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大脑血流代谢杂志。2013年11月；33(11): 1732–1742.
2013年8月14日在线发布。 数字对象标识：10.1038/jcbfm.2013.143
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血管紧张素II诱导的高血压小鼠的年龄相关自动调节功能障碍和脑微血管损伤

彼得·托斯,1,5 苏珊娜·塔塞克,1,5 达努塔·索斯诺斯卡,1 特里普蒂·高塔姆,1 马修·米切伦,1 斯特凡诺·塔伦蒂尼,1 费伦斯·迪克,1 阿科斯·科勒,2,三 威廉·E·桑塔格,1,4 安娜·西沙尔,1,2,4,*和佐尔坦·恩格瓦里1,2,4,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

老年人高血压可导致脑微血管损伤，并促进血管认知功能障碍的发展。尽管肌生成机制在脑微血管保护中具有重要意义，但尚不清楚衰老如何影响脑动脉对高血压的功能适应。通过慢性输注血管紧张素II（AngII）在年轻（3个月）和老年（24个月）C57/BL6小鼠中诱导高血压。在年轻的高血压小鼠中，脑血流自动调节范围扩大到更高的压力值，大脑中动脉（MCA）的压力诱导张力增加。在老年高血压小鼠中，自身调节被明显破坏，MCA在肌源性张力方面没有表现出适应性增加。在年轻小鼠中，高血压适应机制包括上调20-HETE（20-羟基-5,8,11,14-二十碳四烯酸）/瞬时受体电位阳离子通道、C亚家族（TRPC6）通路，而在老年高血压小鼠中，该机制受损。老年AngII诱导的高血压小鼠脑血管自动调节功能障碍的下游后果包括血脑屏障和神经炎症的破坏加剧（小胶质细胞活化和促炎细胞因子和趋化因子的上调），这与海马依赖性认知功能受损有关。总之，衰老损害了AngII诱导的高血压小鼠大脑的自我调节保护，可能加剧脑微血管损伤和神经炎症。

关键词：血脑屏障、CBF、痴呆、炎症、肌源性、TRPC

介绍

高血压对大脑和脑循环有有害影响。西方世界的人口正在老龄化，由于高血压影响到大多数老年人（65岁），这些人更有可能患上脑血管疾病。1越来越多的证据表明，在老年人中，高血压引起的微血管损伤促进了血管认知功能障碍的发展，2,三这是继阿尔茨海默病之后认知障碍的第二常见原因。

流行病学研究提供的证据表明，除了老年人高血压患病率增加外，高血压的有害脑血管影响在老年患者中也会加剧，而年轻人似乎更容易受到高血压引起的脑组织血管损伤的保护。4,5,6虽然现有的人类数据表明，高龄和高血压具有协同作用，但还没有研究探讨衰老增加脑微血管对高血压易感性从而导致血管认知障碍的特定年龄相关机制。7

对幼年动物的研究表明，脑动脉对高血压具有功能和结构适应性，从而保护大脑微循环的远端免受压力过载的影响。8,9在这些适应性反应中，压力增加引起的脑动脉肌源性收缩具有重要意义。10,11,12以前的研究表明，在年轻的高血压动物中，肌源性机械的压力敏感性增加导致大脑动脉水平的阻力增加，使薄壁、易受伤的小动脉和毛细血管的压力保持在正常范围内，而组织血供和氧合几乎没有变化。由于这种适应性反应，高血压实验动物和高血压患者的脑血流（CBF）自动调节范围扩大到更高的压力值。8,9,13高血压和中风动物模型的研究14提示自动调节保护的病理性丧失有助于脑微血管损伤。尽管肌源机制在脑组织血管保护中至关重要，但人们还不清楚衰老如何影响高血压患者脑动脉的功能适应。

本研究旨在验证衰老损害脑动脉对高血压的功能适应这一假说。基于这一假设的预测是，与年龄相关的自我调节保护丧失会加剧高血压引起的微血管损伤和神经炎症，从而导致认知能力下降。为了验证我们的假设，我们通过慢性输注血管紧张素II（AngII）诱导年轻和老年C57BL/6小鼠高血压，并评估动脉肌源性收缩和CBF自身调节、血脑屏障（BBB）功能、微血管密度、神经炎症标记物和认知功能的变化。

材料和方法

有关方法的详细说明，请参阅补充实验程序.

老鼠

年轻（3个月，n个=80）岁（24个月，n个=80）雄性C57/BL6小鼠购自国家老龄研究所。年轻人（3个月大）和老年人（24个月大的）队列α-平滑肌肌动蛋白(α还使用了SMA）-GFP转基因小鼠（以观察周细胞）。所有程序均由参与机构的机构动物使用和护理委员会批准，并符合ARRIVE指南。

血管紧张素Ⅱ诱导的高血压

为了诱导高血压，年轻和老年小鼠通过皮下植入的渗透微型泵接受AngII（每公斤1000纳克/分钟）输注4周。在4周的实验期间，用尾袖法测量每个实验组小鼠的收缩压。

行为研究

在微泵植入后的第4周，使用一种基于maze的提升学习方案评估小鼠的学习能力。

脑血管自动调节

在麻醉、通气小鼠植入后第28天，用激光散斑流速仪测量皮质血流量。通过静脉注射苯肾上腺素（1至2），血压在20毫米汞柱的阶梯内升高或降低μg/kg/min）或通过控制性抽血（100至400μ动脉血L）。研究的血压范围为40至160毫米汞柱。相对于收缩压为80 mm Hg的CBF，表达了CBF的变化。然后，处死动物并分离组织以备后续使用在体外功能研究和生化分析。

大脑中动脉压力和流量感应反应的评估

为了评估大脑中动脉（MCA）的脑血管自动调节功能，评估了血管肌源性反应中的静态和动态成分。

20-羟基-5,8,11,14-二十碳四烯酸（20-HETE）是由细胞色素P450Ω-羟化酶产生的花生四烯酸的一种强有力的血管收缩代谢物，通过促进大脑动脉的压力和流量依赖性反应，在调节CBF中起着中心作用。15,16,17为了评估20-HETE在年龄和高血压诱导的肌源性反应变化中的作用，将MCAs与细胞色素P450孵育ω-羟化酶抑制剂HET0016（10−6 mol/L），并重新评估肌源性反应。

先前的研究表明，瞬时受体电位阳离子通道、C亚家族（TRPC6）通道的激活至少部分介导了20-HETE诱导的血管舒缩反应。为了评估TRPC通道在年龄和高血压诱导的肌源性反应变化中的作用，用SKF96365型（5×10−6 mol/L，持续15分钟），TRPC通道的强效阻断剂，并重新评估肌源性反应。

在隔离的MCA中，我们还评估了血流诱导的收缩，这是一种重要的局部血管调节机制，涉及保护大脑微循环和调节血流。血管对ATP和腺苷的反应（10−8和10−7 mol/L）。

在每个实验结束时，获得了最大膨胀MCA的压力-体积直径曲线。

定量实时RT-PCR

采用定量实时RT-PCR技术分析小鼠骨髓基质干细胞的mRNA表达Cyp4a12细胞,Cyp4a10细胞,Cyp4a14细胞,Trpc6号机组,三氯二苯甲烷,Trpc7号机组,事务处理程序4、和可可碱1每个实验组小鼠的MCA。

血脑屏障完整性评估

荧光素钠示踪分析

为了量化BBB的渗透性，我们使用荧光素钠示踪法。简言之，在一组单独的麻醉小鼠中进行4周的实验期后，通过眼眶后注射静脉注射小剂量水溶性示踪剂荧光素钠（5 mL/kg，2%生理盐水）。示踪剂循环30分钟后，用含1×肝素的磷酸盐缓冲盐水经心灌注动物。然后，将小鼠斩首并取出大脑。从每个大脑中分离海马体、白质和额叶皮层并使其均匀化。溢出的荧光素钠使用微孔板阅读器进行荧光分光光度定量，并根据组织重量进行标准化。

免疫荧光法显示IgG外渗

免疫荧光标记和共聚焦显微镜也显示IgG外渗，这是海马BBB通透性增加的额外标志。

西方印迹法

对MCA匀浆中TRPC6和海马匀浆中紧密连接蛋白（ZO-1、闭塞素和克劳丁-5）进行免疫印迹研究。研究蛋白质的相对丰度用密度测定法测定β-肌动蛋白作为加载控件。

周细胞覆盖率

周细胞在维持血脑屏障和保持脑微循环结构完整性方面发挥着关键作用。18评估年龄和高血压引起的青年和老年人脑切片中微血管周细胞覆盖率的变化α对患有或不患有AngII诱导的高血压的SMA-GFP转基因小鼠进行内皮标记物CD31的免疫标记。使用体视学方法，计算每个CD31阳性毛细血管表面积的周细胞数（确定为具有典型周细胞形态的GFP阳性细胞，包括延伸至毛细血管的长突起和血管周定位）。

毛细管密度分析

CD31免疫荧光标记用于识别脑内微血管。使用体视学方法，将海马CA1、CA3和齿状回、脾后皮质、初级体感皮质（S1）和胼胝体的毛细血管密度量化为血管长度<10μm，使用Neurolucida软件（MBF Bioscience，Williston，VT，USA）。

神经炎症

通过CD68（活化小胶质细胞/巨噬细胞的标记物）和Iba-1（小胶质细胞标记物）的免疫荧光标记定量海马切片中的小胶质细胞活化。

除了量化小胶质细胞的激活外，我们还通过定量实时PCR分析了几种神经炎症细胞因子/趋化因子的相对丰度，这些RNA是从snap冷冻的脑样本中分离出来的。

为了进一步描述我们队列中神经炎症的特征，选择微珠蛋白衍生的促炎因子（MCP-1、TNF）的蛋白水平α和IP-10），使用荧光珠分析法在海马匀浆中进行分析。为了标准化，使用样品蛋白质含量。

海马蛋白3-硝基酪氨酸含量的测定

作为海马氧化/亚硝化应激的标志物，在海马匀浆中评估3-硝基酪氨酸（3-NT；过氧亚硝酸盐作用的标志物）。

统计分析

数据由Tukey进行双向方差分析事后（post-hoc）测试和皮尔逊相关性分析。A类P（P）<0.05的值被认为具有统计学意义。数据表示为平均值±标准误差。

结果

老年高血压小鼠脑血管自动调节受损

在接受AngII输注的年轻和老年小鼠中，血压都显著升高，如图1A在年轻对照小鼠中，CBF在60至120 mm Hg范围内独立于血压，这表明存在自我调节(图1B). 在年轻和老年正常血压小鼠中未观察到自身调节的差异(图1B). 然而，在年轻的高血压小鼠中，CBF和血压之间的关系发生了实质性改变。自动调节范围逐渐扩大，表明存在自适应响应(图1B)在老年高血压小鼠中完全没有。在老年高血压小鼠中，血压与CBF之间基本呈线性关系，这表明CBF对血压的完全依赖性和自动调节功能的丧失(图1B).

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衰老损害脑血管自动调节对高血压的适应。(A类)慢性输注血管紧张素II（AngII）对年轻和老年小鼠收缩压的影响。数据为平均值±标准误差(n个=每组20至25）*P（P）<0.05 vs.年轻；&P（P）与老年人相比，<0.05。(B类)年轻对照组、年轻高血压（young+AngII）、老年对照组和老年高血压（aged+AngIII）小鼠的脑血流（CBF）和收缩压之间的关系。数据为平均值±标准误差(n个=每组8人）。在年轻对照小鼠中，在<60和>140毫米汞柱的压力值下，CBF与100毫米汞柱的值在统计学上不同，表明其具有自动调节范围。在年轻的高血压小鼠中，自动调节范围逐渐扩大，表明存在适应性反应(*P（P）<0.05 vs.Young），这在老年高血压小鼠中完全不存在(#P（P）<0.05 vs.Young+AngII）。(C类)每一实验组小鼠大脑中动脉（MCA）的直径随着腔内压力的增加而发生稳定变化，代表肌源性反应的静态成分。血管直径表示为80 mm Hg时每个血管最大扩张被动直径的百分比。(D类)MCA直径的变化导致腔内压力突然增加（从60毫米汞柱到140毫米汞柱），代表肌源性反应的动态成分。(E类)流动引起MCAs收缩（通过在血管中产生压力梯度来增加管腔内流量而引起）。数据为平均值±s.e.m(n个=8至16）*P（P）<0.05 vs.年轻；#P（P）<0.05 vs.Young+AngII；&P（P）与老年人相比，<0.05。

衰老损害脑动脉的自动调节功能：肌源性收缩和血流诱导收缩的作用

图1C显示在20至180毫米汞柱的腔内压力下，孤立MCA出现肌源性收缩。在年轻对照小鼠的MCA中，血管内压力增加使肌源性收缩增加至60 mm Hg，肌源性张力维持在几乎相同的水平，高达～120 mm Hg。这与CBF的自身调节范围重叠。在较高压力下，肌源性张力随后趋于降低，动脉逐渐扩张(图1C). 年轻高血压小鼠MCA的肌原性收缩明显增强，肌原性张力维持在几乎相同的水平，高达～160 mm Hg，这与这些动物的CBF自身调节范围增加相对应。老年小鼠大脑中动脉肌源性收缩略有减少，而年轻小鼠中没有表现出类似的高血压诱导的肌源性缩窄适应性增加(图1C). 各组MCA的压力-容积直径曲线相似(补充图S1). 我们还研究了肌源性反应的时间依赖性行为。在年轻对照小鼠的MCA中，腔内压力从60毫米汞柱逐步增加到140毫米汞柱，仅导致直径略有增加(图1D). 在年轻高血压小鼠的MCA中，肌源性收缩增强，且未观察到直径增加。相反，老年小鼠的MCA不能维持静息张力，也没有表现出高血压诱导的肌源性收缩适应性增加(图1D).

管腔内流量的增加导致幼年小鼠MCA的血管收缩，这种反应因高血压而增强(图1E). 相反，老年高血压小鼠大脑中动脉的血流诱导收缩没有适应性增加(图1E).

20-HETE和TRPC6在老年脑动脉功能性高血压适应不良中的作用

为了评估20-HETE在脑动脉对高血压的功能适应中的作用，我们测试了HET0016在病理生理相关压力范围（⩾160 mm Hg；图2A至2C). 因为我们发现，在小鼠动脉中，20-HETE的血管收缩作用被TRPC6抑制剂显著抑制SKF96365型(补充图S2)我们还使用该抑制剂评估了TRPC6通道在20-HETE依赖的脑动脉高血压功能适应中的作用。我们发现，在年轻高血压小鼠的MCA中，HET0016和(图2C)以及SKF96365型(图3C)消除了四组之间的差异，而HET0016和SKF96365型显著影响老年高血压小鼠MCA的肌原性张力。HET0016型(图2D和2E)以及瑞典克朗96365（未显示）也抑制了年轻高血压小鼠MCAs中肌源性收缩和流动诱导的收缩的增强的动态成分，而它对老年高血压小鼠的MCAs没有显著影响。高血压与CYP4A花生四烯酸表达上调有关ω-羟化酶Cyp4a12细胞,Cyp4a10细胞、和Cyp4a14细胞(图2F至2H)和TRPC6通道(图3D和3E)在年轻小鼠的MCA中，而在老年高血压小鼠的MCAs中，这些适应性反应显著受损或缺失。高血压并没有显著增加三氯二苯甲烷,Trpc7号机组,事务处理程序4（瞬时受体电位阳离子通道，M亚家族，成员4）和可可碱1年轻和老年小鼠MCA中的（L型钙通道）（数据未显示）。

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20-羟基-5,8,11,14-二十碳四烯酸（20-HETE）在老年高血压小鼠脑血管自动调节功能障碍中的作用。(A类,B类)HET0016（10）的影响−6 mol/L），一种20-HETE合成抑制剂，对从年轻对照组、年轻高血压（young+AngII）、老年对照组和老年高血压（aged+AngIII）小鼠分离的大脑中动脉（MCA）的肌源性收缩，以应对腔内压力的增加。血管直径表示为80 mm Hg时血管被动直径的百分比。(C类)在160 mm Hg的腔内压力下，无HET0016和有HET0011时MCA的肌源性张力。数据为平均值±标准误差(n个=每组8人）*P（P）<0.05 vs.年轻和#P（P）<0.05 vs.Young+AngII。(D类,E类)HET0016对肌源性反应早期快速期的影响(D类; 由腔内压力从60毫米汞柱突然增加至140毫米汞柱引起）和流动性收缩(E类; 通过血管产生压力梯度，增加腔内流量；见材料和方法）。数据为平均值±标准误差(n个=8至16）。#P（P）<0.05 vs.Young+AngII。(F类到小时)QRT-PCR数据显示MCA中细胞色素P450 4A酶的mRNA表达。数据为平均值±标准误差(n个=每组6人）*P（P）与Young相比<0.05；#P（P）与Young+AngII和&P（P）与老年人相比，<0.05。血管紧张素II。

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瞬时受体电位阳离子通道C亚家族（TRPC6）在老年高血压小鼠脑血管自动调节功能障碍中的作用。(A类,B类)影响SKF96365型(5 μmol/L）、TRPC通道阻滞剂和HET0016（10−6 mol/L），一种20-羟基-5,8,11,14-二十碳四烯酸（20-HETE）合成抑制剂，对从年轻对照组、年轻高血压（young+AngII）、老年对照组和老年高血压（aged+AngIII）小鼠分离的大脑中动脉（MCA）的肌源性收缩作用。血管直径表示为80 mm Hg时血管被动直径的百分比。(C类)无MCA和有MCA时的肌原性张力SKF96365型和HET0016，腔内压力为160 mm Hg。数据为平均值±标准误差(n个=每组8人）*P（P）<0.05 vs.年轻和#P（P）<0.05 vs.Young+AngII。(D类,E类)信使核糖核酸(D类; QRT-PCR数据）和蛋白质表达(E类; western-blotting，一个代表性的western-mlot（共三个）显示了每组的两个样本（每组，n个=6只动物的6条血管）。数据为平均值±标准误差(n个=每组6人）*P（P）<0.05 vs.年轻和#P（P）<0.05 vs.Young+AngII。

衰老加剧高血压引起的血液-脑屏障破坏

使用荧光素钠示踪法，我们验证了老年高血压小鼠脑血管自动调节功能障碍导致血脑屏障破坏的假设。正如我们的模型预测的那样，我们发现衰老会加剧高血压引起的海马、皮层和白质的荧光素渗漏(图4A). 老化就其本身而言也有增加荧光素渗漏的趋势，但这些变化仅在皮层和白质中达到统计学意义。我们假设，衰老的高血压脑也无法维持血脑屏障对抗内源性循环大分子，其中一些大分子具有显著的促炎作用，并可能具有神经毒性。血浆源性IgG免疫染色显示老年高血压小鼠海马血管周围IgG沉积显著(图4B). 幼年高血压小鼠海马中的IgG泄漏显著减少，而幼年对照小鼠中没有检测到IgG泄露。神经退行性疾病中的血脑屏障破坏通常表明紧密连接蛋白表达减少导致紧密连接中断。19在这方面，重要的是，在老年高血压小鼠的海马中，它们的表达也趋于下调(图4C)，尽管这些改动就其本身而言不太可能解释高血压诱导的血脑屏障破坏在衰老过程中加剧的原因。

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衰老加剧了高血压引起的血脑屏障破坏。(A类)高血压和衰老导致年轻对照组、年轻高血压（young+AngII）、老年对照组和老年高血压（aged+AngIII）小鼠海马、皮层和白质中荧光素钠含量的变化。数据为平均值±标准误差*P（P）<0.05 vs.Young，#P（P）<0.05 vs.Young+AngII；和&P（P）<0.05与老年人(n个=6至10）。(B类)共焦显微镜分析患有或不患有AngII诱导高血压的年轻和老年小鼠海马中血浆衍生IgG（绿色）和CD31阳性微血管（红色）。注意，老年高血压小鼠海马中血管外IgG沉积增加。(C类)闭塞素、克劳丁-5和ZO-1在年轻和老年血压正常和高血压小鼠海马中的表达。上面板：原装西方墨迹。β-肌动蛋白被用作加载控制。展示了一个代表性的western blot（共三个），显示了每组的两个样品（每组，n个=6只动物的6只血管）。条形图是总密度值。数据为平均值±标准误差*P（P）<0.05 vs.年轻。n个=每组6只动物。血管紧张素II。

老年高血压患者周细胞丢失和微血管重构

因为最近的研究表明周细胞丢失会损害血脑屏障的完整性，20我们评估了年龄和高血压引起的海马微血管周细胞覆盖率的变化(图5A至5E). 在幼年小鼠中，高血压导致周细胞的相对数量显著下降(图5F)毛细血管周细胞覆盖率（约29%）。在老年小鼠中，高血压导致周细胞数量减少(图5F)周细胞覆盖率（约41%）加重。我们还确定周细胞丢失是否影响老年高血压小鼠的脑毛细血管密度。毛细血管通过CD31的表达进行鉴定，管腔直径为10μm或更小作为标准标识符。如所示图5G老年小鼠的CA1、CA3和齿状回、脾后皮质、初级体感皮质和胼胝体毛细血管长度密度的相对高血压诱导的下降显著大于年轻小鼠。

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高血压导致海马毛细血管周细胞覆盖率和海马毛细血管密度的变化。(A类)代表性共焦图像显示α-平滑肌肌动蛋白(αSMA）在小鼠海马CA1区CD31阳性毛细血管内皮细胞（红色）周围表达周细胞（绿色，箭头）。Hoechst 33342用于核复染。(B类到E类)典型共焦显微镜分析α青年对照组海马CA1区CD31阳性毛细血管（红色）周细胞覆盖率（绿色箭头）表达SMA(B类)，年轻高血压（young+AngII）(C类)，老化控件(D类)和老年高血压（老年+AngII）(E类)动物。请注意α终末小动脉周围表达SMA的周细胞（箭头）和血管平滑肌细胞表现出不同的形态。(F类)摘要数据显示海马周细胞覆盖率的高血压依赖性丢失（参见补充实验程序详细信息）*P（P）<0.05 vs.年轻；#P（P）<0.05 vs.Young+AngII；和&P（P）与老年人相比，<0.05。(G公司)高血压诱导年轻和老年小鼠海马CA1和CA3区、齿状回（DG）、脾后皮质（RSA）、初级体感皮质（S1）和胼胝体（cc）毛细血管密度的相对变化。方框表示毛细血管密度评估中包含的大脑区域（参见补充实验程序详细信息）。血管紧张素II。

老龄化加重者高血压引起的海马炎症和氧化应激

先前的研究表明，血浆衍生因子通过受损的血脑屏障泄漏，有可能通过激活小胶质细胞诱发神经炎症。19在幼年小鼠海马中，激活的小胶质细胞数量较少，高血压诱导的小胶质激活变化没有达到统计学意义。我们发现，老化与海马中激活的小胶质细胞数量的相对增加有关。重要的是，老年小鼠海马中高血压诱导的小胶质细胞激活加剧(图6A至6F). 小胶质细胞持续活化与几种促炎细胞因子和趋化因子的表达增加有关(图6G)以及老年高血压小鼠海马中的其他炎症介质（数据未显示）。MCP-1、TNF的蛋白表达增加证实了这些发现α和IP-10(图6I和6J)，已知由老年高血压小鼠海马中活化的小胶质细胞分泌。

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衰老加剧了高血压引起的神经炎症和认知能力下降。(A类到D类)年轻对照组海马CA1区CD68阳性（红色荧光，箭头）激活的小胶质细胞(A类)，年轻高血压（young+AngII）(B类)、老年对照组（C1和老年高血压（老年+AngII）(D类)动物（蓝色荧光：细胞核）。面板(E类)显示在老年高血压小鼠的海马中，大多数CD68阳性细胞对IBA1呈阳性（箭头），但也存在CD68+/IBA1−细胞（星形）。面板(F类)描述了海马CA1和CA3区CD68阳性激活的小胶质细胞数量的相对变化（倍数变化）的汇总数据。数据为平均值±标准误差*P（P）<0.05 vs.年轻；#P（P）<0.05 vs.Young+AngII；和&P（P）与老年人相比，<0.05。(G公司)衰老中的高血压与小鼠海马中细胞因子表达谱的促炎性改变有关。热图是细胞因子和趋化因子的标准化mRNA表达的图形表示，用颜色强度表示，从最高（亮红色）到最低（亮蓝色）表达(n个=每组6人）。老年高血压小鼠的炎症标记物表达最高。(小时到K（K）)小胶质细胞衍生的促炎细胞因子MCP-1在海马的相对水平(小时)、TNFα(我)和IP-10(J型)和3-硝基酪氨酸（3-NT）（过氧亚硝酸盐作用的标志物；K（K）). 数据为平均值±标准误差*P（P）<0.05 vs.年轻；#P（P）<0.05 vs.Young+AngII；和&P（P）与老年人相比，<0.05。(L（左）,米)老龄化加剧了高血压诱导的认知障碍（升高+基于迷宫的学习方案；参见补充实验程序详细信息）。对于老年高血压小鼠，第1天和第2天的转移潜伏期相似（对应于学习指数：～0），表明这些小鼠海马认知功能显著受损。数据为平均值±标准误差*P（P）<0.05 vs.年轻；#P（P）<0.05 vs.Young+AngII；和&P（P）与老年人相比，<0.05。(N个)提出的方案描述了年龄相关性脑血管自动调节功能障碍加剧高血压引起的微血管损伤和血脑屏障（BBB）破坏的机制。未来的研究应阐明内皮功能障碍、微血管损伤、局部缺血、神经炎症和认知功能障碍之间的联系（虚线；问号）。血管紧张素Ⅱ；20-HETE，20-羟基-5,8,11,14-二十碳四烯酸。

神经炎症通常与氧化应激增加有关。与大脑中存在高血压相关的氧化/亚硝化应激相一致，21幼年高血压小鼠海马3-NT含量增加(图6K). 衰老加剧了高血压引起的海马3-NT含量增加(图6K)证实了年龄和高血压的影响是协同的。

老年高血压患者海马认知功能下降

为了确定BBB完整性受损、微血管稀疏、氧化/亚硝化应激和慢性低度神经炎症是否足以诱发神经元功能障碍，我们研究了海马依赖性学习和记忆。对于年轻对照小鼠，第2天的转移潜伏期与第1天相比显著降低(图6L)，表示完整的学习效果（学习指数：1）。与年轻对照小鼠相比，年轻高血压小鼠（～0.7）和老年小鼠（～0.67）的学习指数趋于下降，尽管差异没有达到统计学意义。对于老年高血压小鼠，第1天和第2天的转移潜伏期相似（对应于～0的学习指数），表明这些小鼠的海马认知功能明显受损。

讨论

本研究结果表明，老年脑动脉对高血压的功能性适应障碍是由于20-HETE/TRPC通路的失调所致。我们还表明，患有AngII诱导的高血压的老年小鼠的自身调节功能障碍与BBB破坏加剧、神经炎症和认知能力下降有关。

在脑循环中，较大的软脑膜动脉在脑血管阻力中起着重要作用，因此脑血管树近端分支（即MCA）的肌源性收缩对保护脑微循环具有独特的重要性。22在健康幼年动物中，压力诱导的脑动脉肌源性收缩(图1C)作为一种关键的内稳态机制，它确保升高的动脉压不会穿透微循环的远端，并对大脑中的薄壁小动脉和毛细血管微血管造成损伤。10,11高血压幼鼠(图1B和1C)和老鼠，12,23脑动脉肌源性收缩增强，脑血管自身调节范围扩大，表现为这些血管对较高的全身血压的功能适应，保护脑微循环。8,9,10,11,12在这里，我们首次报道了老年小鼠的脑动脉在年轻小鼠中观察到的高血压诱导的肌源性收缩的适应性增加(图1C). 最近的研究表明，除了肌源性反应外，血流诱导的脑动脉收缩也可能有助于脑血管的自我调节功能。15,16这是首次研究表明，在年轻的AngII治疗的高血压小鼠中，血流诱导的动脉收缩也增强(图1E)代表功能性动脉适应高血压的另一个组成部分。这种适应性反应在老年AngII治疗的高血压小鼠中受损(图1E). 综上所述，血管紧张素II诱导的老年高血压与保护大脑的脑血管自动调节机制功能障碍有关。有趣的是，衰老就其本身而言与血流诱导收缩和肌源性反应的动态成分的轻度损伤有关(图1D)这表明，血压突然升高（例如，在瓦尔萨尔瓦动作中）可能会暂时穿透大脑微循环的远端，即使在正常衰老的情况下也是如此。

一些证据支持这样的观点，即在幼年动物中，20-HETE/TRPC依赖性通路的激活是脑动脉对高血压的功能适应的基础，并且这种适应反应在衰老过程中是功能失调的。在年轻的高血压小鼠中，20-HETE在较高的压力范围（与这些动物的血压重叠）中调节肌源性收缩的增加。这可能是由于细胞色素P450 4A的适应性上调所致ω-羟化酶(图2). 同样，在年轻的高血压大鼠中，压力诱导的大脑动脉中20-HETE的生成也显著增加。24在这里，我们首次报道在老年AngII融合型高血压小鼠中，这种20-HETE依赖性适应性反应受损(图2). 与这些发现一致，Cyp4A12（被认为是脑动脉中20-HETE的主要来源）的表达25)以及CypA10和CypA14的表达（它们也能在小鼠组织中产生20-HETE和其他血管收缩剂花生四烯酸代谢物26)与年轻的高血压动物相比，老年高血压MCA显著降低(图2). 上述结果值得进一步研究，以确定高血压引起的脑血管花生四烯酸代谢变化中与年龄相关的差异（包括评估20-HETE生成酶的蛋白表达和活性）。先前的研究表明，TRPC6通道的激活介导20-HETE诱导的细胞内Ca增加2+血管平滑肌细胞的水平27有助于大脑动脉的自我调节和肌源性收缩。28而在年轻小鼠脑动脉中，AngII诱导的高血压上调了TRPC6的表达，TRPC介导了肌源性收缩(图3)，这种适应性反应在老年AngII融合型高血压小鼠中受损。重要的是，Golovina及其同事和其他实验室的开创性研究表明，TRPC6通道在米兰高血压大鼠、醋酸脱氧皮质酮盐诱导高血压的啮齿类动物和达尔盐敏感大鼠的阻力动脉中也上调，导致收缩剂对激动剂和压力的反应增加。29,30,31对上述高血压模型的研究表明，质膜Na之间存在功能串扰+/钙2+交换器-1和血管TRPC6通道活性。29,32,33,34鉴于TRPC6通道在高血压发病机制中的拟议作用，未来的研究应确定年龄是否影响全身阻力动脉和肾脏中TRPC6渠道的表达/活性。

最近，我们提出脑动脉的流动性收缩可能参与对系统血压变化的自动调节机制。15,16虽然流动性收缩的确切机制尚不清楚，但有证据表明，20-HETE依赖性通路在实验动物脑动脉的流动性收缩中起着重要作用(图2)在人类身上。15,16因此，20-HETE依赖性通路的失调可能同时损害老年高血压小鼠脑血管自动调节的肌源性和流诱导成分。由于抑制20-HETE/TRPC6通路并不能完全消除年轻高血压小鼠脑动脉的肌源性收缩，因此我们不能排除其他机制在老年高血压功能性适应不良中的潜在作用，包括参与血管平滑肌细胞钙稳态的途径。细胞色素P450 4A失调的年龄相关机制ω-羟化酶和TRPC通道目前尚不清楚，可能包括与年龄相关的IGF-1缺乏症。35为支持这一概念，现有数据表明，小鼠IGF-1缺乏与高血压诱导的大脑动脉肌源性张力适应性改变受损有关（Toth和Ungvari，2012年未发表的观察结果）Cyp4a12b细胞表达（GEO数据集GDS2019和GDS1053）和认知能力下降，模仿衰老表型。

在这里，我们提供了证据表明，老年AngII融合型高血压小鼠的自我调节功能障碍与显著的脑微血管损伤有关。缺乏适当的自我调节保护可能会使高血压穿透大脑微循环的远端，从而导致老年AngII融合型高血压小鼠海马和其他脑区的BBB显著中断(图4). 高血压导致血脑屏障破坏的机制可能是多方面的。周细胞是血脑屏障的重要细胞成分19最近的研究表明周细胞缺乏Pdgfrβ+/−小鼠导致BBB功能显著受损20血管性认知障碍样综合征的发展。因此，在我们的研究中报道的高血压引起周细胞覆盖率增加的损失是可能的(图5)有助于AngII融合老龄小鼠的BBB破坏。目前尚不清楚老龄AngII融合型高血压小鼠周细胞丢失增加的机制。周细胞对氧化损伤敏感，因此可能加剧高血压诱导的氧化应激(图6)导致老年AngII融合小鼠周细胞丢失增加。周细胞在维护脑微循环结构完整性方面也起着关键作用；18因此，周细胞的丢失也可能导致老年AngII融合型高血压小鼠脑内微血管稀疏。未来的研究应阐明老年AngII融合型高血压小鼠毛细血管密度的降低是否与海马血流减少导致缺血灶有关，而缺血灶会对认知功能产生直接的有害影响。在这方面，重要的是，AngII诱导的高血压也通过增加内皮细胞中的氧化/亚硝化应激来损害大脑微循环的内皮调节。36,37

通过老年高血压小鼠受损的BBB血浆成分，包括IgG(图4B)，可以进入大脑。越来越多的证据表明，血浆衍生因子可以通过多种机制影响神经元功能，19,38包括神经炎症的诱导（例如，IgG通过IgG Fc受体激活小胶质细胞）。在这里，我们提供证据表明，在老年AngII融合型高血压小鼠中，BBB的破坏和IgG外渗的增加与神经炎症反应的加剧有关，如海马中活化的小胶质细胞和巨噬细胞数量增加所示(图6A至6F). 我们还发现，在老年高血压小鼠的海马中，炎症介质的存在和表达增加，已知炎症介质是由活化的小胶质细胞分泌的。小胶质细胞衍生的促炎细胞因子、趋化因子、蛋白酶（即基质金属蛋白酶）和活性氧物质被证明可以促进神经元功能障碍。39,40根据上述研究，可以假设神经炎症的加重与老年小鼠高血压诱导的海马功能损害有关(图6). 临床研究表明，高血压治疗可使痴呆发病率降低19%至50%（进展41和Syst-Eur42). SCOPE研究还发现，使用坎地沙坦（一种AT1受体拮抗剂）治疗可以防止老年高血压患者认知功能下降。43

研究的局限性

理论上，敲除模型有助于表征TRPC6通道在MCA对高血压的功能适应中的作用。然而，现有TRPC6−/−小鼠模型显示，质膜离子通道的细胞表达发生了显著的代偿性变化。例如，在TRPC6中−/−小鼠血管TRPC3和TRPC7表达显著上调。44由于非TRPC6依赖性通路终身代偿性上调的潜在混杂效应，我们选择使用药理学方法来急性抑制TRPC通道，以研究高血压和衰老在MCA肌张力调节中的相互作用。博莱等45在给药后观察到完全阻断异源表达的TRPC6SKF96365型 在体外因此，我们在本研究中选择该药物来抑制TRPC6活性。然而，我们知道SKF96365型也可以抑制TRPC3/7通道。虽然高血压似乎不会上调TRPC3和TRPC7通道的脑血管表达，但我们不能排除这些通道的激活有助于MCA对高血压的功能适应的可能性。确定通道活性的决定性方法是使用膜片钳技术。缺乏此类测量是我们研究的一个局限。

视角

在本研究中，我们发现AngII融合的老龄小鼠大脑动脉对高压的功能适应受损，并且这些动物中与年龄相关的自身调节功能障碍与BBB破坏和神经炎症有关。未来的研究应阐明老年脑血管对高血压适应性受损的具体年龄相关机制，包括年龄相关变化在内分泌因素中的作用。35衰老可能会增加大脑微循环对高压本身的促炎效应的敏感性，而AngII可能会增强这些效应。未来的研究可以检验这个假设。高血压和衰老都会导致内皮功能障碍(补充图S3)神经血管耦合受损。37这些机制与肌源性自身调节之间的动态相互作用值得进一步研究。我们的研究结果表明，在老年人中，血压的突然、急性升高（例如，在瓦尔萨尔瓦动作期间）更有可能传递到薄壁脑微血管，这可能导致老年高血压患者脑微出血的发病率增加。46由于越来越多的证据支持脑微出血在认知功能下降中的因果作用，未来的研究应阐明20-HETE/TRPC通路依赖性自身调节保护中年龄相关变化与高血压患者脑微出血发生率之间的联系。

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息随附《脑血流与代谢杂志》网站上的论文(网址：http://www.nature.com/jcbfm)

这项工作得到了美国心脏协会（PT、AC和ZU）、美国老龄研究联合会（AC）、俄克拉荷马科学技术促进中心（AC、ZU和WES）的资助，OTKA KI08444和Nemzeti Fejlesztési u gymökség（SPOR-4.2.1/b-10/2/KONV-2010-0012，以及SROP-4.2.2.a-11/1/KONV-2012-0024和-0017至AK和ZU）、NIH（AG031085至AC；NCCAM-R01-AT006526至ZU；AG038747、NS056218和P01 AG11370至WES）和Ellison医学基金会（至WES。

补充材料

补充信息

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文章来自脑血流与代谢杂志由以下人员提供SAGE出版物