开发过程中新对象的确定和位置识别

摘要

1.简介

以前关于海马依赖性学习和记忆的发展涌现的研究主要集中在强化驱动任务上，如巴甫洛夫恐惧条件反射和食欲迷宫学习[4–6]. 通常，与不需要海马体的控制任务相比，海马体依赖性变体在个体发育中的表现较晚。例如，听觉恐惧条件作用在出生后第16-18天出现，然后是背景恐惧条件作用，大约在出生后23天出现[4,7–9]T迷宫延迟交替的发展晚于位置辨别[5,10]. 这些发现被归因于海马发育和功能的延迟，这导致空间学习的发展晚于非空间学习。

偶然学习包括动物在受到新的环境刺激时的自然探索倾向[11,12]. 偶然学习有空间和非空间两种变体。标准物体识别任务（OR）包括接触两个相同的物体（样品阶段）。经过一段时间的延迟，动物会被呈现出一个熟悉的以及一个新的物体（测试阶段）。空间变量，物体定位任务（OL）与物体版本相同；然而，测试阶段包括位于新空间位置的熟悉物体[1,13–18]在这两种情况下，对新对象或位于新位置的对象的偏好是样本阶段偶然学习和测试阶段探索行为的结果。一次实验的物体识别范式提供了一个机会，可以在不需要重复条件反射试验或强化偶然事件的情况下，检查海马体的偶然连接加工功能。偶然学习被认为比强化驱动学习对海马功能的破坏更敏感[12].

不同的大脑区域有助于OR和OL任务的执行，至少在成年期是这样。嗅周皮层（PER）是OR任务执行所必需的，而海马（HPC）是OL任务执行所需的[1,15–18]. 对OR任务和海马NMDA-受体（NMDAr）功能的研究产生了混合的结果，这取决于样本和测试阶段之间的延迟时间间隔[19]. 例如，在获得or任务之前全身或海马内给药的NMDAr拮抗剂会以1至24小时的延迟破坏表现。[20–23]. 然而，在样本和测试阶段之间有5分钟的延迟时间，进行海马内注射后，OR性能保持不变[22]. 同样，在样本期之前，鼻腔周围皮质内注射AP5会在3小时而不是5分钟延迟后损害OR[24]. 对成年大鼠的研究表明NMDAr在OL任务中的作用[25,26]; 然而，据我们所知，NMDAr拮抗剂在OR和OL任务中的作用尚未在开发过程中进行检查。

偶然联合学习对海马损伤的敏感性[12]使研究涉及海马的发育性神经行为障碍具有重要价值[27,28]. 例如，发育期接触酒精会在大脑的不同区域产生致畸效应，如小脑和海马体[29,30]并损害神经行为功能，包括人类的空间记忆[31,32]. 在美国和国外，胎儿酒精谱系障碍（FASD）影响大约2/100的幼儿[33]. 在FASD大鼠模型中，酒精暴露限制在PD4-9（相当于人类妊娠晚期的PD4-9），神经解剖学和行为学证据表明海马CA1[34–36]和CA3锥体细胞丢失[34]. 限制PD7-9的乙醇摄入也会损害海马依赖性迷宫和恐惧调节任务的表现[37–39]可能通过抑制长时程增强（LTP）的诱导和传递以及海马NMDAr的减少[40–42].

本报告扩展了我们实验室之前的工作，研究了发育过程中的空间学习和NMDAr功能以及新生儿酒精暴露对该功能的影响[27,28,43–45]. OR和OL任务在这里被开发为一个探针，用附带学习范式检查这些问题。以往关于各种物体识别范式的发展涌现的研究结果喜忧参半[2,三]NMDAr在非空间OR和空间OL任务中的发展作用尚未得到研究。我们实验室的最新研究表明，服用PD7-9乙醇会损害涉及偶然学习的情境恐惧条件反射任务的表现[27]. 因此，OR和/或OL任务可能会为偶然的学习障碍提供聚合证据，作为发育性酒精暴露的函数。

总之，本研究的目的是检验年龄、NMDAr拮抗剂和新生儿酒精对幼年大鼠OR和OL的影响。实验1评估了正常发育的断奶大鼠和幼年大鼠执行这两项任务的能力。为了确定空间环境的暴露程度对任务性能来说是最佳的，我们对空房间的习惯化程度进行了控制。实验2确定NMDAr的对抗是否会损害这些任务中的一项或两项的性能。基于先前在空间学习任务中对MK-801进行系统给药的研究，我们预测在获得前给药会损害OL，但不会损害OR任务。最后，实验3检查了新生儿酒精暴露的影响，发现剂量和给药窗口可以有效地干扰海马依赖性学习形式。

1.实验1A：发育对象和空间位置记忆的行为决定因素

先前关于OR和OL对象识别范式在开发过程中的变化的研究产生了喜忧参半的结果[2,三,46–48]强调需要采用更系统的方法来检查这些任务。因此，实验1A试图通过使用出生后发育后期的年龄来比较OR和OL任务作为空腔习惯化和性别的函数，而这些任务的表现是预期的。

2.1材料和方法

2.1.1受试者

受试者是特拉华大学实验动物医学办公室（OLAM）饲养的Long Evans大鼠。定时怀孕的女性被安置在透明聚丙烯笼子（45×24×21cm）中，带有标准床上用品和即兴演奏获得食物和水。通过检查光周期（12:12）期间的出生情况来确定子代的出生日期，如果发现新生幼崽，则将这一天指定为PD0。在PD2，将幼崽从繁殖设施运输到实验室的当地动物饲养室。在PD3中，将幼崽剔除为8只幼崽（通常为4只雄性和4只雌性），并通过皮下注射无毒黑色墨水对其进行爪标记。PD21时，幼崽断奶并与同性窝友一起饲养在45×24×17cm的笼子中（除非另有说明）。在PD28（习惯化前2天），大鼠被单独安置在较小的白色聚丙烯笼子（24×18×13cm）中即兴演奏研究剩余时间的食物和水供应。大鼠被随机分配到OR或OL任务。如果相同性别的同窝幼崽被分配到相同的任务中，则将其分为不同的习惯化组（第1组vs.第3组；习惯化组），以便同一窝中的同一性别幼崽不超过一只被分配到任何给定的实验条件中（任务x习惯组）。当不可避免地将同性室友分配给实验组时，将数据平均化，并作为单个观察值计算。

2.1.2仪器

所有行为程序均在两个圆形竞技场中的一个竞技场进行，竞技场直径78.7厘米，围墙48.9厘米，离地面26.7厘米。竞技场是用木材建造的，地板和墙壁由白色聚酯树脂板构成。竞技场位于一个光线充足的房间里，让老鼠可以看到远处的视觉线索。在竞技场的墙顶内还放置了两个近端球杆；一个黑色的“X”由电工胶带制成（10.5×9英寸；北部位置），一个圆形的交叉阴影图案由对比鲜明的彩纸条制成（直径8.5英寸；西部位置）。这些线索离老鼠足够远，以防止身体接触。将两块可重复使用的尼龙搭扣（挂钩组件）固定在竞技场的地板上（Velcro USA Inc.，Manchester，NH），以将物体固定到竞技场地板上并防止老鼠移动它们。物体的相对尺寸和位置如图所示图1.

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图1

相对尺寸。2种可能的物体放置组合的开阔场地的相对尺寸。对于对象识别（OR）任务，在采样和测试阶段都将对象定位在标准位置（S）。对于对象定位（OL）任务，在采样阶段将对象定位在S中。在测试期间，一个物体被移动到一个新的位置（n）。象限标记为1、2、3、4。配置1（左）；配置2（右侧）。

用于勘探的物体是从各种来源获得的，然而，所有物体都必须易于清洁，并由无孔材料制成(图2). 物体的表面纹理、颜色和尺寸不同，但仍保持相对大小。每个物体的平底都用可重复使用的尼龙搭扣（环组件）完全覆盖。在实验1中，发现对象C的平均空间偏好最高，因此在随后的实验中，该对象仅用于OL任务。

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图2

刺激对象。OR和OL任务中使用的对象（A、B和C）的照片。

2.1.3习惯

在对PD31进行行为测试之前，动物习惯于在竞技场进行1或3次训练。在每一次习惯化训练开始时，在动物饲养室中处理动物3分钟，称重，并将其推送到家中笼子中的行为测试室。每一次习惯化训练都包括在空的竞技场内放置10分钟。对于所有的习惯化训练（和行为测试），大鼠都被放置在竞技场的中心，面向北方。在每次放置之前，动物们在走廊里等待，同时用70%的乙醇清洁场地。可能的习惯化训练发生在PD30的上午和下午（分别为第1和第2课时）以及PD31-32的上午（第3课时）。动物接受1（第1组）或3（第3组）习惯化训练。第1组的动物作为第3组的动物进行称重，但没有在P30上将其推送到行为测试室（第3组动物在进行前两次习惯化训练时）。

2.1.4新型对象识别（OR）

在PD 31（第4课时）下午，对大鼠进行标准新物体识别（OR）任务或新物体位置识别任务（OL，参见图3). 在手术室的任务中，每只老鼠都被称重，并被送往动物试验室。清洁后，将大鼠放置在竞技场中5分钟，在那里它们遇到两个相同的样本对象（样本阶段）。在样品阶段结束时，将大鼠放回其家庭笼子中，延迟5分钟（±15秒）。在测试阶段，动物被放回竞技场3分钟，其中一个熟悉的物体被替换为一个新物体(图3). 在取样和测试阶段，探索被定义为一种活动事件，即大鼠在1厘米以下的距离内用鼻子对着物体抓、嗅或拂。坐在物体上或旁边不被视为主动探索。除了竞技场外，所有物体在每次训练之间都用70%的乙醇清洗。测试完成后，动物被送回动物饲养室。对象身份、竞技场配置和竞技场数量与每个性别和习惯分组变量相平衡。

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图3

一般程序。标准新对象识别（OR）和新对象位置识别（OL）任务中使用的一般过程。（A） OR任务示意图，其中在样本阶段（5分钟）展示了两个相同的对象。在延迟5分钟后，一个熟悉的物体在测试时被一个新物体取代（5分钟）。（B） OL任务示意图，其中在样本阶段（5分钟）展示了两个相同的对象。经过5分钟的延迟，一个熟悉的物体在测试时被移到了一个新的位置（5分钟）。

2.1.5新型位置识别（OL）

对于OL任务，所有程序都与OR任务相同，只是在测试阶段，大鼠遇到了两个熟悉的物体，而不是一个新物体，其中一个物体位于竞技场中的不同位置(图3).

2.1.6数据收集与分析

使用视频摄像机（北美松下公司）记录习惯化和测试过程中的活动和探索。随后，一名对实验条件视而不见的观察者离线对会话的视频记录进行评分。这是通过运行计时程序（阿伦·阿索克，特拉华大学）手动执行的，手动按下光标将激活对应于每个对象（左右）的计时器。以这种方式对测试过程中连续三个1分钟区块以及总3分钟期间的数据进行分析。数据子集由第二个实验性盲观测器进行分析，以确定观测器之间的可靠性。相关分析表明观测者具有较高的可靠性(对=.75–1.0，全部第页s<.01），以及t吨-测试表明，任何评分员（全部第页s>.33）。

将每个对象的原始勘探时间转换为勘探比率。这是3分钟测试阶段每分钟探索新物体或新地方所花费的时间除以探索这两个物体所花费的总时间的比例[t_小说/（吨_小说+t吨_样品)[1]]. 所有统计分析均使用STATISTICA 12软件进行。采用混合因子方差分析（ANOVA）对受试因素之间的习惯（第1组vs.第3组）、任务（OR vs.OL）和性别进行分析。探索比率（总体和单分钟）用作因变量。适当时进行事后（纽曼-凯尔斯）分析。此外，一个样本t吨-测试用于比较各组的勘探比率与表示无偏好的比率（0.5）[1]. 此外，还对样本阶段收集的数据进行了分析，以检查各组之间的探索时间。

2.2结果

2.2.1受试者

受试者是来自17窝的103只Long-Evans大鼠。将同一组同性室友平均起来，观察次数从103次减少到78次。分析中排除了另外9只动物的数据。其中两项因技术故障而被排除在外（空间任务，第1组，F，n=1；空间任务，组3，M，n=1），2项被删除，因为测试阶段的总目标探索时间小于1秒；五只动物的数据被排除在符合统计异常值标准的分析之外（对象任务，第1组，F，n=1；空间任务，第2组，M，n=1:空间任务，第一组，F。异常值由单独会话测试数据定义，总探索率超过组平均值的±1.96标准偏差。对剩下的69名受试者进行了分析（对象任务，第1组，n=16；对象任务，第一组，n=28；空间任务，第一组，n:15；空间任务（第三组，n:20）。

2.2.2样品阶段(图4)

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图4

实验1A的5分钟样品阶段的平均（+/−SE）对象探索时间。OR（左面板）和OL任务（右面板）。第1组=1次到空旷场地的习惯化训练；第3组=3次习惯化训练。OR，组1 n=16；第3组n=15；OL，第1组n=18；第3组n=20。

为了确定是否可以通过样本阶段基线探索水平的变化来解释新颖性探索的差异，使用混合因子方差分析法分析了任务、习惯和性别样本阶段的探索总量。方差分析显示组的主要影响[F类(1,61)=8.06,第页<0.007]，与1次习惯化训练相比，给予3次训练的受试者的样本时间探索增加。

2.2.3测试阶段(图5)

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图5

实验1A 3分钟测试阶段的平均勘探率（+/-SE）。OR（左面板）和OL任务（右面板）。从左到右，Epoch包括总测试时间，第1分钟、第2分钟和第3分钟。第1组=1次到空竞技场的习惯训练；第3组=3次习惯化训练。这两组人都对新颖的物体和新颖的位置表现出明显的偏好。第n组的总时间、第1分钟、第2分钟和第3分钟的OR测试：第1组n=16、16、13、12；第3组n=18,18,17,15；OL:1组n=15，15，15，14；第3组n=20，20，20，17。虚线表示机会表现。每个小组的机会表现都有显著差异(*第页< .01; #第页< .05).

以性别、习惯和任务为因素对总探索时间比率进行因子方差分析，揭示了任务的主要影响[F类(1,61)=46.69,第页<0.001]，与空间任务相比，对象的探索时间比率明显更高。在测试的几分钟内，探索比率（以及表现出探索的老鼠数量）有所下降。

一个样本t吨-对探索比率和偶然表现进行的测试显示，无论习惯化组如何，都有较高的新物体偏好。对于第1组和第3组，在整个测试过程中，对象新颖性偏好都有所下降，这表明1^标准最小探索分数可以更好地预测新颖性偏好[第1组总时间：t吨(15)=10.13,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(15)=4.8,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(12)=2.74,第页<.018; 三^第个最小值：t吨(10)=1.05,第页>.318; 第3组总时间：t吨(17)=18.48,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(17)=10.53,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(16)=3.54,第页<.003; 三^第个最小值：t吨(14)=2.73,第页<.017]. 第1组和第3组表现出显著的空间新颖偏好[第1组总时间：t吨(14)=2.17,第页<.048; 1^标准最小值：t吨(14)=2.82,第页<.014; 2^第二次最小值：t吨(14)=0.74,第页>.471; 三^第个最小值：t吨(13)=−.039,第页>.704; 第3组总时间：t吨(19)=5.51,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(19)=2.69,第页<.015; 2^第二次最小值：t吨(19)=3.46,第页<.003; 三^第个最小值：t吨(16)=0.14,第页>.887]. 然而，与物体新颖性相比，空间新颖性学习和表现有所下降，这表明此处评估的空间新颖性可能是一种较弱的学习形式。

3.实验1B：物体本体与空间位置记忆

动物表达空间任务学习的能力在大鼠PD21左右发展，而非空间控制任务的表现发展较早（例如[4–6,49]. 实验1B通过检查PD21和26只大鼠的物体与空间新奇性，扩展了实验1A的发现。这项实验寻求了以往空间学习发展研究的一致证据，这些研究考察了“偶然”而非“强化驱动”的空间学习[11,45,49].

3.2结果

3.2.1受试者

受试者为来自14胎的78只（37只M；41只F）Long-Evans大鼠。如前所述，用相同分组变量（任务、年龄、性别）表示同一窝中的大鼠的实例是平均值。这使得观测次数减少到65次。在考虑了相同的取样后，四只动物的数据符合统计异常值标准（如前所述），并被排除在分析之外（目标任务，PD 21，F，n=1；空间任务，PD 22，F，n=1；目标任务，PD26，F，n=1；空间任务，PD 26，M，n=1.）。其余61名受试者的数据用于分析（对象任务，PD21，n=14；对象任务，PD 26，n=17；空间任务，PD 21，n=13；空间任务（PD26，n=17）。

3.2.2样品阶段(图6)

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图6

实验1B 5分钟样品阶段的平均（+/−SE）对象探索时间。OR（左面板）和OL任务（右面板）。两项任务在年龄组之间均未发现显著差异。OR，PD21 n=14；PD26 n=17；OL，PD21 n=13；PD26 n=17。

使用混合析因方差分析比较任务、年龄和性别之间样本阶段的基线探索水平。方差分析显示没有显著的主要影响或交互作用（所有秒>0.13），表明在PD21（44.63±2.99秒）或PD26（51.9±3.5秒）测试的大鼠之间的探索时间没有统计差异，这可能是测试时新颖偏好差异的原因。

3.2.3测试阶段(图7)

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图7

实验1B 3分钟测试阶段的平均勘探率（+/-SE）。OR（左侧面板）和OL任务（右侧面板）。从左到右，纪元包括总测试时间，第一分钟，第二分钟和第三分钟。两个年龄组都对新物体和新位置表现出明显的偏好。第n组的总时间、第1分钟、第2分钟和第3分钟的OR测试：PD21 n=14、14、14、13；PD26 n=17、17、17和17；OL:PD21 n=13、13、13、11；PD26 n=17、17、16、15。虚线表示偶然的表现。每组的机会表现存在显著差异(*第页< .01; #第页< .05).

以性别、年龄和任务为因素，对总探索时间比率进行因子方差分析，揭示了任务的主要影响[F类(1, 53)=8.46,第页<0.006]，与OL任务相比，OR任务的探索时间比率要大得多。其他主要影响或交互作用均不显著(第页s>0,48）。

一个样本t吨-与偶然表现（0.5）相比，对探索比率的测试表明，无论年龄大小，都有较高的新奇物体偏好【PD21总时间：t吨(13)=5.96,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(13)=6.63,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(12)=3.07,第页<0.10; 三^第个最小值：t吨(13)=1.16,第页>0.26; PD26总时间：t吨(16)=6.31,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(16)=6.32,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(16)=3.42,第页<.004; 三^第个最小值：t吨(16)=1.13,第页>.274]. PD21和PD26这两个年龄段也表现出显著的空间新奇偏好。然而，空间新奇性学习和表现不如物体新奇性高[PD21总时间：t吨(12)=3.16,第页<.009; 1^标准最小值：t吨(12)=3.3,第页<.007; 2^第二次最小值：t吨(12)=1.91,第页>.08; 三^第个最小值：t吨(10)=0.66,第页>.523; PD26总时间：t吨(16)=2.13,第页<.049; 1^标准最小值：t吨(16)=0.47,第页>.64; 2^第二次最小值：t吨(15)=1.14,第页>.271; 三^第个最小值：t吨(14)=1.32,第页>.206].

综上所述，实验1A和1B表明，附带物体和空间学习早在PD21就存在了。在所有年龄段，OR的表现都高于OL，但在断奶/幼年期，两项任务的表现都没有显著变化。我们将在下文中讨论这一发现与其他附带学习的发展研究(讨论).

4.实验2：NMDA受体拮抗对物体与空间新颖性的影响

海马体和前额叶皮层等区域的NMDA受体功能与各种形式的上下文和空间记忆的出生后发展有关（例如[45,51]. 在实验2中，PD31大鼠在获得新的物体和空间识别任务之前，接受了NMDA受体拮抗剂或载体的系统性给药，以确定这些任务（尤其是空间新颖性）的学习和表现是否与成年大鼠的NMDA依赖[25,26].

4.2结果

4.2.1受试者

受试者为来自9胎的58只（30M；28F）Long-Evans大鼠。共有3只动物的数据被排除在分析之外。由于样本对象探索（空间任务、SAL、F）总共不到1秒，因此删除了1只动物的数据。2只动物的数据被排除在分析之外，以满足先前定义的统计异常值标准（空间任务，SAL，F，n=1；对象任务，MK，M，n=1）。对其余55名受试者进行了分析（对象任务，MK，n=13；对象任务，SAL，n=15；空间任务，MK，n=12）。

4.2.2样品阶段(图8)

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图8

实验2 5分钟样品阶段的平均勘探时间（+/−SE）。OR（左面板）和OL任务（右面板）。两个治疗组在这两项任务中均未发现显著差异。OR，SAL n=15；MK n=13；OL，SAL n=12；MK n=15。

为了确定是否可以通过药物组之间基线探索水平的变化来解释新颖性探索的差异，使用混合因子方差分析法分析了任务、治疗和性别样本阶段的探索总量。方差分析显示，没有任何分组因素的主要影响或交互作用（全部秒> .10)

4.2.3测试阶段(图9)

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图9

实验2 3分钟测试阶段的平均勘探率（+/-SE）。OR（左面板）和OL任务（右面板）。从左到右，Epoch包括总测试时间，第一分钟、第二分钟和第三分钟。MK-801影响OL任务的性能，但不影响OR任务的性能。第n组总时间、第1分钟、第2分钟和第3分钟的OR测试：SAL n=15，15，15；MK n=13、13、13和OL:SAL n=15、15、15和15；MK n=12、12、12和10。虚线表示偶然的表现。每个小组的机会表现都有显著差异(*第页< .01; #第页< .05).

以性别、治疗和任务为因素对总探索时间比率进行因子方差分析，揭示了任务的主要影响[F类(1,47)=7.11,第页<0.02]，与空间任务相比，对象的探索时间比率明显更高，并且治疗的主要效果[F类(1,47)=7.02,第页<0.011]与MK组相比，SAL组的探索时间更长。还发现了任务X治疗的显著相互作用[F类(1,47)=5.55,第页<0.023]. 纽曼-凯尔斯测试表明，与MK组相比，SAL组的空间新颖性总得分显著更高(第页<.002），与MK组的空间任务相比，该对象的得分明显更高(第页<.003). 没有其他主要或交互作用显著（所有第页s> 0.21）。

一个样本t吨-与偶然表现相比，对探索比率的测试表明，无论是治疗组还是对照组，对新事物的偏好都很高。与实验1A一样，在整个测试过程中，对象新颖性偏好都有所下降，这表明1^标准min探索得分可能是新颖性偏好的较好预测因子；这在MK和SAL组都很明显。[组SAL总时间：t吨(14)=6.77,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(14)=12.33,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(14)=1.61,第页>.0.13; 三^第个最小值：t吨(14)=3.07,第页<.009; MK组总时间：t吨(12)=20.86,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(12)=18.72,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(12)=12.26,第页<.001; 三^第个最小值：t吨(12)=9.39,第页<.001]. 与手术室任务相比，药物治疗显著降低了OL任务的表现。SAL组表现出显著的空间新颖偏好；然而，MK组的空间偏好得分与机会绩效相比没有差异【SAL组总时间：t吨(11)=3.93,第页<.003; 1^标准最小值：t吨(11)=3.23,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(11)=2.45,第页<.033; 三^第个最小值：t吨(9)=3.41,第页<.008; MK组总时间：t吨(14)=0.41,第页>.687; 1^标准最小值：t吨(14)=1.7,第页>.111; 2^第二次最小值：t吨(14)=0.04,第页>.97; 三^第个最小值：t吨(14)=0.07,第页>.946]. MK组而非SAL组缺乏新的空间识别，这突出了NMDAr功能在该空间任务变量中的影响。在目标任务中，这种效果并不明显，这表明药物不会通过干扰OR和OL任务中常见的感觉、运动和动机过程而影响OL的表现。

5.实验3：新生儿酒精暴露对物体和空间位置记忆的影响

研究发现，新生儿酒精暴露会干扰多种空间学习任务，包括在环境预暴露促进效应（CPFE）期间偶然获得的环境表征[27,28]. 实验3使用相同的酒精剂量和暴露窗口（PD7-9），询问这些发现是否会扩展到另一种偶然形式的空间学习，即新的位置识别。

5.2结果

5.2.1受试者

受试者为来自14胎的96只（47M，49F）Long-Evans大鼠。同一窝过抽样的任务、治疗、性别的平均数据发生在2个实例上（空间任务、SI、F，n=2）。由于实验者错误，排除了1只动物的数据（Object Task，SI，M，n=1）。共有6只动物的数据被排除在分析之外。由于总共不到1秒的测试对象探索时间，因此删除了2只动物的数据（对象任务，5.25g，M，n=1）。来自5只动物的数据被排除在符合标准的分析之外，作为统计异常值（对象任务，5.25g，M，n=1；对象任务，SI，M，n=1；空间任务，5.25 g，F，n=1；空间任务（5.25g、M，n=2）。对其余86名受试者进行了分析（目标任务，5.25g，n=19；目标任务，SI，n=23；空间任务，5.25 g，n/19；空间任务（SI，n/25）。

5.2.2血液酒精浓度分析和体重

A 2（治疗组）X 2（性别）X 2天重复测量方差分析显示性别的主要影响显著[F类(1, 80)=4.01,第页<0.05]，治疗组[F类(1, 80)=22.17,第页<0.01]，和天[F类(1, 80)=525.3,第页<0.01]，除了显著的第X天给药条件交互作用[F类(1, 80)=510.1,第页<0.01]. 性别的主要影响表明，与男性相比，女性的体重减轻了（分别为15.7克±0.31和16.5克±0.32）。纽曼-凯尔斯X天给药条件相互作用的事后测试表明，各组之间的体重没有差异(第页>0.36）（SI组，14.7g±0.24；5.25g和15.1±0.28）。PD9时，5.25g组（14.7g±.29）的体重明显低于SI组（18.9g±.34）；第页<0.01).

对PD31–32体重进行的A 2（治疗组）X 2（性别）因子方差分析显示治疗组的主要影响显著[F类(1, 79) = 10.03,第页<0.01]和性别[F类(1, 79) = 16.04,第页< 0.01]. 5.25g组的体重低于SI组（分别为89.6±2.1g vs.96±1.6g），女性的体重与男性相比有所减轻（分别为89±1.6 vs.98g±2.0g）。

PD7时从5.25g组血样中提取的BAC不受性别影响(第页> 0.69). 从5.25g组（38例中有37例）采集的样本显示平均BAC为412.0±7.56 mg/dl。

5.2.3样品阶段(图10)

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图10

实验3 5分钟样品阶段的平均勘探时间（+/−SE）。OR（左面板）和OL任务（右面板）。在这两项任务中，治疗组之间均未发现显著差异。OR，SI n=23；5.25克n=19；OL，国际单位制n=25；5.25克n=19。

为了确保发育期酒精暴露不会影响基线探索水平，使用混合因子方差分析法分析任务、治疗和性别样本阶段的探索总量。方差分析仅揭示了任务的主要影响[F类(1,78)=8.0,第页<0.006]并且没有涉及任何其他分组变量的交互作用(Fs公司<0.77).

5.2.4测试阶段(图11)

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图11

实验2 3分钟测试阶段的平均勘探率（+/-SE）。OR（左面板）和OL任务（右面板）。从左到右，Epoch包括总测试时间，第一分钟，第二分钟和第三分钟。两个治疗组都对新物体和新位置表现出明显的偏好。第n组：总时间、第1分钟、第2分钟和第3分钟的OR测试：SI n=23、23、20、21；5.25g n=19、19、18、17和OL:SI n=25、23、23、23；5.25克n=19、19、18、19。虚线表示偶然的表现。每个小组的机会表现都有显著差异(*第页< .01; #第页< .05).

以性别、治疗和任务为因素对总探索时间比率进行因子方差分析，揭示了任务的主要影响[F类(1,78)=17.49,第页<0.001]，与空间任务相比，对象的探索时间比率明显更高。没有涉及任何分组变量的其他主要或交互影响(Fs公司<0.83).

一个样本t吨-与机会表现相比，对探索比率的测试表明，无论采用何种治疗方法，都有较高的新物体偏好【SI组总时间：t吨(22)=8.16,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(22)=8.56,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(19)=3.19,第页<.005; 三^第个最小值：t吨(20)=2.81,第页<.02; 组5.25g总时间：t吨(18)=6.2,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(18)=10.82,第页<.001; 2^第二次最小值：t吨(17)=1.09,第页>.292; 三^第个最小值：t吨(16)=1.98,第页>.066]. SI组和5.25g组均表现出显著的空间新颖偏好[SI组总时间：t吨(24)=1.20,第页>.241; 1^标准最小值：t吨(22)=2.54,第页<.019; 2^第二次最小值：t吨(22)=−0.09,第页>.929; 三^第个最小值：t吨(22)=−.138,第页>.891; 组5.25g总时间：t吨(18)=4.11,第页<.001; 1^标准最小值：t吨(18)=3.37,第页<.004; 2^第二次最小值：t吨(18)=1.04,第页>.31; 三^第个最小值t吨(17)=2.23,第页<.04]. 5.25g组完整的新空间识别表明，在这个治疗窗口期（PD7-9）和我们当前的空间任务参数下，这项任务对新生儿酒精不敏感。

6.一般性讨论

四个实验描述了大鼠在发育过程中非空间OR（新物体识别）任务和空间OL（物体位置）任务的行为特征。实验1A证明了正常发育的幼年大鼠执行OR和OL任务的能力。实验1B将这些发现扩展到PD21的幼崽。实验2确定OL而不是OR任务的执行需要NMDA受体功能。最后，实验3发现新生儿饮酒不会影响两项任务的表现。

实验1表明，大鼠在PD31时执行OR和OL任务的能力是明显的。之前的报告已经证明，在PD18-24之前，手术室任务的执行情况，样本和测试阶段之间的延迟时间为1分钟到1小时[2,三,47,48,55,56]. 然而，关于何时出现空间物体识别的数据是相互矛盾的[2,三,48]. 基于这些报告，实验1测试了一个少年（PD31），该少年有望在OL任务中显示出新奇探索的证据，以确定我们实验室的测试参数用于检查这些任务的个体发育（实验1B）。

本报告显示，OL任务可以在PD21幼龄的幼崽身上进行测试。最近，Ainge&Langston报道了一种物体植入（OiP[16])PD30完成任务；然而，在PD24时，幼犬没有这种能力[2]. 相比之下，Kruger等人在第15-17周的研究中证明了OL任务的表现[三]. 这种差异可能是由于任务需求的变化造成的。Kruger等人纳入了一项与当前报告中使用的任务类似的OL任务，其中将一个熟悉的对象移动到另一个空间位置，这在样本阶段从未经历过。然而，安吉和兰斯顿在样品阶段展示了两个不同的物体，在测试阶段展示了两只相同的物体。以这种方式，其中一个测试对象与样品阶段的位置相同，但另一个对象位于之前被不同对象占用的位置。本报告中使用的OL任务与Ainge和Langston使用的OiP任务在两个方面有所不同。首先，在后一个任务中，处理对象标识和对象位置信息是必要的，而OL任务中不需要处理对象标识信息。其次，为了使他们的任务依赖于海马，Ainge和Langston在不同的试验中或在试验的样本和试验阶段之间使用了不同的开始位置。这被认为促进了异中心空间框架中对象及其位置之间的关联[57]. 为了支持Kruger等人的观点，目前的研究结果通过证明在PD21、26和31上测试的发育中的大鼠能够区分已经改变空间位置的熟悉物体，从而扩展了之前的发育工作。需要进一步研究，以确定Ainge&Langston与Kruger等人使用的范式之间的差异，本研究可能解释了物体空间处理发展起点的差异。

PD21大鼠识别新位置出现的熟悉物体的能力表明，在发育的断奶期出现了偶然的空间学习。另一种形式的附带学习，即情境暴露前促进效应（CPFE）是情境恐惧条件作用的一种变体，在这种条件作用下，情境表征的获得、表征与休克的关联以及关联的恢复发生在不同的日子[58]. 通常，在第一天暴露于电击环境中的大鼠在最后一天的测试中表现出相同的冻结水平。由于缺乏强化，第一天获得的上下文记忆是偶然的。CPFE围绕PD21发展[7,49]在获取PD24上下文时需要HPC功能[45]. 在PD15-17之前，新生儿海马损伤破坏OL表现的发现[三]与这个年龄段没有CPFE形成对比。与OL任务相比，这两种附带学习范式的一个区别是CPFE中增加了长期巩固成分。如果在样品和测试阶段之间施加更长的延迟（例如24小时），那么PD15–17岁的幼犬可能无法执行OL任务。然而，总的来说，这里介绍的偶发学习OL任务的个体遗传学特征与其他强化驱动和偶发海马依赖任务一致[5,59–62]

NMDA谷氨酸受体亚型广泛参与突触可塑性和各种形式的行为学习记忆[63,64]. 因为OR和OL任务会招募包含高密度NMDAr的大脑区域[65]，实验2试图确定这些受体在这两项任务中的作用。实验2表明，NMDAr功能对OL任务的执行是必要的，而不是OR任务。然而，其他研究报告，NMDAr拮抗剂给药后OR受损取决于保留时间。与这里使用的5分钟延迟相反，在OR任务中采集前给予的全身和海马内NMDA拮抗剂会以1至24小时的延迟破坏性能[20–23,25,66]. 这可能是因为随着延迟的增加，手术室任务变得越来越困难，可能需要更多的NMDAr参与和/或额外的大脑结构（例如HPC和/或PFC；但请参见[67]).

在成年动物中，NMDAr拮抗剂在全身给药时会干扰OL任务变体的表现[25]或通过局部AP5注入齿状回、CA3和CA1[26]. 相反，Ozawana等人报告称，在编码之前或之后或测试之前系统性服用D-环丝氨酸（DCS；NMDAR激动剂）后，表现增强[68]. NMDArs的作用也与成年期其他海马依赖性附带学习任务有关，包括自发交替和CPFE[69,70]. 然而，目前的报告是首次在幼年大鼠执行OR和OL任务时使用NMDAr拮抗剂。在这个年龄段，OL任务对NMDA破坏的敏感性证实了我们实验室先前的研究，这些研究涉及各种强化驱动的空间任务，这些任务涉及大脑的各个区域[43,51,71]. 本研究结果通过强调NMDAr在OL与OR任务中的作用，扩展了我们实验室的这项发展工作。

据我们所知，本报告是第一份研究幼年大鼠在OR或OL任务中新生儿乙醇暴露对发育的影响的报告。当检测发生在成年期时，产前酒精暴露对强化的延迟不匹配样本（DNMS）对象识别任务没有影响，样本和检测阶段之间的延迟最长为5分钟[72]. 在PD7上注射乙醇后，成年期的OR表现也很好，延迟30分钟[73]. 另一方面，一项使用小鼠的研究报告称，成年期在OL任务中注射PD7乙醇后，以24小时的保持时间间隔表现受损[74]. CPFE中明显存在类似的酒精诱导缺陷，这需要在24小时的保持期后恢复偶然的空间学习[27,28]，参见上文。根据目前的研究结果，如果在采样和测试阶段之间施加更长的延迟，新生儿酒精暴露可能会损害OL任务。

当前的一组实验揭示了在开发过程中涉及对象身份和对象位置记忆的各种机制。研究发现，OL任务的表现出现在PD21之前，以及我们之前的报告显示了相同年龄的CPFE，为断奶前后偶然空间学习的发展提供了一致的证据。实验2通过证明NMDArs在幼年发育期的OL任务中的作用而不是OR任务，扩展了先前对成年大鼠的研究。最后，本报告首次研究了新生儿酒精暴露对幼年大鼠在这些任务中表现的影响。虽然实验3的结果表明在较短的保留时间内没有酒精影响，但如果在样品和测试阶段之间施加较长的延迟（例如24小时），酒精可能会破坏性能[74]). 本文报告的结果为进一步的实证研究奠定了基础，这些研究描述了个体发生、NMDAR和新生儿乙醇暴露在记忆中对物体识别及其空间位置的作用。

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