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公共科学图书馆一号。2013; 8（11）：e79106。
2013年11月11日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.pone.0079106
预防性维修识别码：项目经理3823972
PMID：24244429

Panobinostat通过抑制BRCA1、CHK1和Rad51的表达增强AML细胞对阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性

谢承志,#1,2,三 克里斯蒂娜·德伦伯格,#4 霍利·爱德华兹,1,2 J.蒂莫西·考德威尔,5,6 魏晨,1 稻田博彦（Hiroto Inaba）,7 徐雪莲,1,2 史蒂芬·A·巴克,8 杰弗里·陶布,2,8,9 莎琳·D·贝克,4和葛玉斌1,2,三,*
伊万·克鲁斯·莫拉，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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摘要

急性髓细胞白血病（AML）仍然是一种具有挑战性的疾病，迫切需要新的治疗方法来改善其治疗效果。在这项研究中，我们研究了帕诺司他和阿糖胞苷或柔红霉素（DNR）在AML细胞系和诊断性母细胞样本中协同抗白血病活性的分子机制在体外和体内Panobinostat以剂量依赖的方式抑制AML细胞中BRCA1、CHK1和RAD51的表达。此外，帕诺比诺显著增加阿糖胞苷或DNR诱导的DNA双链断裂和凋亡，并取消S和/或G2/M细胞周期检查点。通过shRNA敲除BRCA1、CHK1或RAD51获得类似结果。NOD-SCID-IL2Rγ的共处理无效的与单用阿糖胞苷或帕诺司他治疗相比，携带帕诺司特和阿糖胞甙的AML异种移植小鼠的存活率显著提高。其他研究表明，帕诺司他抑制了BRCA1、CHK1、，和雷达51通过下调E2F1转录因子。我们的结果建立了一种新的机制，支持这些药物组合的协同抗白血病活性，其中帕诺司他抑制BRCA1、CHK1、，和雷达51增强AML细胞对阿糖胞苷和柔红霉素的敏感性。

介绍

急性髓细胞白血病（AML）仍然是一个临床挑战。对阿糖胞苷（ara-C）和蒽环类药物[如柔红霉素（DNR）]的耐药性是该病治疗失败的主要原因[1]——[5]因此，迫切需要对这种致命疾病进行新的治疗。组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂（HDACIs）是一类很有前途的新型抗癌药物，可诱导人类白血病细胞分化、细胞周期停滞和凋亡，但在正常细胞中则不然[6]——[13].尽管它们具有良好的分子和细胞效应[9],[14]，HDACIs的单药临床活动适度[15]——[22]临床前数据表明，使用HDACI与其他化疗药物设计药物组合具有令人信服的理由[23]最近的临床研究表明，伏立诺司他与标准化疗可安全使用，且联合用药对AML有效[24],[25]我们之前在儿童AML细胞中证明了丙戊酸（VPA）和阿糖胞苷之间的协同抗白血病相互作用，并伴随着DNA双链断裂（DSB）和凋亡的协同诱导[26]; 然而，其潜在的分子机制在很大程度上仍不清楚。

我们最近的研究涉及使用结构多样的HDACIs治疗AML细胞系，以及单个HDACs的shRNA敲除，研究表明HDACs 1和6的下调对增强阿糖胞苷诱导的凋亡至关重要。在临床可达到的浓度下，帕诺比诺表现出最佳的抗白血病活性，并显著增强阿糖胞苷诱导的AML细胞凋亡，同时协同诱导DNA DSB[27]根据这些新发现和以前的研究表明，帕诺司他是临床开发中pan-HDACI中最有效的抑制剂[28],[29]，我们选择panobinostat作为本研究的HDACI原型。

HDACI增强阿糖胞苷诱导的DNA DSB和AML细胞凋亡的能力表明，它们可能抑制DNA损伤反应（DDR），这是一个涉及细胞周期检查点、DNA修复、转录程序和凋亡的复杂网络[30]——[33]在癌症治疗中，DDR是对DNA损伤剂（如阿糖胞苷和DNR）的反应，是限制化疗疗效的重要机制[30],[33]BRCA1和RAD51是同源重组DNA修复途径中的两个中心蛋白[34].乳腺癌和卵巢癌细胞巴西航空公司1突变对DNA损伤剂和放射治疗敏感，突出了BRCA1在应对DNA损伤剂中的关键作用[35],[36]RAD51在多种人类肿瘤中表达增加，很可能导致耐药性[37]细胞周期检查点激活以应对DNA损伤是DDR的另一个关键组成部分[30],[31].CHK1有助于所有当前定义的细胞周期检查点[30]已有文献证明，通过药物干预或siRNA敲除抑制CHK1可使癌细胞对S/G2相作用剂敏感[30],[38]BRCA1、CHK1和RAD51的下调将增强DNA损伤并消除DNA损伤剂诱导的细胞周期检查点，从而促进细胞凋亡。

在这项研究中，我们发现帕诺司他抑制巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51在临床上可达到的剂量（40nM及以下）的AML细胞系和诊断母细胞中。这伴随着DNA DSB和凋亡的协同诱导，以及阿糖胞苷或DNR诱导的细胞周期检查点的取消。通过shRNA敲除AML细胞中的BRCA1、CHK1或RAD51获得类似结果。总之，我们的结果强烈表明帕诺司他抑制DDR，这代表了HDACIs与AML和其他潜在癌症中的DNA损伤剂联合抗白血病活性的一种新的分子机制。

材料和方法

临床样本

诊断性骨髓样本（n=9，表S1)来自与从头开始AML来自密歇根州儿童医院白血病细胞库。通过标准Ficoll-Hypaque密度离心法纯化单核细胞。根据赫尔辛基宣言，父母或法定监护人提供了书面知情同意书。样本处理和数据分析协议由韦恩州立大学医学院人体调查委员会批准。

药物

阿糖胞苷和DNR购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。Panobinostat购自Selleck Chemicals（德克萨斯州休斯顿）。临床上，帕诺司他稳态血浆浓度在48小时内从15到22 nM不等（数据来自诺华研究人员手册）。

细胞培养

THP-1和U937细胞系购自美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA）。OCI-AML3细胞系购自德国微生物和细胞培养物收藏中心（DSMZ，德国布伦瑞克）。CTS细胞系是来自日本东京国立传染病研究所的Fuse博士的礼物[39]细胞系在含有10%胎牛血清（Hyclone、Logan、UT）和2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的RPMI 1640（或OCI-AML3细胞的αMEM）培养基中培养，培养温度为37°C，含5%CO2/95%空气。

诊断爆破样本的泛生物素治疗

诊断性冲击波样本在RPMI 1640/20%透析胎牛血清（加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）中培养，补充ITS溶液（Sigma-Aldrich）和5637膀胱癌细胞系的20%上清液（作为粒细胞吞噬集落刺激因子的来源）[40].细胞以1×10的密度进行培养6细胞/mL，并在含有5%CO的37°C湿化空气中，在0–40 nM帕诺司他存在下培养48小时2/95%空气。

细胞凋亡评估

如前所述，AML细胞系用帕诺司他和阿糖胞苷或DNR处理48 h，并进行流式细胞术分析，以使用Annexin V荧光素异硫氰酸盐（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡试剂盒（Beckman Coulter；Brea，CA）测定药物诱导的凋亡[26],[27]结果以Annexin V+细胞百分比表示。协同作用通过协同指数进行量化（协同指数=单药治疗的凋亡总和/联合治疗的凋亡）。协同指数<1、1或>1分别称为协同、相加或拮抗[41]。实验分三次独立进行。所提供的数据来自一个具有代表性的实验。

细胞周期进展

如前所述进行细胞周期分析[26]简单地说，收集AML细胞并用冰镇80%（v/v）乙醇固定24小时。在200×g离心5分钟后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）清洗细胞颗粒，并将其重新悬浮在含有PI（50 mg/mL）、triton X-100（0.1%，v/v）和无DNA核糖核酸酶（1 mg/mL）的PBS中。使用FACScan流式细胞仪（BD Biosciences，San Jose，CA）通过流式细胞术测定DNA含量。使用Multicycle软件（Phoenix Flow Systems，Inc.，San Diego，CA）进行数据分析。实验分三次独立进行。所提供的数据来自一个具有代表性的实验。

实时RT-PCR定量基因表达

使用TRIzol（Life Technologies）提取总RNA，使用随机六聚体引物和RT-PCR试剂盒（Life Technologies）从1µg总RNA中制备cDNA，并使用QIAquick PCR纯化试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚齐根）进行纯化，如前所述[27],[42].巴西航空公司1（Hs00173237_m1），CHK1号机组（Hx00967506_m1），雷达51（Hs00153418_m1）和E2F1根据制造商的说明，使用Taqman探针（Life Technologies）和LightCycler实时PCR机器（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）对（Hs00153451_m1）转录物进行定量。实时PCR结果表示为3个独立实验的平均值，并将其标准化为GAPDH公司（4333764）或RPL13a型（Hs03043885_g1）转录本。使用比较Ct吨方法[43].

Western Blot分析

细胞在含有蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液（10 mM，pH 8.0）中溶解（罗氏诊断公司）。对全细胞裂解物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Fisher公司），并用抗乙酰-雌酮4（ac-H4，06–598）、-H4（07–108）（纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology）、-BRCA1（9010）、-γH2AX（2577）、，如前所述，-RPL13a（2765）、-Caspase 3（9661）、-PARP（9542）、-p-CDC25C（9528）、-E2F1（3742）（马萨诸塞州丹佛市细胞信号技术）、-RAD51（sc-8349）、-CHK1（sc-8408，加州圣克鲁斯生物技术）-乙酰-管蛋白（T7451）或-β-肌动蛋白（A2228，Sigma-Aldrich）抗体[42]如制造商所述，使用Odyssey红外成像系统（Lincoln，NE，Li-Cor）对免疫反应蛋白进行可视化。Western blot重复至少3次，显示了一个代表性的blot。

体外细胞毒性试验

体外如前所述，使用MTT（3-[4,5-二甲基-噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物，Sigma-Aldrich）测定AML诊断爆炸的细胞毒性[44]简而言之，按照“诊断性冲击波样本的Panobinostat处理”中所述对细胞进行培养，并用可变浓度的panobinastat（0–160 nM）处理48小时。集成电路50数值计算为与未处理的对照细胞相比抑制50%增殖所需的药物浓度。集成电路50值是一个实验的重复值的平均值。

慢病毒颗粒的产生及THP-1细胞的转导

pMD-VSV-G和delta 8.2质粒是杜兰大学董博士赠送的。根据制造商的说明，使用Lipofectamine和Plus试剂（Life Technologies）进行转染。简单地说，将慢病毒载体（来自Sigma-Aldrich的BRCA1、CHK1或RAD51 shRNA构建物或来自Thermo Fisher Scientific Biosciences，Lafayette，CO的CHK1 cDNA构建物）、pMD-VSV-G和delta 8.2共同转染到TLA-HEK293T细胞中，并在转染后48小时获取培养基。通过添加1 ml病毒上清液和4µg聚brene（Sigma-Aldrich）转导100万个THP-1细胞[26],[27],[42].

彗星试验

感染NTC-、BRCA1-、CHK1-或RAD51-shRNA的THP-1细胞用50µM阿糖胞苷处理3 h。将细胞清洗并培养8 h。将收获的细胞与1.0%低熔点琼脂糖混合在37℃的PBS（无镁和无钙）中o个C.将约5000个细胞分层到预涂层显微镜载玻片上（预涂层载玻片涂有一层薄薄的1%低熔点琼脂糖，并让其干燥90分钟），将玻璃盖玻片放在细胞/琼脂糖悬浮液的顶部，并让凝胶在4°C下凝胶10分钟。然后将载玻片置于4°C的裂解溶液（2.5 M NaCl、10 mM Tris、100 mM EDTA、10%DMSO和1%Triton X-100，pH 10.0）中过夜。将载玻片置于电泳缓冲液（1 mM EDTA，300 mM NaOH，pH 13.0）中，在4°C下放置40分钟，以使DNA解旋。电泳在30V（1.25V/cm）下进行30分钟。电泳后，将载玻片在400 mL蒸馏水中冲洗，浸入95%乙醇中并干燥。DNA在室温下用1∶30000 SYBR Gold（Life Techonologies）在10 mM Tris、pH 7.5和1 mM EDTA中染色40 min。在蒸馏水中冲洗载玻片，并使用奥林巴斯DP72显微镜摄像头和奥林巴斯cellSens Dimension软件（奥林巴斯美国公司，宾夕法尼亚州中央山谷）在奥林巴斯BX-40显微镜上成像。使用CometScore（TriTek Corp，Sumerduck，VA）对每个凝胶中50颗彗星进行评分。取至少三个重复凝胶中尾部DNA的平均百分比并绘制图表。误差条表示平均值的标准误差。

白血病异种移植模型

将含有萤火虫荧光素酶基因（pMSCV-luc-IRES-GFP）的小鼠干细胞病毒绿色荧光蛋白载体转染U937细胞，经流式细胞术分选、培养扩增，并将10000个细胞静脉注射到8-12周龄雌性NOD-SCID-IL2Rγ的尾静脉无效的（NSG）小鼠（n=36），如前所述[45].

为了评估抗白血病活性，将8–10只荷瘤小鼠随机分为两组，分别接受帕诺司他[5 mg/kg，每日一次，为期3周，由诺华制药公司（瑞士巴塞尔）提供]、阿糖胞苷（6.25 mg/kg、每日一次、为期4周）、，或在注射U937细胞后第3天开始联合用药（帕诺司他5 mg/kg，每天一次，持续3周，再加上阿糖胞苷6.25 mg/kg（每天一次），持续4周）。在每次实验中，将一组经溶媒处理的小鼠作为对照。对于腹腔注射，帕诺司他用5%葡萄糖配制，阿糖胞苷用PBS配制。

如前所述，在所有实验中每周进行两次非侵入性成像以监测肿瘤植入[45]通过腹膜内注射给予剂量为150mg/kg的萤光素酶底物D-萤光素萤火虫钾盐（Caliper，Hopkinton，MA）。然后通过吸入1.5%–2.5%异氟醚对小鼠进行麻醉，5分钟后在圣犹德儿童研究医院的动物成像设施中使用氙气体内成像系统（马萨诸塞州霍普金顿）进行生物发光。对包括每只小鼠在内的整个身体区域的总生物发光进行量化。每天监测小鼠并用一氧化碳处死2当他们表现出晚期疾病的迹象，包括后肢瘫痪、无法进食或饮水和/或垂死时，会出现窒息。所有动物实验均由圣裘德儿童研究医院动物护理和使用委员会批准。

进行药效学（PD）研究以确定体内帕诺司他治疗对BRCA1、CHK1和RAD51的影响。当生物发光达到1.5×10时7p/s/cm（磅/秒/厘米）2/sr，注射U937细胞后第17天，小鼠接受帕诺司他（5mg/kg，每天一次×2）。在处死第二剂量小鼠4小时后，采集骨髓，并将速冻颗粒储存在−80°C下。用苏木精-伊红染色法测定骨髓中白血病细胞浸润率。

染色质免疫沉淀分析

如前所述进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析[42]使用或不使用10 nM帕诺司他治疗THP-1细胞48小时。使用抗-E2F1抗体（sc-193x）或正常兔IgG（sc-2027，Santa Cruz Biotechnology）进行免疫沉淀。中E2F1结合区的实时PCRBRCA1、CHK1或RAD51启动子使用中列出的引物表S2.

统计分析

采用配对双样本t检验比较阿糖胞苷/DNR和帕诺司他治疗（单独或联合治疗）和未治疗细胞之间的细胞凋亡差异和转录水平差异。采用Kaplan-Meier方法估计生存概率。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。所有条形图上的误差条代表平均值的标准误差。

结果

Panobinostat抑制AML细胞系和诊断性母细胞中BRCA1、CHK1和RAD51的表达

为了验证我们的假设，即HDACIs抑制AML细胞中关键DDR基因的表达，我们使用0–40 nM帕诺司他治疗THP-1细胞48小时，并测定各种DDR基因蛋白和转录水平。治疗导致组蛋白H4以剂量依赖性的方式发生超乙酰化，而对组蛋白总H4水平没有影响。最高剂量的治疗也会导致α-管蛋白的超乙酰化(图1A). Panobinostat以剂量依赖性方式抑制BRCA1、CHK1和RAD51(图1A)伴随着相应基因转录物的剂量依赖性下调（通过实时RT-PCR），提示可能的转录机制(图1B). 这与凋亡的剂量依赖性诱导以及caspase 3和PARP的裂解有关(图1C&D). 相反，其他关键DDR蛋白，如MRE11、RAD50、53BP1、ATM、ATR、Ku70和CHK2，没有改变（数据未显示）。Panobinostat抑制BRCA1、CHK1和RAD51的表达，并在10 nM时诱导最小的细胞凋亡(图1A和C). 时间进程实验表明，10 nM帕诺司他需要36–48小时才能最大限度地抑制巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51(图1E和F). 剂量依赖性抑制巴西航空公司1,CHK1型、和雷达51在CTS、U937和OCI-AML3 AML细胞系中也检测到转录和蛋白表达(图1G和I–K，BRCA1在U937细胞中几乎检测不到，因此药物效应很难解释）。伴随着剂量依赖性的凋亡诱导(图1H).

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泛双歧杆菌抑制巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51蛋白和转录物的表达并诱导AML细胞凋亡。

用不同浓度的帕诺司他处理THP-1细胞48小时。用Western blotting检测全细胞裂解物(面板A和D). 分离总RNA，并通过实时RT-PCR测定mRNA水平(面板B). 通过annexin V/PI染色和流式细胞仪分析确定凋亡事件(面板C). 蛋白质和mRNA水平巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51通过Western blotting测定基因(面板E)和实时PCR(面板F)分别在用10 nM帕诺司他处理48小时的THP-1细胞中，用可变浓度的帕诺司特处理CTS、OCI-AML3或U937 AML细胞48小时。对全细胞裂解液进行Western blotting，以测量细胞中BRCA1、CHK1和RAD51的蛋白水平(面板G). 通过流式细胞术和膜联蛋白V/PI染色测定帕诺司他诱导的细胞凋亡水平(面板H). 的成绩单级别巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51基因由实时RT-PCR测定(面板I–K).

为了进一步证实这些结果，我们用不同剂量的帕诺司他治疗了9例AML急变诊断样本。降低的转录水平巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51实时RT-PCR检测基因。这伴随着剂量依赖性生长停滞，由MTT分析确定(表1). 总之，这些结果表明帕诺司他抑制巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51AML细胞系中的基因，并降低诊断性AML急变的转录水平。

表1

帕诺司他治疗对大鼠脑组织转录水平的影响巴西航空公司1,CHK1型、和雷达51诊断性急性髓细胞白血病的基因。
病人变阻器帕诺司他治疗后的相对转录物（0–40 nM，48小时）
样品集成电路50（毫微米） 巴西航空公司1 CHK1号机组 雷达51
010204001020400102040
A30074型57.81.04±0.161.09±0.070.47±0.040.03±0.011.02±0.121.30±0.100.76±0.040.08±0.011.04±0.151.11±0.130.57±0.070.06±0.00
A30310型98.41.01±0.060.32±0.020.37±0.060.17±0.021.03±0.110.36±0.030.43±0.050.20±0.021.04±0.170.29±0.030.38±0.050.24±0.03
A30320型61.31.02±0.100.12±0.020.11±0.040.03±0.011.01±0.080.11±0.020.05±0.020.05±0.011.03±0.140.11±0.020.05±0.010.03±0.00
A30321型34.11.04±0.160.16±0.020.09±0.010.03±0.011.02±0.120.20±0.020.16±0.010.05±0.021.06±0.200.12±0.010.11±0.010.02±0.01
A30322型38.11.02±0.090.73±0.150.55±0.050.13±0.031.01±0.100.76±0.110.59±0.110.13±0.021.02±0.110.94±0.260.62±0.130.11±0.03
A30323型41.21.01±0.100.53±0.070.25±0.040.11±0.011.02±0.110.73±0.110.49±0.030.31±0.021.06±0.210.75±0.160.32±0.020.21±0.03
A30326型55.51.01±0.060.51±0.030.19±0.020.04±0.011.01±0.090.65±0.040.22±0.030.09±0.011.02±0.110.71±0.100.25±0.040.13±0.01
A30329型101.02±0.120.11±0.020.04±0.010.02±0.011.03±0.150.11±0.010.06±0.010.03±0.011.05±0.200.10±0.020.04±0.010.03±0.01
A30338型46.71.00±0.050.50±0.090.29±0.050.10±0.031.01±0.100.55±0.060.40±0.070.19±0.051.03±0.150.53±0.110.44±0.070.09±0.03
注：成绩单级别巴西航空公司1,CHK1型、和雷达51通过实时RT-PCR对帕诺司他治疗和未治疗的细胞进行定量，并将其归一化为RPL13A型结果表示为相对于未处理细胞的三个独立实验的平均值（设为1）。

Panobinostat与阿糖胞苷或DNR协同诱导AML细胞DNA DSB和凋亡

然后，通过对THP-1或OCI-AML3细胞进行48小时的处理，研究了帕诺司他对阿糖胞苷或DNR诱导的DNA DSB、细胞周期进展和凋亡的影响(图2A-D). THP-1细胞系的代表性点图可以在图S1A–F。阿糖胞苷和帕诺司他联合治疗可协同诱导THP-1和OCI-AML3细胞凋亡，协同指数分别为0.87和0.55。DNR和帕诺司他还协同诱导THP-1和OCI-AML3细胞凋亡，协同指数分别为0.63和0.67。与单独用阿糖胞苷或柔红霉素处理的细胞相比，联合处理的THP-1和OCI-AML3细胞BRCA1、CHK1和RAD51的蛋白水平降低。CHK1的下调降低了通路的激活，CDC25C磷酸化的降低反映了这一点（Ser 216，图2C和D). 重要的是，帕诺司他显著增强了阿糖胞苷或DNR诱导的DNA双链抗体，如γH2AX的诱导所反映的，γH2AX是一种DNA双链蛋白的既定生物标记物[46](图2C和D). 在U937细胞中获得了基本相同的结果(图S2A&C). 虽然CTS细胞在帕诺司他和阿糖胞苷的协同诱导下没有表现出相同的凋亡诱导作用，但DNR和帕诺司他确实表现出协同诱导作用(图S2B&D).

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Panobinostat与阿糖胞苷或DNR协同诱导DNA DSB和凋亡，并消除阿糖胞嘧啶或DNR在THP-1和OCI-AML3 AML细胞中诱导的S和/或G2/M细胞周期检查点激活。

用阿糖胞苷或DNR单独或与帕诺司他联合处理THP-1或OCI-AML3细胞48小时。通过annexin V/PI染色和流式细胞术分析测定细胞早期和晚期凋亡事件(面板A和B). 对全细胞裂解物进行Western印迹(面板C和D). 通过PI染色和流式细胞仪分析确定细胞周期分布(面板E&F)**表示p<0.005。

单用Panobinostat治疗导致THP-1和OCI-AML3细胞G0/G1期阻滞。阿糖胞苷治疗导致两种细胞系的S和G2/M阻滞，随着帕诺司他的加入而降低。DNR治疗导致G2/M期停搏，与帕诺司他联合用药可降低停搏率(图2E&F). THP-1细胞系的代表性直方图见图S1G–L。用帕诺司他和阿糖胞苷或DNR处理的U937细胞和用帕诺司他和DNR处理过的CTS细胞也得到了类似的结果(图S2E&F). 然而，与单独使用阿糖胞苷相比，使用阿糖胞苷和帕诺司他处理的CTS细胞导致S和G2/M增加，这与适度增强的细胞凋亡相似(图S2F). 这些结果表明，帕诺司他和阿糖胞苷或DNR协同诱导AML细胞凋亡需要至少部分取消S和/或G2/M细胞周期检查点。

BRCA1、CHK1和RAD51在DNA DSB和阿糖胞苷或DNR诱导AML细胞凋亡中的作用

为了直接证明BRCA1、CHK1和RAD51对阿糖胞苷或DNR与帕诺司他联合抗白血病活性至关重要，在THP-1细胞中对每个基因进行慢病毒shRNA敲除。巴西航空公司1shRNA敲除细胞（指定巴西航空公司1-与对照细胞（NTC-shRNA，图3A). 在细胞中检测到基础和阿糖胞苷、DNR-或帕诺司他诱导的凋亡显著增加巴西航空公司1-shRNA细胞与NTC-shRNA细胞的比较(图3D). 此外，shRNA敲除巴西航空公司1帕诺司他对阿糖胞苷诱导的细胞凋亡的增强作用几乎完全消失，但其对DNR的影响却不太明显(图3D). shRNA敲除巴西航空公司1部分废除阿糖胞苷诱导的S检查点和DNR诱导的G2/M检查点(图S3A&B). shRNA敲除雷达51与NTC-shRNA对照细胞相比，DNA DSB增加(图3B). 它还显示DNR诱导的凋亡增强，而对基础和阿糖胞苷诱导的凋亡以及阿糖胞嘧啶或DNR诱导S或G2/M检查点没有影响(图3B和D,S3C&D公司). 这个CHK1号机组shRNA敲除导致基础和阿糖胞苷或DNR诱导的细胞凋亡显著增加，DSB显著增加，S和G2/M检查点取消(图3C&D,S3E和F). 另一方面，CHK1的异位过度表达导致帕诺司他单独或与阿糖胞苷或DNR联用诱导的细胞凋亡显著降低，但对阿糖胞嘧啶或DNR单独诱导的凋亡没有影响(图S4A和B). 这伴随着帕诺司他对体外表达的CHK1蛋白的有效性丧失(图S4C&D). 这些结果提供了强有力的证据，证明BRCA1和CHK1，以及在较小程度上RAD51，是联合帕诺司他和阿糖胞苷或DNR在AML细胞中协同抗白血病活性的关键介体。

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BRCA1、CHK1和RAD51在阿糖胞苷或DNR诱导的THP-1细胞DNA DSBs和凋亡中的作用。

THP-1细胞感染BRCA1、CHK1、RAD51或非靶向控制（NTC）shRNA慢病毒过夜，清洗，然后用4µM阿糖胞苷或25 nM DNR处理48小时。通过Western blotting检测BRCA1，CHK1或RAD51的shRNA敲除，以及阿糖胞嘧啶或DNR对γH2AX的诱导(面板A–C). 车道标题表示处理条件“Control”“Ara-C”或“DNR”，+或–表示样品来源的shRNA-处理细胞。通过annexin V/PI染色和流式细胞术分析测定细胞中的凋亡事件(面板D). THP-1细胞感染BRCA1、CHK1或RAD51 shRNA慢病毒过夜。用完全培养基冲洗细胞三次，并在无病毒完全培养基中培养72小时。然后用50µM阿糖胞苷或2µM DNR处理细胞3小时，洗去药物，并在无毒完全培养基培养细胞8小时。通过COMET分析评估DNA损伤。显示了8小时时间点的典型图像(面板E). 显示了至少三种重复凝胶的尾部DNA的中位数百分比加上或减去平均值的标准误差（图F）*表示p<0.05。

为了证实BRCA1、CHK1或RAD51敲除对阿糖胞苷治疗后的DNA损伤有影响，用50µM阿糖胞嘧啶处理shRNA敲除细胞3小时，然后进行洗脱。然后在冲洗后0、4和8小时使用彗星试验直接测量DNA损伤。如图所示图3E&F与NTC-shRNA细胞相比，BRCA1和CHK1-shRNA细胞在4小时时具有更高的损伤水平。与NTC-shRNA细胞相比，BRCA1-、CHK1-和RAD51-shRNA细胞在8小时时都有更高的损伤。

Panobinostat联合阿糖胞苷在AML异种移植模型中的抗肿瘤活性

在植入U937细胞的NSG小鼠中评估阿糖胞苷和帕诺司他单独或联合使用与载体治疗对照组相比的抗白血病活性。生物发光成像监测肿瘤植入和进展的差异(图4A)和定量生物光子成像分析(图4C)计算了白血病死亡的发生率(图4D). 帕诺司他治疗后，在白血病细胞浸润≥60%的骨髓样本中观察到RAD51和CHK1蛋白表达下调(图4B). BRCA1在这些样本中的表达几乎检测不到(图4B)类似于在体外研究(图1G).

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在U937异种移植模型中，单用帕诺司他、单用阿糖胞苷以及帕诺司他加阿糖胞嘧啶的抗白血病活性。

NOD-SCID-IL2Rγ无效的（NSG）小鼠注射荧光素酶标记的U937细胞，3天后用帕诺司他（5 mg/kg，每日一次，共3周）、阿糖胞苷（6.25 mg/kg；每日一次；共4周）或联合用药（帕诺司他5 mg/kg、每日一次、共3周；再加上阿糖胞嘧啶6.25 mg/kg，每天一次，为期4周）治疗。代表性小鼠单用帕诺司他（n=8）、单用阿糖胞苷（n=10）或帕诺司他加阿糖胞嘧啶（n=9）的系列生物发光图像(面板A). 当生物发光达到1.5×10时7p/s/cm（磅/秒/厘米）2/sr，注射U937细胞后第17天，小鼠接受帕诺司他（5 mg/kg，每日一次×2）。第二次给药4小时后处死小鼠并采集骨髓。将颗粒溶解并进行Western Blot(面板B). 通过定量生物光子成像分析监测对照组和治疗组的肿瘤进展(面板C). 用Kaplan–Meier方法估计的总生存概率图(面板D).

溶媒或帕诺司他治疗的小鼠因白血病进展导致的死亡相似（分别为20天和22天）。根据以前的研究，通过评估生物发光信号中位数的增加来量化肿瘤进展[45]在第18天，与载体对照组相比，阿糖胞苷治疗的小鼠的肿瘤进展具有统计学意义的延迟（阿糖胞甙单独治疗组与对照组，中位数=7.62×105光子/s/cm2/sr与控制=1.54×107光子/s/cm2/sr，p=0.002）。到第32天，与阿糖胞苷相比，帕诺司他丁每日联合阿糖胞甙治疗的小鼠的肿瘤进展情况存在显著差异5光子/s/cm2/sr与阿糖胞苷=9.19×106光子/s/cm2/sr，p=0.0078）。通过配对比较，与单用阿糖胞苷（p=0.0001）、单用帕诺司他（p=0.002）和对照组（p<0.0001）（帕诺司他加阿糖胞甙，中位生存期=44天；单用阿糖胞苷，中位生存期=37天；panobinostat，中位生存期=22天；对照组中位生存期=20天；表S3).

E2F1是Panobinostat抑制AML细胞BRCA1、CHK1和RAD51表达的关键介体

为了了解panobinostat抑制BRCA1、CHK1和RAD51表达的分子机制BRCA1、CHK1，和雷达51药物治疗48小时后在THP-1细胞中测定。Panobinostat处理的细胞独立于阿糖胞苷或DNR降低了这些基因的转录水平，而阿糖胞嘧啶或DNR单独对这些基因的翻译水平几乎没有影响(图5A). 这些结果表明帕诺司他抑制巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51AML细胞中的基因。

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E2F1是帕诺司他抑制THP-1细胞BRAC1、CHK1和RAD51的关键介质。

用阿糖胞苷或DNR单独或与帕诺司他联合治疗THP-1细胞48小时巴西航空公司1,CHK1号机组,RAD51、，和E2F1系列基因由实时RT-PCR测定(面板A&C). 对全细胞裂解物进行Western印迹并用E2F1抗体进行检测(面板B).体内E2F1与位于巴西航空公司1,CHK1号机组，或雷达51如“材料和方法”中所述，使用实时PCR，通过ChIP分析测定启动子，其中包括或不包括10 nM帕诺司他治疗48小时(面板D). 用E2F1或非靶控（NTC）shRNA慢病毒感染THP-1细胞过夜，洗涤并培养72小时。通过Western blotting检测E2F1的shRNA敲除(面板E)和实时RT-PCR(面板F). E2F1基因敲除对转录水平的影响巴西航空公司1,CHK1型，或雷达51通过实时RT-PCR测定(面板F). *表示p<0.05，**表示p<0.005，***表示p<00005。

基于E2F1在DDR和转录调控中的作用BRCA1、CHK1、，和雷达51 [47]——[50]，我们假设E2F1是帕诺司他抑制这些基因的关键介质。用阿糖胞苷或DNR处理THP-1细胞导致E2F1蛋白水平升高，E2F1转录水平略有下降。帕诺司他抑制E2F1蛋白和转录物的表达，与阿糖胞苷或DNR无关(图5B&C). 伴随着E2F1与巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51通过ChIP分析确定(图5D). 这些结果有力地表明帕诺司他抑制了BRCA1、CHK1、，和雷达51通过调节E2F1转录因子。

为了提供E2F1调节AML细胞中这些基因转录的直接证据，我们对THP-1细胞中E2F1进行shRNA敲除(图5E&F). 敲除E2F1导致转录水平显著降低BRCA1、CHK1、，和雷达51这些结果提供了令人信服的证据，证明帕诺司他抑制BRCA1，CHK1、和雷达51通过转录下调E2F1的表达。

讨论

在以前的研究中，我们证明VPA与阿糖胞苷或氯法拉宾联合应用在儿童AML中具有协同抗白血病活性，并伴有DNA DSB的协同诱导和凋亡[26],[51]在AML细胞中与阿糖胞苷合用时，这一观察结果也得到了其他HDACI的证实，如帕诺比诺[27]然而，DNA DSB协同诱导和凋亡的分子机制尚不清楚。不同HDACI增强阿糖胞苷诱导的DNA双链抗体的能力表明，这类药物可能在某种程度上影响DDR，以增强AML细胞中DNA损伤剂诱导的DNA单链抗体和凋亡。

为了测试这种可能性，我们测定了帕诺司他治疗对四种AML细胞系和九种儿童AML初诊诊断样本中关键DDR蛋白表达的影响。尽管在本研究中仅使用儿科样本是公认的弱点，在体外用帕诺司他对这些AML细胞进行孵育后，发现其蛋白和/或转录水平呈剂量依赖性下降巴西航空公司1,CHK1号机组、和雷达51基因(图1和表1)提示帕诺司他通过减少BRCA1、CHK1、，和雷达51转录水平。

与上述发现一致，帕诺司他降低BRCA1、CHK1和RAD51的表达，有效增强DNA DSB和凋亡，并消除四种AML细胞系中三种细胞（THP-1、U937和OCI-AML3，图2和S2A公司、C和E）。在CTS细胞中，在DNR和帕诺司他联合治疗中观察到这些变化(图S2B、D和F). 尽管在用帕诺司他和阿糖胞苷联合治疗后的CTS细胞中也观察到BRCA1、CHK1和RAD51蛋白表达的下调(图S2D)观察到更多的S和G2/M阻滞。据报道，存在CHK1依赖性S检查点通路，并与CHK1相关S检查点途径平行[52]这可能解释了尽管BRCA1和CHK1水平降低，但观察到的S检查点激活，以及帕诺司他对阿糖胞苷诱导的CTS细胞凋亡的适度增强。这些结果表明，帕诺司他增强阿糖胞苷或DNR的抗白血病活性依赖于消除阿糖胞嘧啶或DNR诱导的S和/或G2/M细胞周期检查点。

我们的BRCA1，CHK1、和雷达51THP-1细胞中shRNA的敲除结果提供了直接证据，证明这些蛋白在阿糖胞苷或DNR诱导的DNA损伤中起着关键作用，我们的COMET实验证实了这一点(图3). 流式细胞术分析表明，BRCA1和CHK1是阿糖胞苷和DNR诱导AML细胞凋亡的关键决定因素，单药治疗后敲除细胞的凋亡增强表明，而RAD51敲除的作用似乎是DNR特异性的，因为它只增强DNR诱导的凋亡(图3). 有趣的是，BRCA1和CHK1，而不是RAD51，都参与了阿糖胞苷或DNR诱导的S和/或G2/M检查点(图S3). 这些结果与panobinostat和阿糖胞苷或DNR联合治疗一致，并有力地证明了panobinotat抑制DDR是一种新的关键分子机制，其基础是panobinostan与阿糖胞嘧啶或DNR联用协同诱导DNA DSB和凋亡。CHK1在帕诺司他、阿糖胞苷或DNR联合抗白血病活性中的作用通过在THP-1细胞中的体外表达得到进一步证实(图S4).体内NSG小鼠研究表明，帕诺司他治疗后CHK1和RAD51水平降低。此外，与单独使用阿糖胞苷或帕诺司他丁治疗相比，帕诺司他汀和阿糖胞甙联合治疗荷瘤NSG小鼠可显著延缓肿瘤生长并显著提高生存率(图4和表S3).

我们额外研究的结果表明，帕诺比司他通过转录机制抑制BRCA1、CHK1和RAD51的表达，其中E2F1起着关键作用(图5)然而，不能完全排除转录后机制。目前正在研究帕诺司他调节AML细胞E2F1表达的分子机制。

根据我们自己的结果和之前报告的结果[30]，我们提出了HDACI和DNA损伤剂协同诱导AML细胞凋亡的分子机制模型(图6). HDACIs抑制E2F1的表达，导致E2F1与BRCA1、CHK1、，和雷达51启动子和降低这些基因的转录。这将导致DNA损伤化疗药物（如阿糖胞苷或DNR）诱导的DNA DSB修复减弱，从而增强细胞凋亡。同时，BRCA1和CHK1的下调将导致细胞周期检查点（S和/或G2/M）的取消，从而迫使携带DNA损伤的细胞在细胞周期中进展并发生凋亡。

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HDACIs和DNA损伤剂协同诱导AML细胞凋亡的分子机制模型。

HDACI抑制转录因子基因的转录和蛋白质水平E2F1系列，导致BRCA1、CHK1和RAD51的表达降低。BRCA1、CHK1和RAD51的表达减少将导致DNA损伤化疗药物（如阿糖胞苷或DNR）诱导的DNA DSB修复减弱，从而增强细胞凋亡。同时，HDACIs下调BRCA1和CHK1将导致DNA损伤剂诱导的细胞周期检查点激活（S和/或G2/M）被取消，从而迫使携带DNA损伤的细胞在细胞周期中进展并发生凋亡。

总之，我们的研究表明帕诺司他抑制BRCA1，CHK1、和RAD51体外试验和体内导致DNA损伤加剧，细胞周期检查点取消，阿糖胞苷或DNR诱导细胞凋亡增强。这些结果有力地支持了我们的假设，即HDACIs对DDR的抑制代表了这类药物抗白血病活性的一种新机制，以及它们与AML细胞中DNA损伤剂的协同作用。

支持信息

图S1

典型的Annexin V/PI点图和PI直方图。用阿糖胞苷或DNR处理THP-1细胞，单独与帕诺司他（pan）联合治疗48 h。通过annexin V/PI染色和流式细胞术检测凋亡事件。显示了一个实验的代表性点图；无药物管制(面板A)，10 nM变阻器(面板B)，4µM阿糖胞苷(面板C)，25 nM DNR(面板D)、阿糖胞苷加帕诺司他丁(面板E)，和DNR加全景仪(面板F). 剩余细胞固定在乙醇中，通过PI染色和流式细胞术分析确定细胞周期分布。显示了一个实验的代表性直方图；无药物管制(面板G)，10 nM泛比诺司他(面板H)，4µM阿糖胞苷(面板I)，25 nM DNR(面板J)、阿糖胞苷加帕诺司他丁(面板K)，和DNR加全景仪(面板L).

（PPTX）

图S2

Panobinostat与阿糖胞苷或DNR协同诱导DNA DSB和凋亡，并消除阿糖胞嘧啶或DNR在U937和CTS AML细胞中诱导的S和/或G2/M细胞周期检查点激活。用阿糖胞苷或DNR处理U937和CTS细胞，单独或与帕诺司他（10 nM）联合处理48 h。通过annexin V/PI染色和流式细胞术分析测定早期和晚期凋亡事件(面板A和B). 对全细胞裂解物进行蛋白质印迹(面板C和D). 通过PI染色和流式细胞仪分析确定细胞周期分布(面板E&F). ***表示p<0.0005。

（PPTX）

图S3

阿糖胞苷或柔红霉素处理后THP-1 BRCA1-、CHK1-和RAD51-shRNA敲除细胞的细胞周期分布。THP-1细胞感染BRCA1-、CHK1-、RAD51-或NTC-shRNA慢病毒过夜。用完全培养基洗涤细胞三次，并在无病毒完全培养基中培养长达72小时。然后用25 nM DNR或4µM ara-C处理细胞48小时。通过PI染色和流式细胞术分析确定细胞周期分布。

（PPTX）

图S4

CHK1的过度表达导致对帕诺司他产生耐药性，并显著减弱帕诺司他与DNR或阿糖胞苷（在较小程度上）THP-1细胞联合诱导的凋亡。用CHK1或RFP cDNA表达慢病毒感染THP-1细胞过夜。用短梗霉素筛选细胞，生成稳定的RFP克隆（指定THP-1/RFP细胞）或CHK1克隆（指定THP-1/CHK1细胞）。对THP-1/RFP或THP-1/CHK1的全细胞裂解物进行Western blotting（面板A). 将THP-1/RFP或THP-1/CHK1细胞分别用阿糖胞苷或DNR单独或联合帕诺司他治疗48小时。通过annexin V/PI染色和流式细胞术分析检测早期和晚期凋亡事件(面板B). 对全细胞裂解物进行Western blotting以测量γH2AX、CHK1或β-肌动蛋白(面板C和D).

（PPTX）

表S1

患者特征。

（文件）

表S2

E2F1 ChIP实时RT-PCR所用引物概述。

（文件）

表S3

阿糖胞苷和帕诺司他单独或联合治疗携带AML异种移植物的NSG小鼠的平均存活率。

（文件）

资金筹措表

本研究得到了芭芭拉·安·卡尔马诺斯癌症研究所启动基金的支持，美国癌症学会圣鲍德里克基金会（IRG#11-053-01-IRG）、赫里克基金会、中国国家自然科学基金会（NSFC 31271477和81200363）、国家癌症研究所白血病研究生命基金会（CA120772）的资助，Elana基金会、Justin’s Gift Charity、Buric家族、Sehn家族基金会和儿童癌症研究的Ring Screw Textron捐赠主席。裕廊集团是由国家癌症研究所T32 CA009531资助的一名学前实习生。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自PLOS ONE系列由提供多环芳烃