EGFR、VEGF和NOTCH1的表达表明HPV阳性和HPV阴性头颈部鳞状细胞癌肿瘤血管生成的差异

摘要

介绍

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见癌症，也是第八大癌症死亡原因[1]. 吸烟是HNSCC的主要原因，虽然发达国家的HNSCC发病率下降，同时吸烟人数下降，但同期出现了口咽癌的流行[2–5]. 现在人们普遍认为，这种流行病与性传播的人类乳头状瘤病毒（HPV）有关[6]. HPV阳性HNSCC提高了生存率[1,6]独特的分子特征，与HPV阴性HNSCC在形态学上不同[7]. 然而，有必要进一步研究HNSCC的病理异质性，以确定独特的治疗方法是否适用于HPV阳性的HNSCC[7].

HPV阳性和HPV阴性HNSCC异质性的一个很少探索的来源是血管生成，它具有临床干预的潜力：从现有的血管系统中形成新的肿瘤浸润血管，以响应肿瘤生长因子的释放[8,9]. 血管生成是肿瘤生长所必需的，为肿瘤转移提供了途径[8,9]. HPV阳性和HPV阴性HNSCC血管生成差异的最有力生物学证据来自对表皮生长因子受体（EGFR）的免疫组织化学（IHC）研究，与HPV阳性HNSCC相比，EGFR在HPV阴性的HNSCC中表达更高[10–13]. EGFR通过激活信号转导子和转录激活子3（STAT3）与HNSCC中的血管生成相关[14]. STAT3诱导血管内皮生长因子（VEGF）的转录[14]由肿瘤分泌[15]. VEGF通过与肿瘤附近内皮细胞上表达的受体结合来刺激血管生成[15]. IHC研究表明，VEGF在HNSCC中过度表达，并与较高的肿瘤分期、淋巴结转移和死亡风险增加有关[16]. 根据肿瘤HPV状态，只有两项研究报告了HNSCC中VEGF的表达，其中一项研究显示了相关性，而另一项则没有[10,17]. 很少有IHC研究检测了HNSCC中EGFR-VEGF的相关性，其中一项研究报告了异质性HNSCC病例系列中的阳性相关性[18]两项研究显示扁桃体无关联[10]和口腔癌[19]. 我们尚不清楚有任何研究通过HNSCC中的肿瘤HPV状态来检测EGFR-VEGF相关性。

最近的研究表明，控制细胞命运和分化的NOTCH途径可能与HNSCC血管生成有关[20,21]. 特别有趣的是NOTCH1，它是HNSCC中仅次于p53的第二个最常见的突变基因[22,23]. NOTCH1在HNSCC中相对于正常组织过度表达[21,24–27]. NOTCH1在血管生成中的作用的证据尚处于初步阶段，据我们所知，还没有研究对NOTCH2和VEGF或EGFR进行直接比较。然而，NOTCH1与口腔舌癌的微血管密度（MVD）相关，而在同一研究中，MVD与VEGF表达相关[21]. 在另一项研究中，NOTCH1表达与高分化口腔舌癌相关，而这些肿瘤与低EGFR表达相关[28]. 我们还没有任何研究通过肿瘤HPV状态比较NOTCH1在HNSCC中的表达。

为了探讨HPV阳性和HPV阴性HNSCC在血管生成方面的差异，我们对HNSCC病例系列中EGFR、VEGF和NOTCH1的表达进行了IHC研究，该病例系列来源于HNSCC病因的病例对照研究。基于上述现有文献，我们假设EGFR在HPV阳性肿瘤中的表达水平低于HPV阴性肿瘤；EGFR表达与VEGF表达呈正相关；与HPV阴性肿瘤相比，HPV阳性肿瘤中VEGF的表达较低。此外，我们还对NOTCH1表达与HPV阳性和HPV阴性HNSCC中EGFR和VEGF的关系进行了一项假设性研究。

方法

结果

在为其准备幻灯片的71例患者中，共有67例（94%）被纳入本研究。我们排除了四个病例，因为从病理档案中检索到的组织块上切下的幻灯片不包含任何肿瘤。每个标记的代表性强、弱染色，以及阳性对照，如图所示1a–i。如表所示2大多数病例年龄在50-69岁之间（64.2%），男性（74.6%），白人（94.0%）。半数以上的肿瘤为口咽部（58.2%），大多数为早期临床T期（59.7%为1/2期）和淋巴结阳性（73.1%）。只有一例有远处转移。大多数病例（74.6%）报告曾吸烟或饮酒（82.1%），32.8%在诊断前1年肥胖。共有27个肿瘤（40.3%）为HPV阳性（2个口腔，25个口咽部），40个肿瘤（59.7%）为HPV-阴性（26个口腔，14个口咽）。口咽部肿瘤中HPV阳性率为64.1%。

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图1

一EGFR低表达（×200）。bEGFR高表达（×200）。c（c）EGFR阳性对照（头颈癌）（×200）。d日VEGF低表达（×200）。e（电子）VEGF高表达（×200）。（f）VEGF阳性对照（正常肾脏）（×200）。克NOTCH1低表达（×200）。小时NOTCH1高表达（×200）。我NOTCH1阳性对照（肺癌）

正如预期的那样，肿瘤部位与HPV状态相关（表2)大多数HPV阳性肿瘤（92.6%）发生在口咽部，只有35.0%的HPV阴性肿瘤发生在口咽部(P（P） < 0.001). 尽管经常吸烟(P（P）=0.78）与HPV状态无显著相关性，与HPV阳性肿瘤吸烟者相比，患有HPV阴性肿瘤的吸烟者倾向于有更大的终生暴露风险[中位包装年数=41，四分位间距（IQR）=24.5，N=29例]（中位包装年数=30，IQR=26.3，N=21例）(P（P）>0.05）（未制成表格）。与HPV阴性病例（75.0%）相比，HPV阳性病例（92.6%）报告经常饮酒，尽管这一差异并不显著(P（P） = 0.10). 我们注意到，与经常饮酒的HPV阳性和HPV阴性病例相比，每天或几年的饮酒量没有差异（未制成表格）。最后，T分期和淋巴结状态与肿瘤HPV状态没有显著相关性。

EGFR、VEGF和NOTCH1在所有病例中的表达与肿瘤HPV分级的关系

在所有合并Kruskal–Wallis试验（KW）的病例中，表皮生长因子受体与VEGF呈正相关：P（P）<0.01]，HPV阴性（KW:P（P）=0.03）但非HPV阳性（KW:P（P）=0.16）肿瘤（图2). 相关性分析结果（表5)相似（HPV阴性：ρ=0.40，P（P） = 0.01; HPV阳性：ρ=0.25，P（P） = 0.20). 在所有合并病例中，NOTCH1与VEGF无关（KW：P（P） = 0.11; ρ = 0.22,P（P）=0.08）或HPV阳性（KW：P（P） = 0.77; ρ = −0.12,P（P）=0.57），但在HPV阴性病例中与VEGF相关（KW：P（P） = 0.02; ρ = 0.40,P（P）=0.01）（图三; 表5). 在HPV阳性或阴性病例中，NOTCH1与EGFR无关（表5). 探索性回归分析显示HPV和EGFR/NOTCH1在预测VEGF表达方面存在显著交互作用(P（P） = 0.02; 补充表1）。在HPV阴性肿瘤中，与EGFR/NOTCH1低肿瘤相比，EGFR/NOTCH1中等和EGFR/NOTCH1高肿瘤中的VEGF表达更高(P（P）而在HPV阳性肿瘤中，EGFR/NOTCH1的表达通常与VEGF无关。由于肿瘤HPV状态和EGFR/NOTCH1表达所定义的类别中样本量较小，因此在解释这些结果时需要谨慎。

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图2

VEGF表达的三分位数对EGFR表达的影响一所有肿瘤，bHPV阳性肿瘤，c（c）HPV阴性肿瘤。P（P）值来自Kruskal–Wallis测试

表5

免疫组织化学检测标记物的Spearman相关性

	槽口1	表皮生长因子受体	血管内皮生长因子
所有案例
槽口1		0.11	0.22
		0.37	0.08
		66	66
表皮生长因子受体	0.11		0.33
	0.37		0.007
	66		67
血管内皮生长因子	0.22	0.33
	0.08	0.007
	66	67
HPV阳性病例
槽口1		0.32	−0.12
		0.11	0.57
		26	26
表皮生长因子受体	0.32		0.25
	0.11		0.20
	26		27
血管内皮生长因子	−0.18	0.25
	0.57	0.20
	26	27
HPV阴性病例
槽口1		−0.04	0.40
		0.79	0.01
		40	40
表皮生长因子受体	−0.04		0.40
	0.79		0.01
	40		40
血管内皮生长因子	0.40	0.40
	0.01	0.01
	40	40

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数字为：ρ（相关系数），P（P）值，N

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图3

通过VEGF表达的三分位数表达NOTCH1一所有肿瘤，bHPV阳性肿瘤，c（c）HPV阴性肿瘤。P（P）值来自Kruskal–Wallis测试

讨论

我们使用IHC来比较HPV阳性和HPV阴性HNSCC的肿瘤血管生成标记物的表达差异。我们观察到，与HPV阳性HNSCC相比，在HPV阴性的HNSCC中，EGFR-a细胞表面受体通过几种下游信号转导途径与血管生成相关的表达更高；在HPV阴性肿瘤中，EGFR与VEGF（一种分泌的血管生成介质）相关。我们的研究还提供了关于NOTCH1的初步报告，NOTCH1-是一种细胞表面受体，在HNSCC的细胞生长和分化以及血管生成标记物中起重要作用。我们的数据显示，在HPV阴性肿瘤中，NOTCH1和VEGF之间存在关联，而在HPV阳性或阴性HNSCC中，NOCCH1和EGFR之间没有关联。

此前曾报道过EGFR在HPV阴性的HNSCC中的过度表达[10–13,31,32]. 这可能是因为与HPV阳性肿瘤相比，HPV阴性肿瘤中EGFR拷贝数较高[33–36]. EGFR信号传导导致几个可能影响VEGF转录或翻译的下游途径的激活，包括Ras/MAPK、PI3K/Akt/mTOR和STAT3途径[37,38]. 特别值得注意的是STAT3，它诱导HNSCC细胞系中VEGF的转录[14]. 因此，假设EGFR在HPV阳性的HNSCC中确实表达不足，人们可能会期望HPV阳性肿瘤中VEGF的表达减少。然而，我们的研究和其他[10]与HPV阳性和HPV阴性HNSCC相比，VEGF表达无差异。虽然这一结果可能归因于低统计能力，但奇怪的是，我们在HPV阴性HNSCC中EGFR表达较高的同一样本中进行了这一观察。总之，这些发现提示HPV阳性的HNSCC可能较少依赖EGFR进行血管生成。据我们所知，我们的研究是首次使用IHC在同一肿瘤样本中研究HPV-EGFR和HPV-VEGF相关性的HNSCC研究。我们的结果表明，有必要对这些关联进行进一步研究。

我们观察到EGFR与VEGF相关，这与HNSCC细胞系的证据一致[14]以及使用聚合酶链反应（PCR）检测对HNSCC肿瘤的研究[18]. 在我们的研究中，EGFR–VEGF的相关性在所有合并病例中都很明显，但我们的数据表明，这一结果是由HPV阴性HNSCC的相关性驱动的。据我们所知，我们的研究是第一份关于HNSCC中HPV状态与EGFR–VEGF相关性的报告。然而，之前的一项口腔癌研究表明，HPV通常为阴性[6]，报告没有EGFR–VEGF相关性，但与我们的样本相比，本研究中的肿瘤EGFR和VEGF阳性的可能性略低[19]. 一项关于HPV阳性和HPV阴性扁桃体癌的研究也报告，在所有合并病例中EGFR-VEGF均无相关性[12]. 然而，我们的样本中HPV阴性肿瘤的比例较高（60%）（与上述研究中的51%相比[12])可能会让我们有更大的能力检测关联[12].

在我们的研究中，NOTCH1的表达仅在HPV阴性肿瘤的VEGF表达的三分位中增加。据我们所知，我们是根据HNSCC中的HPV状态首次报道NOTCH1和VEGF之间的相关性。然而，我们并不是第一个将NOTCH1与HNSCC的血管生成联系起来的人[21]. 一项先前的研究表明NOTCH1与口腔舌癌MVD相关[21]. 虽然这项研究没有直接比较NOTCH1和VEGF，但它也显示了MVD和VEGF[21]. 然而，本研究未评估肿瘤HPV状态[21]，口腔舌癌通常是HPV阴性[6]因此，我们相信我们的结果与这些发现是一致的。我们的观察表明，在HPV阴性肿瘤中，NOTCH1与VEGF相关，而与EGFR无关，这表明NOTCH2可能与HPV阴性瘤中独立于EGFR的血管生成相关。我们对VEGF表达与EGFR/NOTCH1联合表达的分析结果进一步支持了这一假设，结果表明：（1）EGFR/NODCH1表达仅在HPV阴性肿瘤中显著预测VEGF的表达；（2）与表达两种受体水平较低的肿瘤相比，表达EGFR和NOTCH1或两者中较高水平的肿瘤中，HPV阴性肿瘤中VEGF的表达在统计学上显著高于表达这两种受体的肿瘤。我们相信这些结果可能有生物学基础，因为NOTCH1的表达与口腔舌癌中STAT3的表达呈正相关[39]，STAT3激活VEGF的转录[14]. 我们回顾了有关该主题的文献，但无法确定任何同时检测HPV阳性和HPV阴性HNSCC中EGFR、VEGF和NOTCH1的IHC研究。因此，我们的结果应被视为初步结果。

我们研究中的免疫染色评估由一位对肿瘤HPV状态一无所知的头颈病理学家进行。我们使用了市售抗体和阳性对照。然而，我们的研究包括一个相对较小的样本，我们进行了许多统计测试，没有纠正I型错误。我们还必须指出，我们研究中的HPV阴性病例包括口腔癌和口咽癌。由于亚组规模较小，我们无法评估肿瘤部位在HPV阴性肿瘤中EGFR-VEGF相关性中的作用。此外，在解释NOTCH1的结果时需要谨慎。具体地说，我们的NOTCH1抗体识别整个NOTCH2蛋白，以及NOTCH1的跨膜或胞内结构域（表1). 因为当蛋白被激活时，NOTCH1的胞内结构域被裂解[40]，我们对NOTCH1表达的观察结果可能包括活性蛋白和非活性蛋白。此外，鉴于HNSCC中NOTCH1突变的位置[22,23]和我们抗体的目标残留物（表1)，我们可能检测到突变型和野生型NOTCH1。这些区别在比较HNSCC亚群分子表型方面的重要性尚不清楚，因为HPV阳性和HPV阴性HNSCC中NOTCH1突变的相对频率和真正功能仍在研究中[22,23].

我们还必须指出，我们的研究并没有区分不同类型的HPV感染。例如，其他人已经使用p16 IHC和HPV DNA检测来识别活动性HPV感染（携带HPV DNA并表达p16的肿瘤）和非活动性HPV感染（携带HPV DNA但不表达p16的肿瘤）[41]. 虽然我们使用的原位杂交分析有几个优点，包括能够在肿瘤组织中特异性定位HPV，以及能够直观区分间期病毒和整合病毒[42]，我们无法区分转录活性和非活性HPV，因为我们所有病例的病理报告中都没有p16表达。然而，在我们的27例HPV阳性病例中，有数据可用的21例中，均表达p16（数据未显示）。这与先前的研究一致，这些研究显示p16在通过原位杂交鉴定为HPV阳性的大多数肿瘤中表达[43]. 因此，我们认为我们研究中的大多数HPV阳性病例可能代表转录活性HPV。

最后，也许我们研究的最大局限性在于，我们的结果反映了生物因素之间的联系，并且无法描述产生这些联系的机制。然而，我们认为我们的研究为今后开展评估此类机制的研究提供了动力。

总之，我们证明了HPV阳性和HPV阴性HNSCC在血管生成相关蛋白表达方面的差异，并且我们证明了NOTCH1的表达与血管生成相关蛋白质之间的关联。我们相信，我们的结果表明HNSCC血管生成的生物异质性具有潜在的治疗潜力。根据我们的调查结果，我们制定了一套工作假设（表6)我们希望这将为该领域未来的研究提供信息。我们预计需要一种多方面的方法，包括HPV阳性和HPV阴性HNSCC肿瘤血管生成机制的体外研究，以及在HPV阳性或HPV阴性的HNSCC抗血管生成治疗临床试验中血管生成标记物表达的组织病理学研究。

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