对照组与糖尿病组大鼠缺血性卒中后的血管形成模式不同：与卒中恢复的相关性

摘要

简介

中风或脑梗死影响全球1500万人，三分之一的受影响人口患有永久性残疾，影响生活质量^1,2糖尿病、高血压、高胆固醇血症和/或老龄化增加了中风结果的复杂性。据估计，超过30%的中风患者患有糖尿病，这些患者发生出血性转化的风险更大，死亡率增加，恢复较慢^三–6最近的临床研究表明，糖尿病也会导致认知能力下降和痴呆，这些都可能在中风后发生，从而进一步损害功能结果^7–11非常需要更好地了解糖尿病患者的中风恢复。

血管生成和神经发生的协调调节对于脑损伤后的脑修复和功能改善非常重要^12–14事实上，刺激血管生成被评估为中风的一种治疗方式^12,15我们已经证明，糖尿病会导致功能失调的脑新生血管形成，其特征是未成熟微血管增多，重塑和通透性增强。这些血管周细胞覆盖不足，更容易受到再灌注损伤^16–19然而，缺血/再灌注（I/R）对糖尿病患者脑血管修复的影响尚不清楚。最近的一项研究报告称，1型糖尿病大鼠中风后的神经元可塑性和功能恢复减弱²⁰了解与血管系统相关的变化将有助于更好地了解修复性血管生成和神经发生的调节过程，并最终改善功能结果。在这些研究的基础上，目前的研究验证了以下假设：1）糖尿病患者卒中后血管修复受损，2）糖尿病卒中后运动和认知恢复迟缓，3）卒中后血糖控制改善脑血管生成，这与更好的功能结果相关。

方法

结果

缺血半球和对侧半球的血管化

如前所述，与对照组相比，糖尿病假动物的血管生成更大¹⁷卒中后14天，对照组大脑皮层和纹状体缺血半球的血管体积和表面积与相应的shams相比显著增加(图1). 表面积的增加表明，这种增加的很大一部分来自微血管的增强。另一方面，在糖尿病动物中，缺血皮层和纹状体的血管体积显著减少，表明疾病（糖尿病）和干预（中风）相互作用强烈。只有缺血皮层的表面积有所减少。对缺血半球和对侧半球进行的比较表明，远端部位显示出与缺血半球相似的反应，但程度较小。例如，对照组对侧区域的血管生成量大于假动物，而糖尿病动物的对侧区域血管生成量减少。卒中后开始二甲双胍干预以达到正常血糖，纠正了血管体积和表面积的减少，使其恢复到控制水平。当在梗死区边界直接评估血管形成时(图2C)，FITC-灌注血管进入梗死区，而糖尿病大鼠显示血管密度降低。梗死区周围增强的GFAP染色显示有明显的星形胶质细胞活化。二甲双胍治疗改善糖尿病组的血管生成(图2B). 如白色箭头所示，与对照组相比，糖尿病不仅损害了灌注血管，也损害了非灌注血管(图3). 二甲双胍干预通过增加非灌注血管岛来改善血管水平。

在单独的窗口中打开

图1

糖尿病损害中风后同侧和对侧大脑半球的新生血管。（A） 用红色和黄色方框表示的同侧和对侧半球感兴趣区域的代表性脑切片。（B） 对比各组同侧和对侧区域的代表性图像。（C） 绘制各组和治疗臂的血管体积图^一与假对照组或同侧对照组和糖尿病组相比p<0.05，^b条与对照组或糖尿病+二甲双胍组相比p<0.05。（D） 描绘各组血管表面积的曲线图，^一与假对照组相比p<0.05，^b条与同侧糖尿病相比p<0.05，^c（c）与对照组或糖尿病+二甲双胍组相比p<0.05，以及^d日p=0.0018 vs假手术组。对同侧或对侧大脑半球的疾病（对照组vs糖尿病）和干预（假手术组vs卒中）采用2×2设计进行数据分析。糖尿病组在基线和卒中后的血管形成存在显著的相互作用，表明两者之间存在显著差异。为了确定血糖控制对中风后血管形成的影响，使用了单向方差分析（对照组、糖尿病和糖尿病+二甲双胍），图表上显示了p值，事后分析用字母标记。平均值±SEM，n=6–9。

在单独的窗口中打开

图2

糖尿病损害卒中后梗死边缘区的脑新生血管。（A） 描述梗死边缘区域定位的典型图像。（B） 在10倍物镜下拍摄的比较梗死边缘区血管密度的典型图像。（C） 所有组梗死区域周围血管密度百分比的图示。平均值±SEM，n=4-6。

在单独的窗口中打开

图3

糖尿病降低中风后的isolectin染色（红色，非FITC-灌注血管），表明新血管形成受损。（A） 使用63X物镜拍摄的具有代表性的图像，比较14天梗死边缘区的非灌注血管。白色箭头表示从灌注血管凸出的未灌注血管岛（B）所有组近梗死区未灌注血管百分比的图示。平均值±SEM，n=4-5。

糖尿病加重脑卒中后星形胶质细胞增生症

通过测量体细胞体积来评估星形细胞肿胀。糖尿病动物梗死区周围和对侧半球的星形细胞突起肿胀和数量增加。二甲双胍治疗阻止了梗死区域周围的这种反应(图4A-C).

在单独的窗口中打开

图4

糖尿病加重脑卒中后星形胶质细胞增生症。（A） 显示梗死边缘区和非病变半球以及假动物相应区域星形细胞形态的典型图像（B）与对照组相比，糖尿病性卒中显著增加星形细胞肿胀，二甲双胍治疗可减少肿胀。（C） 与对照组和血糖干预组保守的星形细胞过程相比，即使在糖尿病卒中14天后，星形细胞投射的数量也显著增加。蓝色-FITC灌注血管，绿色-胶质纤维酸性蛋白（GFAP），红色-神经。平均值±SEM，n=3–4。

卒中后血糖干预改善糖尿病患者的感觉运动功能

基线时，糖尿病大鼠的神经系统评分相似，但在卒中后24小时显著下降。对照组感觉运动功能逐渐改善。糖尿病组的恢复明显减弱(图5A). 二甲双胍治疗降低了糖尿病组第5天之后的感觉运动障碍，复合神经评分与对照组相似。曲线下面积（AUC，第1-14天）为112±31，67±14^一对照组、糖尿病组和糖尿病+二甲双胍组分别为108±21(^一p=0.012）。中风后前肢握力也得到了类似的结果(图5B). AUC（第0-14天）为11.4±1.6，8.2±0.3^一对照组、糖尿病组和糖尿病+二甲双胍组分别为10.6±0.3(^一p=0.0007）。

在单独的窗口中打开

图5

卒中后的血糖干预可改善糖尿病患者的感觉运动功能。（A，B）以复合神经评分表示的感觉运动功能的时间分布。糖尿病显著降低中风后的神经功能评分。与对照组相比，糖尿病卒中组的神经功能评分改善较慢。二甲双胍的血糖干预改善并恢复了与对照组相当的综合神经评分。（B） 前肢握力的时间剖面显示出类似的趋势。与对照组相比，糖尿病组在中风后14天前肢握力下降没有恢复。二甲双胍的血糖干预改善了前肢握力。^一与糖尿病相比p<0.05，^b条与糖尿病相比p<0.01，^{e（电子）}p<0.001与糖尿病，^c（c）AUC p=0.012 vs糖尿病，^d日AUC p=0.0007 vs糖尿病。平均值±SEM，n=6-8。

糖尿病会导致焦虑样行为和认知缺陷，中风后会进一步加剧

在基线检查时，糖尿病大鼠表现出焦虑样行为，因为它们在高架十字迷宫的封闭臂中停留的时间更长。中风后，两组表现出相似的模式(图6A). 在随后的几天里，对照组的反应有所改善，在第14天，对照组动物的时间明显少于糖尿病患者。糖尿病患者在张开手臂上花费的时间百分比和冷冻时间或在迷宫中心的时间更大(图6B和C).

在单独的窗口中打开

图6

糖尿病中风患者的焦虑症状加重。（A，B）高架加号迷宫开放臂和闭合臂所用时间百分比的时间变化图示。与对照组相比，糖尿病组倾向于在封闭的手臂上花费更多的时间，而缺血再灌注损伤加重了这一结果。（C） 糖尿病组中风后的冷冻时间显著增加，这表明中风前在迷宫中心的时间增加。^一p<0.001，^b条p<0.05，^c（c）与对照组相比，p<0.01，平均值±SEM，n=6-8。（D） 各组在基线检查时和中风后不同时间点的识别指数图显示，糖尿病降低了识别指数，而中风损伤进一步恶化了该指数。二甲双胍干预恢复了糖尿病卒中组的识别指数。^一p<0.001，^b条p<0.01，^c（c）AUC p<0.001与糖尿病。平均值±SEM，n=6-8。

自发T迷宫改变得分显示，两组在中风后48小时测试的改变得分均显著下降(补充数字). 基线时，糖尿病会导致新的物体识别指数降低，这表明即使是短期糖尿病也会对认知产生负面影响。所有组在中风后的头几天都出现了类似程度的缺陷，但大鼠从中风后出现的认知功能障碍中适度恢复。糖尿病卒中大鼠的恢复受损，二甲双胍部分恢复了认知功能(图6D).

讨论

糖尿病增加了中风的风险和严重程度，最终导致不良结果。临床证据表明，没有糖尿病病史是恢复的预测因素，这意味着糖尿病会阻碍中风后的恢复^7,21,22然而，关于糖尿病如何影响中风恢复的临床前证据很少。本研究解决了我们知识中的这一重要差距，并调查了糖尿病对脑血管重塑和血管形成模式的影响，以及中风后运动和认知恢复的影响。

对人类和动物模型的研究揭示了治疗性血管生成在中风后恢复中的关键地位^23,24在动物模型中，同侧缺血半球梗死边界周围的血管生成具有良好的特征^23,25在中风患者的梗死周围也观察到血管生成增加。发病率、存活率和神经恢复与血管生成程度、微血管密度和中风后血流恢复直接相关^26,27很少有研究评估糖尿病卒中患者的大脑修复，这些报告表明糖尿病卒中后血管修复受损^28,292型糖尿病小鼠缺血后缺血半球的微血管数量减少^28,29另一项对糖尿病GK大鼠进行的研究，与这些研究类似，也显示中风后7天血管生成率降低³⁰这些研究大多（如果不是全部）采用传统的二维策略来评估缺血半球的微血管密度，并将对侧半球作为对照组织。我们现在提供了一份全面的报告，与假手术动物相比，卒中后14天，梗死区的脑血管系统以及缺血半球和对侧半球的皮层周围和皮层下区域的三维变化。这种方法不仅使我们能够比较对照动物和糖尿病动物的血管形成，还可以评估中风对对对侧半球脑血管结构的影响。根据最近的审查^14,31大多数人认为血管生成只发生在同侧半球。关于大脑半球远端功能可塑性和长期血流动力学变化的报告证实了我们的发现^32,33我们的新发现表明，在对照动物中，同侧和对侧大脑半球的血管密度和重构都有所增加。另一方面，糖尿病大鼠在基线时血管生成增加，但功能失调，在中风后两半球的血管体积和表面积急剧减少。这些结果强烈表明，对侧半球也受到缺血性损伤的影响，并在正常情况下对损伤和修复作出反应，但糖尿病等混杂疾病的存在阻止了这种修复反应。

众所周知，血管生成在中风后一周达到高峰，随后修剪和成熟生长的血管^23,24与之前的研究类似，在当前的研究中，正常大鼠中诱导的中风刺激了血管生成反应。虽然我们没有直接研究血管生成标记物，但表面积的增加表明微血管增加。在给定体积的组织中，主要测量血管管腔空间的血管体积增加可能是由于血管重塑以获得更大的管腔和/或由于新血管形成。在后者中，表面积（血管壁所占面积的量度）的增加伴随着体积的增加。因此，当我们观察体积和表面积之间的关系时，线性关联表明这两个参数的增加以平行方式增加，并且有显著的新微血管形成。在这项研究中，我们检测到血管体积增加，甚至表面积增加更大。然而，卒中后14天，糖尿病GK大鼠梗死边缘周围的血管严重受损。对侧半球的血管减少。血管体积的进一步减少表明现有血管明显退化。这种反应的潜在机制值得进一步调查。

胶质细胞，尤其是星形胶质细胞，通过细胞肿胀和反应性增加对血管损伤作出反应。据报道，星形胶质细胞增生位于缺血核心周围，在靠近梗死边缘处逐渐增多，并伴有胶质瘢痕形成³⁴这项研究提供了证据表明，卒中与糖尿病相关，通过增加膀胱周围区星形胶质细胞突起密度的肿胀和数量，加重了星形胶质细胞增生症。大脑星形胶质细胞增生症的显著增加可能会改变神经血管耦合，以恢复受损区域的血流，引起炎症和营养反应^35,36.

临床和临床前研究报告了与代谢改变和缺血再灌注后相关的记忆和认知缺陷。中风后急性期，运动协调性减弱，可传播至四肢永久瘫痪。研究报告称，随着运动学习和活动的增加，突触可塑性和神经元重组增加³⁷中风后评估的动物行为也提供了突触可塑性和与学习相关的功能性行为逐渐改善的证据³⁸最近的一项研究表明，与非糖尿病动物的中风损伤相比，糖尿病中风的皮质可塑性受到挑战。糖尿病卒中后的长期功能恢复也受到影响²⁰目前的研究评估了伴有或不伴有糖尿病的中风后感觉运动功能、焦虑样症状、自发活动和认知功能的暂时变化。对照组大鼠因脑卒中10天后缺血再灌注损伤改善和饱和而出现感觉运动障碍。糖尿病大鼠的恢复程度降低。新的证据表明，1型和2型糖尿病患者的神经心理功能都较差，影响认知^9,11,39–41在我们目前的研究中，我们详细阐述了对照组和糖尿病大鼠中风后认知功能的时间分布。我们在T迷宫实验中对新物体识别和自发改变的研究结果表明，即使在基线时，糖尿病患者的记忆和认知相关任务也会受损。当中风叠加在这种病理上时，认知功能的恢复受到严重影响。

我们早些时候提供了证据表明，慢性血糖控制是一种有效的预防策略，可以保护血管，降低糖尿病缺血再灌注损伤后HT的风险⁴²虽然关注血糖控制对心血管结局影响的临床试验结果存在争议，但严格控制血糖是预防微血管并发症（如糖尿病肾病和视网膜病变）的有效治疗方法^43–49二甲双胍是治疗T2D患者常用的一线药物。二甲双胍通过减少肝脏糖异生和增加外周葡萄糖摄取、胰岛素敏感性和脂肪酸氧化来发挥其抗高血糖作用。二甲双胍也具有独立于其降血糖作用的保护作用。二甲双胍改善了血清白蛋白氧化和糖基化过度增加的T2D患者的抗氧化能力⁵⁰Rosen和Wiernsperger在GK大鼠中使用二甲双胍后，抗氧化防御能力得到改善⁵¹我们使用二甲双胍作为一种干预策略来靶向中风后糖尿病大鼠的高血糖状态。显然，我们的研究结果提供了令人信服的证据，证明在中风后未接受任何降糖治疗的大鼠中，二甲双胍对其血糖的控制可有效促进血管修复，改善中风后的感觉运动和认知功能。

总之，这些研究表明，即使在偏远地区，大脑也会通过增加血管生成来修复缺血性损伤，但在糖尿病患者中，这种反应会完全逆转，并且会出现血管退化。这些变化与中风后延迟的功能恢复有关。糖尿病损害血管修复的机制以及将血管退化与功能恢复不良联系起来的机制是我们正在进一步研究的方向。我们的研究结果为血糖控制作为预防和/或改善糖尿病脑血管并发症的有效策略提供了有力支持。

补充材料

致谢

脚注

工具书类