的活性。对Cdc7时空不同子集双重作用概念的实验验证可以解释该领域的明显差异。

ATR–Chk1信令、Cdc7–ASK和APC/C之间的链路^Cdh1型-介导的蛋白质周转

我们当前研究的一个新发现是识别连接ATR–Chk1检查点和APC/C的信号通路^Cdh1型蛋白质降解机械。在未受干扰的细胞周期中，APC/C^{加拿大存托凭证1}被Cdk介导的Cdh1磷酸化从G1/S边界到早期有丝分裂失活(Zachariae等人，1998年；Lukas等人，1999年；Listovsky等人2000；Sorensen等人2001). 当复制分叉停止时，复制检查点被激活，随后，通过靶向Cdc25A磷酸酶下调Cdk活性(Bartek等人，2004年). 在Cdk沉默的后一种情况下，APC/C^{加拿大存托凭证1}通常处于非活动状态时，预计将在S阶段激活。我们表明APC/C的这种“不适当”激活^{加拿大存托凭证1}通过ATR/Chk1活性促进的Cdh1降解来阻止图6G)如Chk1抑制剂的影响和Chk1磷酸突变体S317A或S345A的表型所记录。我们的数据表明，Chk1活性可能通过APC/C复合物成分的磷酸化，包括Cdh1本身，参与Cdh1的自降解。最近确认APC1为Chk1底物支持了这种情况(Blasius等人，2011年). 与复制检查点相反，电离辐射（IR）诱导的DNA损伤检查点激活APC/C^{加拿大存托凭证1}在S/G2期间，以防止DNA受损的细胞有丝分裂进入(Sudo等人，2001年；Bassermann等人，2008年). 尽管ATR–Chk1激活，我们始终没有观察到IR后Cdc7–ASK的稳定。尚不清楚为什么APC/C^{加拿大存托凭证1}该途径在复制应激和IR-Iflicted DNA双链断裂时受到不同的调控，但我们推测APC/C^{加拿大存托凭证1}途径可能有助于DNA损伤修复途径的选择。RAD18不仅调节病变旁路，还调节HR通路(Szuts等人，2006年；Saberi等人，2007年；Huang等人，2009年). 因为我们的结果表明，通过APC/C的失活来稳定活性Cdc7–ASK激酶^{加拿大存托凭证1}需要RAD18依赖性病变旁路，激活APC/C^{加拿大存托凭证1}RAD18依赖的HR可能需要IR。有趣的是，DNA修复选择中涉及的因素，如53BP1和Rap80，是APC/C的候选靶点^{加拿大存托凭证1}(亚当斯和卡彭特2006；Cho等人，2012年). 与人类疾病相关，Cdh1的下调与胶质瘤患者的低生存率相关，可能是由于G2检查点受损(Bassermann等人，2008年). 我们在这里表明，Cdh1的缺失导致染色质结合ASK的丰度增加(图3B)ASK的过度表达增强了RAD18的染色质结合（补充图5D）。基于这些结果，我们认为，癌症相关的ASK过多/活性可能通过加重RAD18依赖的易出错损伤旁路途径，导致癌症患者生存率低下，从而增加突变率，从而提高肿瘤细胞的适应性和治疗抵抗力。

Cdc7–ASK激酶调节DNA损伤旁路途径

在我们目前的研究中，另一个概念上重要的发现是对复制检查点和DNA损伤旁路通路的协调机制的机械洞察力。我们的数据强烈表明ATR–Chk1级联和RAD18依赖性损伤旁路是通过人类细胞中的Cdc7–ASK激酶连接的(图6G). 酵母的遗传研究表明，DNA修复需要Cdc7活性；然而，酵母中这种联系的基础以及哺乳动物细胞中的任何这种联系仍然是推测性的。最近，据报道，Cdc7磷酸化RAD18的Polη结合基序中的丝氨酸簇，这是Polη的募集到复制叉停滞位点所必需的(Day等人，2010年). 后一项研究得出结论，RAD18的染色质负载不需要依赖于Cdc7的RAD18磷酸化。我们目前的结果表明，ASKmotif C和RAD18的N末端区域之间的相互作用对于RAD18染色质的结合至关重要。这些结果强烈表明，Cdc7、ASK和RAD18形成三聚体复合体，其中ASKmotif C为Cdc7和RAD17提供了交互平台。这种相互作用可能不仅促进了Cdc7–ASK介导的RAD18磷酸化，以启动后者与Polη的相互作用，而且还促进了RAD18–Polη）复合物向停滞复制叉的募集。此外，考虑到FANCD2和Rad51C也与RAD18的RING域相互作用，我们发现包含RING域的RAD18 N端区域与ASK相互作用是非常有趣的(Huang等人，2009年；Williams等人，2011年). RAD18的结合伙伴可能在不同的基因毒性损伤中决定最佳的DNA损伤反应途径。总的来说，我们的结果和Day等人（2010）帮助阐明Cdc7–RAD18依赖性病变旁路的调节机制。相反，在ASK缺失的细胞中，对CIS治疗反应的Rad51病灶形成保持完整，表明Cdc7–ASK可能不参与CIS诱发的复制阻滞的同源重组修复。相反，我们发现在缺乏ASK的细胞中，Rad51病灶的自发形成略有增加，这与之前的报告一致，即有条件地敲除cdc7小鼠胚胎干细胞基因诱导自发Rad51病灶形成(Kim等人，2002年). 由于Rad18依赖性损伤旁路在慢性低剂量紫外线照射期间非常重要，可通过DNA损伤检查点激活和酵母中Rad52依赖性HR修复来防止G2停滞(Hishida等人2009)，Cdc7激酶可能促进DNA损伤旁路，以防止复制叉停滞时间延长导致的叉崩溃。

生化分析

用1×Laemmli样品缓冲液（LSB）直接裂解制备全细胞提取物。按照说明进行生化细胞分离(门德斯和斯蒂尔曼2000). 用于免疫沉淀的细胞裂解缓冲液如下：5 mM Hepes-KOH（pH7.9）、120 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、10%甘油、0.25%Triton X-100、1 mMNaF、1mMβ-甘油磷酸和蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）。有关本研究中使用的抗体的信息，请参阅补充材料。对于免疫沉淀，我们使用了抗标记M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich）。

免疫荧光

用缓冲液A预先提取盖玻片上生长的细胞(门德斯和斯蒂尔曼2000)在冰上放置10分钟，在室温下用4%甲醛固定10分钟。固定细胞用抗RAD18抗体或抗Rad51抗体染色。样品通过Scan R（Olympus）进行分析，以量化病灶。

我们感谢哥本哈根和奥洛穆克实验室成员的支持。这项工作由丹麦科学技术与创新局（DASTI）的日本-丹麦战略合作计划资助；日本科技厅；丹麦癌症协会；伦德贝克基金会；诺和诺德基金会；捷克共和国拨款机构（编号：301/11/P554）；以及欧盟委员会（InflaCare、Biomedeg和DDResponse项目）。