B细胞个体发生过程中抗体类开关和V（D）J连接的柔性排序

摘要

体液免疫依赖于由免疫球蛋白（Ig）重链V组装的抗原受体_H（H）、D和J_H（H）B细胞早期发育过程中的片段。RAG重组酶介导骨髓中V（D）J基因片段的组装(Zhang等人，2010年;Schatz和Ji 2011)。在位于次级淋巴结构的成熟B细胞中，激活诱导脱氨酶（AID）启动从IgM表达到具有特殊效应功能的次级Ig类（IgG3、IgG1、IgG2b、IgG2a、IgE和IgA）的转换(斯塔夫内泽1996，2000)。类别开关复合（CSR）通过染色体内缺失过程发生，同时保持原来的V（D）J组装(肯特2012)。未能通过B细胞受体（BCR）组装V（D）J外显子或信号会阻碍B前细胞的发育进程(Jankovic等人2004;von Boehmer和Melchers 2010)。然而，V（D）J连接和CSR的严格本体分离在某些情况下可能会被打破(Milili等人，1991年;Rolink等人，1996年;Weller等人，2001年;Dudley等人，2002年;Mao等人，2004年;Han等人，2007年;Ueda等人，2007年;Scheeren等人，2008年;Kuraoka等人，2009年;Wesemann等人，2011年)。例如，在μMT小鼠中，膜Igμ不表达，B细胞发育在原B细胞阶段停止；然而，IgA是选择性表达的(Melamed等人，2000年;Macpherson等人，2001年)这意味着CSR的另一种途径可以绕过前B细胞障碍。然而，目前尚不清楚在何处以及在何种情况下发生IgA转换。

Omenn综合征是一种与自身免疫和特应性相关的严重联合免疫缺陷病，最常见的原因是Rag重组酶基因的低形态突变。该综合征的特征是B和T淋巴细胞严重缺乏，γ-球蛋白血症低，IgE水平升高(Wong and Roth 2007年;Ozcan等人，2008年)。为了解释Omenn综合征中高IgE的原因，我们假设（1）CSR发生在V（D）J加入前的BM pro-B细胞中，（2）CSR易患IgE，（3）V（D。在这里，我们展示了这一点拉格牌手表-不足或Mb1型-缺乏的原B细胞可以被诱导产生强大的CSR，尽管是Ig常数（C_H（H）)在V（D）J结合之前或之后的区域基因，包括IgG2b和IgE。免疫接种抹布1^−/−LPS小鼠促进BM pro-B细胞中IgG2b的转换。我们还证明了V（D）J结合可以在Abelson转化的原B细胞和前B细胞系中遵循CSR。研究伊格位点染色质结构揭示了前B细胞中一种独特的阶段特异性组织，与优先的IgG2b和IgE转换相关。V（D）J重组和CSR程序的灵活表达对Omenn综合征高IgE的发生、自身免疫储备的发展以及通过RAG和AID重组酶的共同表达而导致的白血病的发生具有意义(Tsai等人，2008年).

结果和讨论

为了验证V（D）J重组前BM pro-B细胞中可能发生强大CSR的说法，我们评估了Rag2、AID和等型特异性种系转录物（GLTE2A型^−/−前pro-B细胞系，在分离自抹布1-或Mb1型-缺陷小鼠，以及一组Abelson转化的原B细胞系（Rag-deficient R2K2和445.3）和前B-细胞系（PA112.1、PA112.2、PA48.1、A70.2和ATM2A）。E2A公司和拉格牌手表缺陷妨碍V（D）J连接，而Mb1型-缺陷的前B细胞聚集V（D）J外显子，但不能通过前BCR发出信号，并在前B细胞阶段被阻断(Pelanda等人，2002年)。在所有未刺激的前B细胞和前B细胞株中均检测到Rag2转录物升高，但在Abelson转化细胞系中未检测到AID转录物升高(图1A，顶部；补充图S1；Muljo和Schlissel 2003)。在用CSR诱导物LPS+CD40L或LPS+CD40L+IL4激活时，抹布2表达式减少为E2A公司^−/−前B前体细胞和抹布1-不足和Mb1型-B前细胞缺乏(图1A)。相反，AID的表达在抹布1-不足和Mb1型-B前细胞缺乏，但不是E2A公司^−/−前B前体细胞(图1A，底部）。同样，在R2K2和PA112.2以及其他Abelson转化的细胞系中，AID表达在CSR刺激下显著增加(图1A，底部；补充图S1A，B）。E2A公司^−/−由于AID不表达，因此未进一步考虑B前体细胞。先前对BM pro-B细胞的研究得出结论，AID转录无法检测到(克劳奇等人，2007年)但并没有评估对CSR激活物的反应。

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图1。

Pro-B细胞经历可诱导的CSR。E2A公司-前pro-B细胞缺乏，抹布1-不足或Mb1型-缺乏的原B细胞、阿伯森转化的原B淋巴细胞系（R2K2）和前B细胞系（PA112.2）未经刺激（US）或用LPS+CD40L（LC）或LPS+CD40L+IL4（LCI）激活，而野生型（WT）静止的脾B细胞未经刺激或用LPS（L）或LPS+IL4。(*)P（P）≤ 0.05; (**)P（P）≤ 0.001–0.0001. (A类，B类)Rag2和AID的定量RT-PCR分析(A类)和GLTγ3、γ1、γ2b和ɛ(B类)从三到五个独立实验的五个样本中，将其归一化为rRNA 18S转录本。(C类，顶部)DC-PCR分析示意图、EcoRI（RI）位点和美国国家卫生研究院基因负载控制。(底部)μ→γ3、μ→γ1、μ→β2b和μ→ɛCSR的DC-PCR分析是三个独立实验的代表。(D类)原B细胞的DC-PCR分析抹布1^−/−注射LPS或PBS的小鼠。野生型或艾滋病^−/−用LPS或无模板对照（C）激活的脾B细胞是三个独立实验的代表。

接下来我们检查了B前细胞中GLT的表达模式。C类_H（H）基因组织在转录单位中，包括非编码内含子（I）外显子、开关（S）区域和C_H（H）外显子。下游S区通过选择性激活GLT启动子以响应特定刺激而与Sμ重组。GLT起始于位于每个I外显子上游的启动子，终止于C的3′端_H（H）地区(斯塔夫内泽2000)。通常，GLTγ3和γ2b由LPS或LPS+CD40L诱导，而GLTγ1和ɛ也需要成熟B细胞中的IL4(图1B)。然而，为了响应适当的企业社会责任刺激，抹布1-不足和Mb1型-缺陷的前B细胞和Abelson转化细胞系表达GLTγ2b和ɛ，但不表达γ1和γ3(图1B; 补充图S1A）。因此，在未成熟B细胞中发现GLTɛ而非γ1的表达(Wesemann等人2011).

AID表达和生殖系转录的激活促使我们研究CSR是发生在B前细胞还是B前细胞。我们使用半定量消化循环PCR（DC-PCR）检测CSR事件，因为前B细胞不表达表面Ig(图1C，顶部）。无安排乙酰胆碱受体(美国海军陆战队)基因被用作负荷控制(图1C)。代表μ→γ2b和μ→ɛCSR事件的DC-PCR产品在抹布1-不足和Mb1型-缺陷的pro-B细胞和Abelson转化的细胞系，而在这两种情况下都没有检测到μ→γ3或μ→γ1事件(图1C，底部；补充图S2）。相反，在用LPS或LPS+IL4激活的成熟脾B细胞中，分别检测到μ→γ3/γ2b和μ→γ1/ɛCSR事件的全谱(图1C)。前B细胞与成熟B细胞中CSR的这种限制性模式与其GLT表达谱相似。引人注目的是，原代B细胞和活化的脾B细胞中DC-PCR产物的水平相似，表明早期B细胞中的CSR较强(图1C; 补充图S2）。

前B细胞中的高频μ→γ2b/ɛCSR通过几种独立的方法得到确认，包括转换后转录物（PSTs）分析、循环转录聚合酶链反应（CT-PCR）分析和S/S连接分析。继CSR之后，Iμ外显子与新的下游C非常接近_H（H）区域，从而允许使用Iμ中的正向引物和相关C中的反向引物检测PST表达_H（H）外显子。PSTγ2b和ɛ在抹布1-不足和兆比特1-在CSR刺激下激活后，缺陷的原B细胞和Abelson转化的细胞系（补充图S3）。CT-PCR分析表明μ→γ2b或μ→ɛCSR在Rag1中动态发生^−/−前B细胞和Abelson转化细胞系（补充图S4）。我们对适当激活的S/S复合结进行了测序抹布1^−/−pro-B细胞或R2K2细胞，发现Sμ连接到Sγ2b或Sɛ中的多种位点（补充图S5-S8）。开关连接是钝的，或包含短的连接微同源性，或偶尔以正常比例插入(Stavnezer等人，2010年)并证实前B细胞的CSR机制在操作上与在成熟B细胞中观察到的CSR没有区别。

为了确定CSR是否可以在体内诱导，抹布1^−/−小鼠注射LPS或PBS，直接从BM中分离前B细胞，并通过DC-PCR检测CSR。野生型或艾滋病-体外培养中被LPS激活的缺陷脾B细胞分别作为CSR的阳性和阴性对照。美国国家卫生研究院扩增显示为一种负荷控制，在缺乏模板的反应中没有PCR产物，这证明了PCR的特异性。在这些活化条件下，μ→ŞCSR可以忽略不计。67%（九分之六）的LPS免疫小鼠观察到μ→γ2b而不是μ→γ3的转换(P（P）= 0.007; χ²)但三个独立实验的PBS注入对照组没有（六分之零）(图1D)。将CSR靶向γ2b而非γ3位点反映了我们在体外培养中观察到的活化前B细胞的GLT表达模式(图1B、C)。我们得出结论，企业社会责任可以发生在商业模式中抹布1^−/−V（D）J重组前的前B细胞。

为了解决发生CSR的B细胞是否可以随后进行V（D）J连接的问题，通过限制稀释分离出R2K2原B细胞系的切换克隆。通过DC-PCR在克隆B5（μ→γ2b）和克隆A2（μ→ɛ）中证实了CSR，并通过独特的Sμ区内重排证明了克隆性(图2A; 补充图S9）。用一种Abl激酶活性的药物抑制剂STI571处理这些细胞系，导致V（D）J活化并分化为晚期前B细胞状态(Muljo和Schlissel 2003)。STI571刺激B5和A2克隆导致V（D）J连接基因程序的诱导(图2B);Muljo和Schlissel 2003)。Rag2⁺但不是空表达结构诱导了不同的D_{DFL16.1标准}–J型_上半年编码联接（CJ），而PST表达式保持不变(图2C; 补充图S10、S11）。因此，经历CSR的原B细胞克隆保留了进行V（D）J重组的能力。重要的是，证据表明BM pro-B细胞表达IgG1(Waisman等人，2007年;Dougan等人，2012年)或转基因Ig-γ2b链(Storb等人，1994年)能够发育成熟的B细胞，与野生型无明显区别。

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图2。

在早期的B细胞系中，V（D）J结合可以遵循CSR。细胞未经处理（U）或用LPS+CD40L（LC）或LPS+CD40L+IL4（LCI）激活。结果代表了三个独立实验中的三到九个样本。(A类)R2K2和克隆A2和B5中CSR的DC-PCR分析。(B类)通过定量RT-PCR对B5和A2克隆中的STI571治疗诱导Rag1、IgκGLT和Irf4表达。(C类)D类_DFL16型→ J型_上半年在转染空（E）或Rag2（R）表达结构和Mb1负载控制的A2和B5克隆中评估CJ。(D类，顶部)PA112.2细胞的治疗时间表。(底部)定量RT-PCR检测AID和Rag2的表达。(E类)PSTγ2b和/或Hprt的半定量RT-PCR。(F类)V（V）_κ6–23→ J型_κ1用半定量PCR评估CJs和Mb1。

为了确定类开关前B细胞能否完成重组的发育程序，我们检测了轻链处的V–J连接Igκ轨迹。PA112.2细胞（菌株129；Lκ，生殖系）暴露于CSR诱导剂48 h，AID和PSTsγ2b或ɛ的表达增加表明转换被激活，在CSR诱导物退出后持续8 h(图2D，E)。在接触STI571的细胞中，AID减少，Rag2随之增加，伴随着活性V_κ6–23–J型_κ1CJ地层(图2D，F)具有适当的连接多样性（补充图S12）。CSR诱导对V的后续生成没有影响_κ6–23–J型_κ1CJ（补充图S13）。STI571治疗后激活的PST表达表明，交换细胞群完全能够连接V（D）J(图2D，E)。我们得出的结论是，表达具有次级同种型的BCR的B细胞可能直接从BM中产生。有趣的是，在早期B细胞个体发生过程中，CSR或V（D）J基因程序可以交替表达，以响应特定的诱导物。

前B细胞的CSR模式偏向于IgG2b和IgE，是成熟B细胞的非典型。激活的成熟B细胞中的生殖系转录受伊格Eμ和3′Eα增强子与GLT启动子之间的长距离染色质接触位点（补充图S14A；Wuerffel等人，2007年;Sellars等人，2009年)。发育阶段特异性染色质结构中的γ3:γ1接触能否限制前B细胞中的CSR（补充图S14B）？使用染色体构象捕获（3C）碳拷贝（5C）方法无偏检测染色质接触(Dostie等人，2006年)，我们同时检查了12656个可能的循环相互作用矩阵伊格并将重点放在220kb的C上_H（H）跨域Eμ和3′Eα（补充材料；补充图S15；补充表S2、S3）。我们检测到大量γ3:γ1染色质相互作用(图3，橙色圆圈），表明在抹布2^−/−静止脾脏B细胞中不存在的前B细胞(图3)。我们检查了日志₂pro-B/静息B5C相互作用的比率（用红色[pro-B]和蓝色[resting B]表示图3)并证实前B细胞中γ3:γ1相互作用增强(图3)。我们发现Eμ：γ2b-ɛ和Eμ：β3–γ1接触分别与前B细胞和静止B细胞相关，符合潜在GLT表达和CSR的模式。相比之下，在第5染色体上的基因沙漠区域检测到的长程相互作用很少（补充图S16）。

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图3。

发育阶段特异性染色质构型伊格轨迹。5C分析伊格基因座抹布2^−/−前B细胞和静止的脾B细胞在5C数据的热图中表示（箱子大小30 kb；步长3.0 kb）。根据基因组距离绘制相互作用频率。蓝色强度表示基因组坐标之间的接触频率。对角线表示沿直线方向的频繁近端染色体内相互作用伊格轨迹。偏离对角线的5C信号表示循环交互。(赖特面板）日志₂pro-B（红色）和静息B（蓝色）接触时，pro-B/静息B 5C相互作用的比率。

3C研究证实了丰富的γ3：γ1a（1.7倍，P（P）=0.053）和γ3:γ1b（两倍，P（P）=0.01）染色质接触抹布2^−/−前B细胞与静止B细胞或ConA激活的脾T细胞相比，其中γ1a和γ1b是Hind III片段C的相反端(图4A、B).抹布2^−/−前B细胞和445.3前B细胞系显示出类似的γ3:γ1相互作用曲线，这表明在早期B细胞中，涉及γ3:β1的致密高阶染色质结构可能会限制CSR机制的可及性（补充图S17）。相反，在这两种材料中都观察到γ3:γ2b接触抹布2^−/−前B细胞和野生型静止B细胞彼此相似，可能与T细胞中不存在的空间组织有关(图4B).

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图4。

原B细胞中IgG3和IgG1 CSR的缺失与γ3和γ1基因座之间的环相互作用有关。(A类)一段伊格跨越220 kb的位点（如顶部)其中显示3C HindIII限制性片段（A、B、C、D和H）。(B类，C类)使用来自抹布2^−/−前B细胞、未刺激（US）或LPS+CD40L（LC）刺激的445.3细胞、野生型（WT）静止脾B细胞或ConA刺激的T细胞。(*)P（P）≤ 0.05; （ns）不重要。(B类)对锚固在γ3的3C分析与γ1或γ2b的相互作用进行分析。(C类)分析Hs3b，4（3′Eα）锚与Eμ、γ3或γ2b的相互作用。

因为远端Igh增强子与靶向C类_H（H）基因座对于使参与的S区域接近至关重要(Wuerffel等人，2007年)，我们检查了抹布2^−/−3C分析中这些染色质接触的pro-B和445.3细胞。3′Eα：Eμ（H-A）相互作用抹布2^−/−前B细胞和静止的脾B细胞同样丰富，并且显著高于ConA刺激的脾T细胞(图4C，左侧面板）。当LPS+IL4激活的B细胞中诱导CSR时，3′Eα：Eμ（H-A）相互作用相对于静止的B细胞升高(图4C，左侧面板）。值得注意的是，当用LPS+CD40L激活445.3原B细胞系以启动CSR时，3′Eα：Eμ（H-A）(P（P）<0.006）和hs3b，4:γ2b(P（P）<0.002）相互作用显著增加，而γ3:3′Eα相互作用保持不变(图4C，右侧面板）。因此，我们的结果表明，前B细胞中有一种独特的三维染色质结构，支持等型特异性CSR，并以发育阶段特异性的方式排除γ3和γ1 GLT的表达和CSR（补充图S14B）。

我们的研究结果表明，BM中的前B细胞可以经历强大的CSR，偏向于IgG2b和IgE，以响应特定刺激，随后V（D）J重组。因此，由于遗传易感性（如Omenn综合征）或环境线索而在BM中延迟的前B细胞有能力经历CSR，以应对细菌感染，并在V（D）J加入后最终填充外围。我们的发现还得出了另外两个结论。DNA损伤的起源使人想起某些人类白血病中RAG和AID活性(Tsai等人，2008年)很难解释。白血病中这种DNA损伤的足迹可能与我们在诱导转换的前B细胞中观察到的AID和RAG1/2的共表达有关。最值得注意的是，CSR与V（D）J在早期B细胞中的交替表达揭示了这些基因程序的意外灵活性，这对我们理解发育和谱系承诺具有重要意义。

材料和方法

简言之，根据机构和美国国立卫生研究院（NIH）指南处理小鼠。标准方案用于细胞培养、定量PCR、RT-PCR、DC-PCR、CT-PCR、逆转录病毒转导、统计分析和切换、Vκ-Jκ和Dκ_H（H）–J型_H（H）连接克隆。Abelson-MuLV转化的原B细胞或前B细胞系由B.Sleckman博士（圣路易斯华盛顿大学）提供。进行3C分析(Wuerffel等人，2007年)结合5′FAM/3′BHQ1改良探针。使用在线工具设计5C引物(http://my5C.umassme.edu)。按说明进行5C库施工(Dostie等人，2006年)。补充材料中提供了其他方法。

致谢

脚注

工具书类