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单元格元数据。作者手稿；PMC 2014年11月5日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格元数据。2013年11月5日；18（5）：10.1016/j.cmet.2013.09.013。
2013年10月17日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日至2013年9月13日
PMCID公司：项目经理3840163
尼姆斯：NIHMS526219
PMID：24140020

mTOR复合物2通过FoxO乙酰化和c-Myc上调控制胶质母细胞瘤的糖代谢

肯塔·马苏,1 田中和弘,1 大卫·阿卡万,1 伊万·巴比奇,1 比阿特丽斯·基尼,1 松谷富武,1 岩岛明夫（Akio Iwanami）,1 刘峰（音）,1 杰纳罗·R·维拉,1,2 顾玉超,1,2 卡尔·坎波斯,三 朱少军,2 杨慧君,1 威廉·H·勇,4,5 蒂莫西·F·克劳西,4,5,6 英戈·K·梅林霍夫,三 韦伯斯特·K·卡文尼,1,7 鲁本·J·肖,7,8和保罗·米舍尔1,7,9,*
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补充资料

总结

有氧糖酵解（Warburg效应）是癌症的核心特征，但其分子机制尚不清楚。在这里，我们确定了mTORC2在癌症代谢重编程中意外的中心作用，它通过最终调节c-Myc的细胞水平来控制糖酵解代谢。我们发现，mTORC2促进IIa类组蛋白脱乙酰化酶的失活磷酸化，导致FoxO1和FoxO3的乙酰化，进而从抑制性miR-34c依赖网络中释放c-Myc，乙酰化FoxO和c-Myc水平在临床样本中高度相关，GBM患者的生存期较短。这些结果确定了mTORC2在调节癌症糖酵解代谢中的特异性、Akt非依赖性作用。

简介

代谢重编程是癌症的核心特征(沃德和汤普森，2012年). 癌细胞将其大部分葡萄糖转化为乳酸，提供糖酵解中间体作为大分子生物合成的含碳前体。这种生物化学适应（Warburg效应）即使在有足够的氧气支持氧化磷酸化的情况下也会发生(Dang，2012年b;Koppenol等人，2011年;Vander Heiden等人，2009年;沃堡，1956年)，并使癌细胞能够满足肿瘤快速生长所带来的协调升高的合成代谢和能量需求(Tong等人，2009年). 揭示激活和维持Warburg效应的分子电路可能为癌症发病机制提供新的见解，可以通过确定新的药物靶点或检测耐药机制来加以利用。

C-Myc是癌细胞代谢的关键调节因子，包括Warburg效应(Dang等人，2009年). 在这里，我们报道了mTOR复合物2（mTORC2）在调节c-Myc水平和诱导胶质母细胞瘤（GBM）（最常见和最致命的脑癌形式）的代谢重编程中意外的Akt非依赖性作用。我们证明，在葡萄糖中生长GBM细胞需要mTORC2，而不是半乳糖，并证明这是通过调节细胞内c-Myc水平介导的。mTORC2通过IIa类组蛋白脱乙酰酶的Akt非依赖性磷酸化来控制这些水平，这导致FoxO1和FoxO3的乙酰化，导致c-Myc从抑制性miR-34c依赖性网络中释放。这一系列事件的最终结果是对PI3K和Akt抑制剂产生耐药性体内患者的生存期较短。

结果

mTORC2是葡萄糖中GBM生长所必需的，通过Myc-依赖性、Akt-非依赖性信号传导

为了确定mTORC2在调节糖酵解代谢中的作用，我们在表达EGFRvIII（GBM中一种常见的突变癌基因）的GBM细胞中使用rictor shRNA对mTORC1进行基因缺失(癌症基因组图谱研究网络，2008年). EGFRvIII能有效激活mTORC2（p-Akt S473和p-NDRG1 T346；田中等人，2011年)促进糖酵解基因表达、肿瘤细胞增殖和有氧糖酵化(Babic等人，2013年;郭等人，2009) (图S1A-S1C). 以剂量依赖的方式，利克托shRNA敲除抑制GBM细胞在葡萄糖中生长的能力，其影响在第2天变得明显，到第3天影响程度增加。相比之下，对照组和敲除利克托的GBM细胞在生长于半乳糖中的第3天显示出相似的增殖率，半乳糖是一种降低糖酵解通量并迫使细胞依赖线粒体氧化磷酸化的介质(Finley等人，2011年;Marroquin等人，2007年) (图1A). 此外，rictor过度表达使GBM细胞极易受到葡萄糖剥夺或糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）的治疗(图1B). Rictor shRNA敲除也抑制糖酵解基因表达(图1C和1D)显著抑制葡萄糖消耗、乳酸生成、谷氨酰胺摄取和谷氨酸分泌(图1E和第1e条)并且肿瘤细胞增殖有限体内GBM异种移植模型(图1D). 这些结果表明，mTORC2可促进糖酵解，增强GBM细胞在葡萄糖中生长的能力，但也使其更依赖糖酵化生存。

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通过c-Myc在葡萄糖中生长GBM需要mTORC2

（A） 在含有葡萄糖或半乳糖的培养基中培养的Scramb或Rictor击倒（KD）U87-EGFRvIII细胞的生长曲线。误差条，±SD。免疫印迹显示U87-EGFRvIII细胞中Rictor KD的验证。

（B） 用葡萄糖剥夺（Gluc-）或糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，10 mM）处理48小时后，GFP或Rictor过度表达U87细胞的细胞死亡。免疫印迹显示证实Rictor在U87细胞中过度表达。

（C） 对照组或Rictor KD U87-EGFRvIII细胞中糖酵解和磷酸戊糖途径（PPP）酶的mRNA水平。

（D） 以细胞为基础的免疫组化分析糖酵解酶和增殖标记物Ki-67在含有scramb或Rictor shRNA的U87-EGFRvIII异种移植瘤中的表达（n=3）。比例尺，50µm。NC表示每个样品的阴性对照获得的平均染色强度。

（E-G）对照组与Rictor KD U87-EGFRvIII细胞（E）结合c-Myc KD（F）或HIF-1αKD（G）的相对葡萄糖消耗量和乳酸生成量。

（H） 对U87细胞中Rictor过度表达和U87-EGFRvIII细胞中Rictor-KD的c-Myc表达进行生化分析。

（一） 用有关Akt、mTORC1（猛禽）和mTORC2（Rictor）的siRNA对U87-EGFRvIII细胞中的c-Myc进行免疫印迹分析。

除生长曲线（A）、SEM外的所有误差条。另请参阅图S1.

C-Myc siRNA敲除现象复制mTORC2基因缺失对糖酵解基因表达的影响(图S1D)，增加了mTORC2通过c-Myc控制GBM糖酵解代谢的可能性。Rictor siRNA敲除抑制c-Myc表达，而Rictor过度表达则有效增强mTORC2信号传导，导致c-Myc蛋白水平升高(图1H). 最重要的是，c-Myc siRNA敲除完全消除了mTORC2基因缺失对糖酵解的抑制作用(图1F和S1F级). HIF-1α也被认为是癌症糖酵解表型的关键调节因子(Kaelin和Ratcliffe，2008年;Tong等人，2009年)据报道受mTOR信号调节(Hudson等人，2002年). 与c-Myc相比，siRNA敲除导致HIF-1α基因缺失并没有改变mTORC2基因缺失对葡萄糖消耗、乳酸生成、谷氨酰胺摄取和谷氨酸分泌的抑制作用(图1G和S1G系列). 综上所述，这些结果表明，mTORC2通过c-Myc调节GBM细胞的糖酵解代谢。

mTORC2被认为通过Akt控制糖酵解代谢(当，2012年b;Hagiwara等人，2012年;Plas和Thompson，2005年). 然而，rictor敲除几乎完全抑制c-Myc表达，而Akt或raptor（mTORC1）缺失对c-Myc水平的影响不大(图1I). 这些结果增加了mTORC2独立于Akt或mTORC1调节c-Myc和GBM细胞糖酵解代谢的可能性。

mTORC2通过FoxO乙酰化调节c-Myc水平和糖酵解

为了确定mTORC2调节糖酵解代谢的Akt非依赖性机制，我们检测了FoxO转录因子家族的两个翻译后修饰。通过Akt使磷酸化失活并随后对FoxO进行核排斥是PI3K激活的肿瘤细胞增加糖酵解的一种非常明确的机制(Biggs等人，1999年;Dang，2012年b)可能通过减轻c-Myc的抑制(Dang，2012年a;Ferber等人，2012年;Peck等人，2013年). 我们推断，mTORC2对FoxO的Akt非依赖性调节可能是一种替代性翻译后修饰。

正如预期的那样，PI3K或Akt的药物抑制能有效降低FoxO磷酸化(图2A). 然而，令人惊讶的是，在使用LY294002（pan-PI3K抑制剂）或Akti-1/2（Akt抑制剂）处理的GBM细胞中，使用经验证的抗乙酰-FoxO1抗体检测到乙酰化FoxO水平升高以及c-Myc表达增加，通过FoxO乙酰化提高补偿性反馈调节维持c-Myc表达的可能性(图2A). 通过IP分析，我们确定了由于rictor shRNA敲除导致mTORC2基因缺失，从而降低了乙酰化FoxO1和3的水平(图2B). Rictor击倒也增加了FoxO-DNA复合物的形成(图2C)，增强FoxO靶基因表达(图S2A)并以FoxO依赖方式调节c-Myc和糖酵解基因的表达(图S2D和S2E). 相反，rictor过度表达增加了FoxO乙酰化水平(图S2B)并抑制FoxO-DNA复合物的形成(图2C). 总之，这些结果表明，mTORC2通过调节FoxO乙酰化来控制GBM中c-Myc的表达和糖酵解代谢。

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mTORC2通过FoxO乙酰化调节c-Myc和糖酵解

（A） 经Akt抑制剂（Akti-1/2）或Pan-PI3K抑制剂（LY294002）处理24h的U87-EGFRvIII中磷酸化FoxO、乙酰化Fox0和c-Myc蛋白水平。

（B） 在与GFP-FoxO1和Flag-FoxO3共转染的U87-EGFRvIII细胞中，乙酰赖氨酸（Ac-K）与FoxO质粒的关联性的IP分析，并使用或不使用Rictor耗尽。

（C） 使用来自具有Rictor过表达或Rictor KD的U87的核提取物的EMSA测定，显示DNA/FoxO蛋白EMSA复合物。TATA-结合蛋白（TBP）的免疫印迹用于归一化核提取物的蛋白质负荷。定量条形图显示了各组的相对DNA/FoxO复合物水平。

（D） GFP-FoxO1突变体示意图：3A，Akt介导的磷酸化抗性；5KR，抗乙酰化；5KQ，组成乙酰化形式。免疫荧光图像表示表达GFP-FoxO1和突变体的U87-EGFRvIII细胞。比例尺，20µm。

（E） 野生型3A-或5KR-FoxO1对c-Myc和裂解PARP影响的免疫印迹分析。

（F） 空载体或过表达U87-EGFRvIII细胞的FoxO1-5KR突变株中的相对葡萄糖消耗量、乳酸生成量、谷氨酰胺摄取量和谷氨酸分泌量，无论c-Myc是否耗竭。

（G） 用Rictor表达载体和野生型/突变型FoxO表达载体共转染的U87细胞中c-Myc的免疫印迹评估。

误差条，SEM。另请参阅图S2.

为了更好地理解FoxO乙酰化在调节mTORC2依赖性糖酵解代谢中的作用，我们使用了一组在关键磷酸化和/或乙酰化位点突变的FoxO质粒(Biggs等人，1999年;Brunet等人，2004年;Nakamura等人，2000年;范德霍斯特和汉堡，2007年;赵等，2010) (图2D). 这些战略性结构使我们能够比较每个翻译后修饰在调节糖酵解代谢中的相对作用。正如预期的那样，一个磷酸化抗性突变体FoxO1-3A和另一个磷酸化抗性突变体（FoxO3-TM，数据未显示）定位于细胞核，抑制c-Myc表达，并诱导肿瘤细胞凋亡(图2D和2E). 一个乙酰化抗性突变体（FoxO1-5KR）和一个类似的FoxO3突变体（FoxO3-4KR，数据未显示）也定位于细胞核，类似地抑制c-Myc表达并诱导GBM细胞凋亡(图2D和2E)从而表明FoxO的翻译后修饰都可以调节c-Myc的表达。因此，我们引入了一个含有诱导磷酸化抗性残基的双突变体和模拟组成乙酰化的额外残基。该FoxO1-3A-5KQ结构被排除在细胞核之外，部分恢复了c-Myc水平，并抑制了FoxO1-3突变体诱导的细胞凋亡(图S2C). 这些结果表明，FoxO乙酰化相对于磷酸化在调节c-Myc和GBM细胞存活方面起主导作用，并表明FoxO调节的双赢机制是通过两种不同的翻译后修饰实现的。为了确定FoxO乙酰化是否是GBM细胞糖酵解表型的关键决定因素，我们评估了乙酰化抗性突变对糖酵分解的影响。引入FoxO1-5KR乙酰化抗性突变体可降低糖酵解，抑制葡萄糖和谷氨酰胺的摄取，并抑制乳酸和谷氨酸的分泌(图2F). 重要的是，FoxO1-KR突变对糖酵解的抑制作用被c-Myc siRNA完全消除(图2F). 此外，mTORC2上调c-Myc的表达也被FoxO1-5KR突变体完全阻断(图2G). 综上所述，这些结果表明，mTORC2通过FoxO乙酰化调节GBM细胞中c-Myc的表达和糖酵解。

mTORC2通过IIa类HDAC控制FoxO乙酰化，与Akt无关

FoxO的乙酰化部分是通过组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）之间的平衡来控制的(范德霍斯特和汉堡，2007年,Mihaylova等人，2011年;Wang等人，2011年). 基因表达微阵列分析仅鉴定出HAT和HDAC家族中差异表达的两个基因，即HDAC4和HDAC5（IIa类HDACs），这两个基因在mTORC2信号升高的EGFRvIII表达肿瘤中均显著降低(图S3A). 然而，它们在我们的细胞系统中的下调水平是适度的。因此，我们专注于其他可能更与GBM相关的调节机制，包括翻译后修饰(Mihaylova等人，2011年). 我们测试了mTORC2依赖性FoxO乙酰化通过灭活IIa类HDAC的磷酸化介导的可能性。用rictor siRNA去除mTORC2基因可抑制IIa类HDAC磷酸化，同时抑制FoxO乙酰化和c-Myc表达缺失(图3A). 相反，rictor过表达显著增强HDAC4、HDAC5和HDAC7磷酸化(图3B). 重要的是，使用siRNA敲除的Akt或raptor（mTORC1）基因缺失并没有抑制IIa类HDAC磷酸化或调节乙酰化FoxO和c-Myc的水平。此外，在一组GBM细胞系中，HDAC4的磷酸化水平与mTORC2信号通路相关(图3C,S3B和S3C). 此外，IIa类HDAC的表达水平与其磷酸化状态呈负相关(图3C和第三方银行)，未来的研究将有必要评估EGFR/mTORC2信号通过磷酸化破坏IIa类HDAC的稳定性来控制其水平的可能性(Potthoff等人，2007年)或者减少他们的转录(图S3A). 这些结果证明了mTORC2在调节GBM中IIa类HDAC磷酸化中的特殊作用，该作用独立于Akt。值得注意的是，这种mTORC2-HDAC-FoxO-Myc轴也在其他癌症类型中发现。在EGFR突变体H1650非小细胞肺癌细胞中，rictor敲除抑制HDAC4磷酸化并消除乙酰化FoxO和c-Myc的表达(图3D). 此外，对H1650细胞、A549非小细胞肺癌细胞和HeLa宫颈癌细胞中Akt、mTORC1和mTORC2的药理学抑制证实，mTORC_2信号的抑制与FoxO乙酰化的丢失和c-Myc的抑制相关，并且这些作用明显与Akt无关(图S3D). 这些结果并不排除mTORC1在其他癌症类型中控制c-Myc水平的作用，而是表明此处确定的mTORC2依赖、Akt非依赖、Myc依赖途径可能不仅限于GBM，而且可能在更广泛的癌症亚型中活跃。

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mTORC2通过IIa类HDAC控制FoxO乙酰化，与Akt无关

（A） 对U87-EGFRvIII细胞中的c-Myc、磷酸化HDAC和几种形式的FoxO进行免疫印迹分析，显示与Akt和mTOR复合物有关的siRNA。

（B） 免疫印迹显示过度表达GFP或Rictor DNA质粒的U87细胞磷酸化IIa类HDAC的变化。

（C） 免疫印迹分析几个胶质瘤细胞系中p-EGFR、p-NDRG1和IIa类HDAC的状态。

（D） 对EGFR-突变的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞（H1650）中磷酸化HDAC、乙酰化FoxO和c-Myc进行免疫印迹分析，显示关于Akt和mTOR复合物的KD。

（E） 免疫印迹显示U87细胞中乙酰化FoxO和c-Myc的变化，并显示针对IIa类HDAC的siRNA。

（F） siRNA介导的HDAC4/5缺失后FoxO靶基因U87细胞的qRT-PCR。

（G） 免疫印迹显示携带siRNAs的U87细胞的c-Myc数量对抗IIa类HDAC，并伴有FoxO DNA质粒的过度表达。

（H） 加或不加c-Myc缺失的Scramb或IIa类HDAC KD U87细胞的细胞增殖试验。siHDAC细胞与干扰siRNA细胞或siHDAC/siMyc细胞之间的比较p<0.01。误差线，±SD。

除生长曲线（H）、SEM外的所有误差线。另请参阅图S3.

接下来，我们评估了GBM细胞对IIa类HDAC调节FoxO乙酰化和Myc表达的依赖性。敲除IIa类HDAC增加了FoxO乙酰化和c-Myc的表达(图3E)，损害FoxO转录活性(图3F). 通过siRNA敲除对IIa类HDAC进行基因耗竭，或对IIa级HDAC进行药物抑制，消除了蓖麻敲除对c-Myc表达的影响(图S3E和S3F)，表明mTORC2通过IIa类HDAC调节c-Myc。此外，抗乙酰化FoxO1-5KR突变体阻止了c-Myc对IIa类HDAC敲除的上调(图3G)，证实IIa类HDAC通过FoxO乙酰化调节c-Myc。更重要的是，IIa类HDAC的敲除促进了GBM细胞的增殖，而c-Myc的共同缺失则逆转了这种增殖(图3H). 综上所述，研究结果表明，mTORC2灭活IIa类HDAC的磷酸化可控制FoxO乙酰化和c-Myc水平，促进GBM增殖。

乙酰化FoxO通过miR-34c调节c-Myc

FoxO对抗c-Myc(Dang，2012年a,Ferber等人，2012年;Peck等人，2013年)可能通过增加miR-145的表达(Gan等人，2010年)和miR-34c(Kress等人，2011年)限制c-Myc mRNA的稳定性和翻译。在GBM细胞中，miR-145和miR-34c水平均被FoxO1/FoxO3敲除所抑制(图4A)以及miR-34c或miR-145或其抗miR结构的引入，证明了这两种微RNA调节GBM细胞中的c-Myc水平(图4B). 为了确定这些microRNA是否由FoxO的差异翻译后修饰独立调节，我们利用了FoxO磷酸化和乙酰化突变体。将FoxO磷酸化抗性突变体（FoxO1-3A）引入GBM细胞上调miR-145的表达，但不上调miR-34c的表达(图4C). 相反，乙酰化抗性突变体（FoxO1-5KR）的引入增加了miR-34c的表达，但没有增加miR-145的表达(图4C). ChIP分析进一步表明，FoxO1-5KR乙酰化抗性突变体优先富集在miR-34c启动子区域，而不是miR-145启动子区域(图4D)抗miR-34c逆转了FoxO1-5KR乙酰化抗性突变体引起的c-Myc表达下降，而抗miR-145则没有逆转(图4E). 此外，mTORC2激活导致miR-34c表达减少，但miR-145没有减少(图4F)而rictor击倒部分恢复了抗miR-34c对c-Myc的抑制，而抗miR-145则没有(图4G). 抗miR-34c对c-Myc表达的影响是有限的，这表明除了miRNA调节外，考虑到c-Myc的表达和活性在多个水平上受到多种因素的调节，rictor可能还具有其他功能来控制c-Myc(Albihn等人，2010年;Liu和Levens，2006年). 综上所述，这些结果表明乙酰化FoxO通过减轻miR-34c依赖性抑制而增加c-Myc水平。

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乙酰化FoxO通过miR-34c调节c-Myc

（A） 打乱与FoxO KD U87细胞中miR-145和miR-34c的相对表达。

（B） 含有miRNA模拟物的U87-EGFRvIII细胞和含有miRNA抑制剂的U87细胞中的Myc蛋白水平。

（C） 转染指定FoxO质粒的U87-EGFRvIII细胞中miR-145和miR-34c的相对表达变化。

（D） 对转染对照载体或GFP-FoxO1-5KR的U87-EGFRvIII细胞进行ChIP分析，并评估miR-34c启动子中结合元件（BEs）的GFP-FoxO1恢复(Kress等人，2011年)和miR-145启动子(Gan等人，2010年)地区。

（E） 在U87-EGFRvIII细胞中，通过抑制miR-34c而非miR-145，5KR-FoxO1介导的c-Myc下调被逆转。

（F） 用空载体或Rictor表达载体转染的U87细胞中miR-145和miR-34c的mRNA变化。

（G） 免疫印迹评估联合转染shRictor和miRNA抑制剂的U87-EGFRvIII细胞中c-Myc的变化。

误差线，SEM。

对PI3K和Akt抑制剂的耐药性由FoxO的mTORC2依赖性乙酰化和c-Myc水平的维持介导

证明FoxO及其对c-Myc的下游调控是通过两条独立且高度特异的翻译后修饰和microRNA抑制途径来控制的，我们推断，持续c-Myc活性对PI3K或Akt抑制剂的治疗耐药性可能是一个关键的潜在临床可操作的后果。为了验证这一假设，我们研究了PI3K或Akt的药物抑制对FoxO乙酰化、c-Myc表达和肿瘤细胞存活的影响。用LY294002或Akti1/2处理GBM细胞分别抑制PI3K和Akt信号传导，但未能促进FoxO靶基因表达，同时伴随着p-NDRG1和rictor水平的代偿性升高(图5A、5B和S4A系列). 这种对FoxO活性的持续抑制是通过mTORC2介导的，因为在PI3K或Akt抑制存在的情况下，rictor敲低显著提高了FoxO靶基因的表达(图5B和S4A系列). mTORC2和PI3K/Akt的联合抑制使FoxO活性恢复显著，这可能是因为mTORC1抑制可以通过乙酰化以及Akt和SGK1依赖性磷酸化调节FoxO功能(Guertin等人，2006年;Zhao等人，2011年). 此外，通过联合抑制PI3K/Akt和mTORC2，FoxO活性的恢复被IIa类HDACs抑制所逆转，其程度大于通过表达组成活性形式的Akt（HA-Akt-E17K），这表明乙酰化在调节FoxO转录活性中占主导地位(图S4B和S4C). 重要的是，用PI3K或Akt抑制剂处理GBM细胞可显著提高c-Myc水平，而乙酰化耐受性FoxO1-5KR突变体可完全逆转这一点(图5C)然后被里克托击倒(图5D). 此外，用Akti-1/2处理GBM细胞实际上增加了糖酵解酶LDHA、HK2、PDK1和GLUT1的mRNA水平，这一点被蓖麻击倒完全消除(图5E). 综上所述，这些结果强烈表明，经PI3K或Akt抑制剂处理的GBM细胞保持c-Myc水平，并通过mTORC2反馈型FoxO乙酰化增强糖酵解。

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对PI3K和Akt抑制剂的耐药性由FoxO的mTORC2依赖性乙酰化和c-Myc的维持介导

（A） pNDRG1蛋白的Western blotting和Rictor mRNA的qRT-PCR显示U87-EGFRvIII细胞在Akt/PI3K抑制下mTORC2激活。

（B） 用PI3K/Akt抑制剂处理U87-EGFRvIII细胞24小时，结合或不结合Rictor KD，对FoxO靶基因进行qRT-PCR分析。同时瞄准PI3K/Akt和mTORC2可显著恢复FoxO活动。

（C） 用PI3K/Akt抑制剂处理C-Myc基因的U87-EGFRvIII细胞，转染或不转染FoxO1-5KR后进行qRT-PCR。

（D） PI3K/Akt抑制剂联合或不联合Rictor KD治疗的U87-EGFRvIII细胞中c-Myc的免疫印迹评估。

（E） PI3K/Akt抑制剂联合或不联合Rictor KD处理的U87-EGFRvIII细胞中Myc相关代谢酶mRNA水平。

误差条，SEM。另请参阅图S4.

PI3K/Akt和mTORC2联合抑制乙酰化FoxO-c-Myc信号转导促进肿瘤细胞死亡

如果mTORC2-dependent FoxO乙酰化维持c-Myc水平以驱动PI3K或Akt抑制剂耐药性，那么mTORC2和PI3K或者Akt的联合抑制应该会降低c-Myc的细胞水平，从而可能导致肿瘤细胞死亡。与此假设一致，rictor shRNA敲除与LY294002或Akti-1/2协同导致GBM肿瘤细胞死亡(图6A和6B). 因此，我们询问PI3K和mTOR激酶的双重药物抑制是否也能抑制FoxO乙酰化，降低c-Myc水平，降低糖酵解酶表达，并导致肿瘤细胞死亡。为了验证这一点，我们治疗了患者衍生的GBM异种移植模型TS516(Rohle等人，2013年)具有双重PI3K/mTOR抑制剂XL765（SAR245409）(图6C). XL765抑制mTORC2信号传导，阻断FoxO乙酰化，增加miR-34c表达，降低c-Myc的细胞水平，降低糖酵解酶LDHA和HK2的表达。最重要的是，XL765能有效抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡(图6C). 目前，不存在特定的mTORC2抑制剂，化合物和具有ATP-竞争性的mTOR激酶抑制剂如XL765也会影响mTORC1信号传导。然而，在mTORC2敲除实验的背景下(图6A和6B)这些结果表明，mTORC2的药理抑制可防止c-Myc依赖性PI3K抑制剂的耐药性(Dang，2012年a;Ilic等人，2011年;Muellner等人，2011年)通过抑制FoxO乙酰化。

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PI3K/Akt和mTORC2的联合抑制抑制乙酰化FoxO-Myc信号传导并促进肿瘤细胞死亡

（A） PI3K/Akt抑制剂处理U87-EGFRvIII细胞24小时后，结合或不结合Rictor KD进行TUNEL染色。绿色，TUNEL染色；蓝色，DAPI染色。

（B） 经PI3K/Akt抑制剂处理的定量TUNEL阳性U87-EGFRvIII细胞，条形图中结合或不结合Rictor KD。

（C） 将EGFR-amplified patient derived TS516 GBM肿瘤球植入免疫缺陷小鼠体内，随后用双重PI3K/mTOR抑制剂XL765治疗。代表性免疫印迹显示FoxO乙酰化、c-Myc和糖酵解酶表达以及凋亡肿瘤细胞死亡（裂解PARP）的状态。miR-34c的相对表达式如方框图所示。通过使用长度和宽度测量载体治疗组（n=5）和XL765治疗组（n=5）的肿瘤体积。

误差线，SEM。

临床人类GBM中mTORC2/乙酰化FoxO/c-Myc的改变

为了探讨mTORC2-acetylated FoxO-Myc信号转导的临床意义并评估其对预后的影响，我们对包含26个正常大脑样本和80个GBM肿瘤样本的组织芯片（TMA）进行了免疫组织化学分析(图7A). 与正常大脑相比，GBM中乙酰化FoxO和c-Myc均高度升高（Ac-FoxO:p=0.013883，c-Myc:p=9.58832E-05），分别在45.0%和58.8%的肿瘤中上调(图7A). mTORC2信号（由pNDRG1测量；田中等人，2011年)乙酰化FoxO和c-Myc也高度相关(图7B-7D,S5A和S5B). GBM尸检样本的免疫印迹分析证实，与正常大脑相比，肿瘤组织中的mTORC2-acetylated FoxO-Myc轴以及糖酵解酶协同增加(图S5C和S5D)发现乙酰化FoxO和c-Myc升高高度相关（Spearman秩相关系数，r2=0.8288）。最后，TMA上乙酰化FoxO和c-Myc升高与GBM患者总生存期缩短显著相关（c-Myc为0.0367，Ac-FoxO为0.0799；图7E和S5E系列). 这些结果表明，mTORC2信号、乙酰化FoxO和c-Myc表达在预后较差的GBM患者中协调上调(图7F).

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mTORC2信号传导、乙酰化FoxO和c-Myc表达在活检样本中高度相关，并与GBM患者的不良预后相关

（A） GBM组织微阵列（TMA）的Ac-FoxO和c-Myc免疫染色，包括80个GBM样本和26个正常脑组织。高倍镜下TMA载玻片和阴性和阳性核心的视图，显示Ac-FoxO的细胞质染色和c-Myc的细胞质/核染色。Ac-FoxO和c-Myc分别在45.0%和58.8%的肿瘤中上调。

（B） 基于Ac-FoxO与c-Myc相关性的TMAs免疫组织化学分析。

（C） 条形图显示基于TMA的Ac-FoxO阳性或阴性肿瘤与p-NDRG1 IHC阳性的差异关联。

（D） 基于TMA的c-Myc+/-肿瘤与p-NDRG1免疫阳性的差异关联。P值通过χ确定2用于独立性测试（B-D）。

（E） 通过c-Myc表达分类的36例原发性和继发性GBM样本的Kaplan-Meier生存分析。使用Log-rank（Mantel-Cox）检验确定Kaplan-Meier生存曲线分析的p值。

（F） mTORC2通过乙酰化抑制FoxO活性，从而绕过PI3K/Akt抑制，导致c-Myc上调，c-Myc是GBM细胞增殖和肿瘤代谢的关键下游效应器。

另请参见图S5.

讨论

Warburg效应使癌细胞能够获得足够的快速细胞增殖所需的大分子前体，同时仍能满足其能量需求(Tong等人，2009年). C-Myc在调节癌症的代谢特征中起着核心作用(凯恩斯等人，2011年;Debrardinis等人，2008年;Koppenol等人，2011年;Levine和Puzio-Kuter，2010年;Vander Heiden等人，2009年;沃德和汤普森，2012年). 尽管许多受体信号通路包括Wnt、Shh、Notch、TGF-β和RTK信号通路通过PI3K通路参与Myc的上调(Dang，2012年a）)突变的生长因子受体信号通路参与c-Myc的机制尚不完全清楚。

我们最近发现EGFRvIII通过依赖hnRNPA1的Myc结合伙伴Max的选择性剪接调节糖酵解代谢和肿瘤生长(Babic等人，2013年). 这种选择性剪接产物Delta Max可以促进GBM细胞在葡萄糖中的增殖，并且是Myc依赖型肿瘤生长所必需的(Babic等人，2013年). 结合本文的结果，正在出现一种模型，其中GBM中异常的生长因子受体信号通过两种互补和交错机制与c-Myc信号联系：1）Delta Max的选择性剪接(Babic等人，2013年)如图所示，通过mTORC2调节c-Myc功能和2）控制c-Myc的细胞水平。重要的是，这两种机制都需要通过Myc依赖的糖酵解代谢的影响来促进GBM的生长，因为Delta Max的基因缺失(Babic等人，2013年)或mTORC2(图1)阻断GBM细胞以c-Myc依赖方式利用葡萄糖而非半乳糖促进肿瘤细胞增殖的能力。这些机制也似乎是协同作用的，在c-Myc调节的不同点发挥作用，从而突出了c-Myc在GBM发病机制中的作用，并表明其致病性，至少部分是通过糖酵解代谢上调介导的。

这项研究的一个令人惊讶的启示是，经PI3K或Akt抑制剂处理的GBM细胞通过mTORC2反馈型FoxO乙酰化保持c-Myc水平并增强糖酵解。我们表明，FoxO及其对c-Myc的下游调控通过两条独立且高度特异的翻译后修饰和microRNA抑制途径严格控制。一种途径是Akt使FoxO磷酸化失活，这是一种特征明确的机制，使PI3K活化的肿瘤细胞与c-Myc结合(Biggs等人，1999年;Bouchard等人，2004年;Delpuech等人，2007年;Dang，2012年a;Peck等人，2013年)，通过减轻FoxO-依赖性miR-145对c-Myc的抑制。(Gan等人，2010年). 相反，这里显示的结果确定了调控FoxO-Myc轴以控制糖酵解的中心机制，因为我们证明mTORC2通过IIa类HDAC控制FoxO的乙酰化，与Akt无关。

此处确定的途径补充了先前证明的mTORC2通过Akt活化调节肝脏和癌细胞糖酵解的能力(当，2012年b;Hagiwara等人，2012年;Plas和Thompson，2005年)提供了另一个重要的信号机制，通过该机制，生长因子受体突变和肿瘤抑制因子丢失促进了癌症中的Warburg效应(Bensaad等人，2006年;Christofk等人，2008年;Dang，2012年b;Faubert等人，2013年;Tong等人，2009年;Vander Heiden等人，2009年;沃德和汤普森，2012年). 因此，mTORC2通过两种机制（Akt依赖和Akt非依赖信号传导）成为癌细胞代谢的一个特别关键的调节器，每种机制都通过FoxO的不同翻译后修饰来调节c-Myc的细胞水平，以通过不同的抑制性microRNA网络缓解c-Myc抑制。FoxO是生长因子受体PI3K信号和c-Myc之间的关键中间产物；因此，FoxO-Myc轴并不奇怪(Biggs等人，1999年;Bouchard等人，2004年;Delpuech等人，2007年;Dang，2012年a;Peck等人，2013年)已经演变为受到这种双管齐下的翻译后控制。mTORC2调节FoxO-c-Myc轴调节的两种机制，这表明它是癌症中的关键代谢调节器，除了Akt外，还必须抑制它以消除c-Myc依赖性糖酵解和肿瘤生长。

实验程序

基于图像分析的免疫组织化学评分

使用软成像系统软件（Olympus MicroSuite Analytical Suite）进行定量图像分析。使用安装在奥林巴斯BX61显微镜上的Colorview II相机拍摄每个免疫染色切片的代表性图像。根据H&E染色评估，从肿瘤细胞含量足够高的代表区域捕获图像。单个单元格之间的边界使用过滤函数近似。通过测量红棕色色调范围内每个细胞的平均饱和度来确定每个细胞的反应产物量。每个标记物每例（平均）测量1000–1500个细胞。也对没有初级抗体的每个切片进行阴性对照染色，以确定免疫阳性阈值。

组织芯片（TMA）

TMA是按照之前的报告建造的(郭等人，2009)如前所述进行免疫组织化学染色(Choe等人，2003年;Lu等人，2009年)分析80个GBM样本和26个正常脑样本中Ac-FoxO、c-Myc、p-NDRG1和Rictor的表达。病理学家对脑芯进行评分，并将肿瘤染色强度与正常脑组织进行比较。

亚细胞分馏和电泳迁移率变化分析（EMSA）

根据制造商的说明（Active Motif），使用试剂盒从10 cm的亚汇合板中制备核分馏。使用EMSA“凝胶转移”试剂盒（泛组学）进行EMSA。核提取物与含有人类FoxO共识结合序列的生物素标记寡核苷酸（5'-CAAAACAAACAAAAACACAAAAAAACAA-3'）孵育，通过6%聚丙烯酰胺凝胶电泳从未结合寡核苷酸中分离转录因子结合寡核苷酸。在转移到尼龙膜（GE Healthcare）后，使用基于辣根过氧化物酶的化学发光观察生物素标记带。

突变

为了产生5KR（使用FoxO1）和5KQ（使用FoxO1和FoxO1-AAA）突变体，我们替换了先前报道的主要乙酰化位点(范德霍斯特和汉堡，2007年;赵等，2010)K245、K248、K262、K265和K274分别含有精氨酸或谷氨酰胺。为了产生4KR（使用FoxO3）突变体，我们替换了乙酰化位点(范德霍斯特和汉堡，2007年)含有精氨酸的K242、K259、K271和K290。我们使用快速更换试剂盒（Stratagene）进行了定点突变。

代谢物测量

使用BioProfile Basic 4分析仪（Nova Biomedical）测量培养细胞培养基中的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸。将含1%FBS的新鲜培养基添加到一个6孔板的亚汇合细胞中，24小时后通过与无细胞空白培养基的比较测量培养基中的代谢物浓度，并将其归一化为每个孔中的细胞数。

实时RT-PCR和miRNA研究

使用RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN）提取总RNA。使用SuperScript III转录酶（Invitrogen）合成第一链cDNA。按照制造商的说明，在iCycler（Bio-Rad）上使用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行实时RT-PCR。可根据要求提供引物序列。使用mirVana miRNA分离试剂盒（Applied Biosystems）提取microRNA。微RNA逆转录由TaqMan microRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）进行，miR-145、miR-34c和RNU19的表达由TaqMan microRNA Assays（AppliedBiosystoms）检测。β-actin被用作qRT-PCR的内源性对照，RNU19被用作miRNA分析的内源性控制。

糖依赖性细胞增殖和细胞死亡检测

细胞以2.5×10的比例放置在96个平板中三细胞/孔置于100µl生长培养基中，然后在每个处理条件下培养。如前所述，在测量葡萄糖依赖性增殖时，使用含有葡萄糖（Cellgro）的DMEM或添加4.5g/l半乳糖（Sigma）的非葡萄糖DMEM(Finley等人，2011年). 根据制造商的说明，用细胞增殖测定试剂盒（Millpore）检测细胞增殖。用微孔板阅读器（Bio-Rad）在420至480nm处测量处理和未处理细胞的吸光度。对于葡萄糖依赖性细胞死亡分析，用无葡萄糖DMEM+10%FBS+半乳糖（4.5g/l）或DMEM+10%FBS+2-D脱氧-D-葡萄糖（2-DG，10mM）培养细胞48小时，并通过台盼蓝排除细胞计数和TC10™自动细胞计数器（Bio-Rad）对活/死细胞进行量化。数据表示三个独立实验的平均值±SD。

动物研究

TS516肿瘤球细胞系源自纪念斯隆-凯特琳癌症中心的GBM患者，或U87和U87-EGFRvIII细胞系植入免疫缺陷SCID/米色小鼠进行皮下异种移植研究。SCID/米色小鼠在加州大学洛杉矶分校实验放射肿瘤学部实验动物护理评估协会批准的动物设施中繁殖并保持在规定的无病原体条件下。对于皮下植入，将培养的指数生长的肿瘤细胞进行胰蛋白酶化，通过台盼蓝排除计数，并在3×10的条件下重新悬浮6在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水和Matrigel（BD Biosciences）溶液中每毫升细胞数。通过测量每个皮下肿瘤的垂直直径，用卡尺监测肿瘤生长。每天用PI3K/mTOR双抑制剂（XL765；60mg/kg）或生理盐水治疗肿瘤19天。如果肿瘤最大直径达到14毫米或动物出现疾病迹象，则对小鼠实施安乐死。所有实验都是在加州大学洛杉矶分校校长动物研究委员会批准后进行的。

统计分析

除非另有说明，否则将进行未配对学生t测试。除非另有说明，误差条代表SEM，统计显著性表示为*p<0.05、**p<0.01和**p<0.001。

​

亮点

  • 葡萄糖中GBM细胞的生长需要mTORC2
  • mTORC2通过调节细胞水平的c-Myc来控制糖酵解代谢
  • mTORC2信号转导乙酰化FoxO1和FoxO3上调c-Myc
  • mTORC2、乙酰化FoxO和c-Myc轴使患者生存期缩短

补充材料

01

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致谢

我们感谢Cameron Brennan博士和Alicia Pedraza（纪念斯隆-凯特琳癌症中心）慷慨地为我们提供TS516 GBM球形细胞系，感谢Ciro Zanca博士、Tomoyuki Koga、John Anzola和Yuki Ishii（路德维希癌症研究所）为我们提供GBM6、GBM39、H1650、A549和HeLa细胞系，加州大学洛杉矶分校脑肿瘤转化资源，用于生物标本和生物储存支持。Exelixis/Sanofi向Mellinghoff博士提供了PI3K/mTOR双重抑制剂XL765（SAR245409）。这项工作得到了国家神经疾病和中风研究所（NS73831）、国家癌症研究所（CA119347）、本和凯瑟琳·艾薇基金会（the Ben and Catherine Ivy Foundation）的资助，以及齐尔林家庭基金会（Ziering Family Foundation）为纪念西吉·齐尔林（Sigi Ziering）而提供的慷慨捐款。世卫组织神户中心（WKC）是国家癌症研究基金会（National Foundation for Cancer Research）的研究员。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

所有作者均未报告利益冲突。

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