国家公社。作者手稿；PMC 2014年3月18日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：PMC3820160型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院517924
BDNF的Val66Met多态性改变原结构域结构诱导神经生长锥收缩
,1 ,2,5 ,2 ,1 ,1 ,三 ,1,*和4,*
阿古斯汀·阿纳斯塔西娅
1康奈尔大学威尔康奈尔医学院医学系，美国纽约州纽约市约克大道1300号，邮编：10065
凯特琳·戴哈德
2美国纽约州纽约市第一大道540号纽约大学医学院斯基尔贝尔研究所，邮编：10016
5英国南安普顿大学生物科学中心和生命科学研究所，南安普敦，SO17 1BJ，生命科学大厦85
摩西五世·赵
2美国纽约州纽约市第一大道540号纽约大学医学院斯基尔贝尔研究所，邮编：10016
内森·E·威尔
1康奈尔大学威尔康奈尔医学院医学系，美国纽约州纽约市约克大道1300号，邮编：10065
克里蒂·伊尔马迪
1康奈尔大学威尔康奈尔医学院医学系，美国纽约州纽约市约克大道1300号，邮编：10065
弗朗西斯·S·李
三康奈尔大学威尔康奈尔医学院精神病学系，地址：1300 York Avenue，New York，NY 10065，USA
芭芭拉·汉普斯特德
1康奈尔大学威尔康奈尔医学院医学系，美国纽约州纽约市约克大道1300号，邮编：10065
粘土支架
4康奈尔大学威尔康奈尔医学院生物化学系，美国纽约州纽约市约克大道1300号，邮编：10065
1康奈尔大学威尔康奈尔医学院医学系，美国纽约州纽约市约克大道1300号，邮编：10065
2美国纽约州纽约市第一大道540号纽约大学医学院斯基尔贝尔研究所，邮编：10016
三康奈尔大学威尔康奈尔医学院精神病学系，地址：1300 York Avenue，New York，NY 10065，USA
4康奈尔大学威尔康奈尔医学院生物化学系，地址：1300 York Avenue，New York，NY 10065，USA
5英国南安普顿大学生物科学中心和生命科学研究所，南安普敦，SO17 1BJ，生命科学大厦85
这篇文章已被更正。请参阅中的更正国家公社，第5卷，第3564页。
- 补充资料
1
GUID:54706753-CB4B-441E-BC63-0F41C4CB10EE
摘要
人脑源性神经营养因子中常见的单核苷酸多态性(BDNF公司)该基因导致BDNF前体区Val66Met替换。这种单核苷酸多态性与记忆改变和人类患抑郁症和焦虑症的风险增加有关。在这里，我们发现在海马体中检测到分离的BDNF前体，并且它可以以活动依赖性的方式从神经元中分泌。利用核磁共振波谱和圆二色性，我们发现前体蛋白是内在无序的，Val66Met取代引起结构变化。令人惊讶的是，应用Met66（而非Val66）BDNF前体蛋白可诱导海马神经元急性生长锥回缩和Rac活性降低。p75的表达NTR公司并且Met66前体蛋白与SorCS2受体的差异结合是实现这一效果所必需的。这些结果确定Met66前体蛋白是一种新的活性配体，可调节神经元形态。
人脑源性神经营养因子中常见的单核苷酸多态性（SNP）(BDNF公司)该基因与人类情节记忆异常、海马体积减少以及抑郁和焦虑障碍风险增加密切相关1-8这种SNP（rs6265）在超过25%的人群中被观察到（单核苷酸多态性数据库-国家生物技术信息中心，国家医学图书馆，2012），它导致196位处的鸟嘌呤核苷酸变为腺嘌呤（G196A），导致缬氨酸（Val）变为蛋氨酸（Met）密码子66处的替换（Val66Met）。
BDNF被翻译为前体蛋白（proBDNF），由N端前体蛋白和C端成熟域（mBDNF。Val66Met替代位点位于前体域内(补充图S1). ProBDNF可分别被反高尔基网络或分泌囊泡中的furin或proconvertase裂解9.mBDNF和proBDNF均可由神经元分泌10,11KCl诱导去极化后以活性依赖的方式10或电刺激11此外，组织型纤溶酶原激活剂（tPA）或选择性基质金属蛋白酶（MMPs）（包括MMP3、MMP7）产生的纤溶酶可以在细胞外裂解前BDNF12和MMP913释放mBDNF。分离的BDNF前结构域在前BDNF细胞内或细胞外蛋白水解后的命运尚不清楚。mBDNF结合原肌球蛋白相关激酶B（TrkB）受体，促进神经元存活、分化、神经发生和突触可塑性。啮齿动物mBDNF水平的轻微变化会导致海马功能和行为异常的改变。相反，未分离的前BDNF通过结合p75神经营养素受体（p75NTR公司)和sortilin（Vps10p域分拣受体家族成员）14有趣的是，最近的报告显示，proBDNF15以及未处理的神经生长因子（proNGF）16诱导培养神经元生长锥回缩。
迄今为止，在70多个被检测物种中，BDNF前体蛋白高度保守，缬氨酸位于或接近66位(补充图S1). 前结构域介导与sortilin的相互作用17，作为伴侣，将proBDNF的细胞内运输导向调节分泌途径。Met66-proBDNF变异体表现出与sortilin结合减少，细胞内转运改变，mBDNF活性依赖性分泌减少2,6,17,18此外，表达Met66 BDNF的敲除小鼠再现了人类多态性的许多特定表型特性6因此，Met66 BDNF介导中枢神经系统效应的拟议机制是间接的，通过减少mBDNF的活性依赖性释放导致突触可塑性改变。然而，BDNF前体的高序列保守性(补充图S1)Val66Met多态性最近在进化上的出现（仅存在于人类）促使我们询问分离的前体蛋白是否可以作为独立配体发挥作用。我们发现前体蛋白水平很高体内并以活动依赖的方式由神经元分泌。我们进一步考虑了Val66和Met66前体蛋白是否表现出不同的结构以激发不同的生物活性。
这里我们表明，Val66Met取代引起的结构变化赋予前体蛋白生物活性，因为只有Met66前体蛋白会剧烈改变神经元形态。最后，我们证明了前体蛋白通过与SorCS2的差异性相互作用发挥这一作用，SorCS1是与分拣素相关的Vps10p结构域分拣受体2。我们的研究结果表明，Met66前体蛋白活性是另一种机制，可能有助于增加SNP患者抑郁和焦虑障碍的发病率。
结果
BDNF前体蛋白在海马表达并分泌
海马体是学习和记忆的关键调节器，其神经回路的功能障碍是记忆障碍、抑郁和焦虑障碍发生的基础19为了确定BDNF前体蛋白是否会影响海马神经元的结构，我们首先检查了该前体蛋白在该脑区是否存在。分离前体蛋白的检测在体外和体内由于抗体敏感性低，在技术上具有挑战性。然而，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，戊二醛将蛋白质固定到转移膜上，并使用之前描述的BDNF前体蛋白特异性单克隆抗体10，有助于在小鼠海马体中检测到15.5kDa带(). 为了证明检测的特异性，我们观察到前体蛋白水平在Bdnf公司杂合的(Bdnf公司+/−)小鼠海马裂解物与野生型（WT）同卵鼠的比较(). 因为前体蛋白含有一个N-连接的糖基化位点(补充图S1)，我们对N-连接的糖基化进行了酶促去除，导致前体蛋白在12.3kDa的迁移，这与其氨基酸序列预测的分子量一致().
在高水平检测到BDNF前体体内（a）SDS-PAGE后戊二醛固定转移膜后，从小鼠海马检测BDNF前体蛋白（15.5kDa）。（b） 前驱体水平在年降低了一半Bdnf公司+/−与野生型动物（WT）相比，小鼠海马溶解。（c） 用N-聚糖酶（+Gly）处理海马裂解物使前结构域的分子量降至12.3kDa。（d） C57BL/6小鼠海马溶解物在胚胎第18天（E18）、出生后第0天和第5天（P0和P5）以及第1、2、3或9个月（M）的BDNF前体蛋白水平。（e） （d）的量化。条形代表归一化为β微管蛋白的前体细胞密度测定数据的平均值±标准偏差。n=每组3个。（f） 大鼠海马BDNF前体蛋白水平的比较Bdnf公司有效/有效和Bdnf公司已见/已见P0、P5、1和2月龄小鼠。（g） （f）的量化。条形代表归一化为β微管蛋白的前体细胞密度测定数据的平均值±标准偏差。n=每组4个。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。
在胚胎晚期和出生后早期的小鼠发育过程中，C57BL/6小鼠海马中前结构域的表达可以忽略不计(). 然而，在出生后第5天（P5）检测到前体蛋白，其表达在1个月时显著增加，在成年小鼠（3-9个月）中稳定(). 在这两种野生型海马中都能检测到前体蛋白Bdnf公司有效/有效和Bdnf公司已见/已见击倒动物6然而，表达水平显著不同Bdnf公司已见/已见与对照组相比，小鼠的表达水平较低Bdnf公司有效/有效在所有研究的时间点(). 其他市售BDNF前体蛋白抗体（ANT-006，以色列耶路撒冷阿洛蒙）未能分离检测内源性前体蛋白，并且在检测重组前体蛋白时显示出极低的灵敏度(补充图S2).
为了确定前体蛋白是否分泌，我们在减少胶质细胞污染的条件下培养大鼠海马神经元，并收集第6天体外培养（DIV6）的条件培养基。培养基中检测到内源性前体蛋白，25mM KCl去极化6 h后前体蛋白水平显著升高(). 乳酸脱氢酶（LDH）检测表明，在这些培养条件下，用KCl去极化后，细胞没有明显释放（任意LDH释放单位：对照0.21±0.01；KCl 0.20±0.01）。用α-2抗纤溶酶和/或基质金属蛋白酶抑制剂II（抑制基质金属蛋白酶1、3、7和9）培养DIV3至DIV6的海马神经元，以防止分泌的前BDNF在细胞外分裂，并没有显著改变基础条件下或去极化后培养基中分泌的前体蛋白水平(). 酶去除N-连接糖基化导致内源性分泌前体蛋白的分子量从15.5kDa减少到预测的12.3kDa()如上所述，海马体中表达的前体蛋白。接下来，我们比较了从小鼠海马皮质培养物中获得的前体蛋白的活性依赖性分泌Bdnf公司有效/有效和Bdnf公司已见/已见击倒动物6我们发现在KCl去极化后，Val66和Met66前体蛋白都能分泌；然而，与Val66前结构域相比，分泌的Met66前结构域的水平显著降低(). 这些结果表明，在青春期和成年小鼠海马体中可以检测到前体蛋白，并且神经元会分泌前体蛋白。
BDNF前体蛋白由培养的神经元分泌。（a） 在第6天的介质中检测到前域在体外大鼠海马培养。用或不用α-2抗纤溶酶和/或MMP抑制剂II（MMP1、3、7和9抑制剂）处理培养物，以防止分泌型proBDNF的细胞外裂解。通过KCl去极化实现活性依赖性分泌。（b） （a）的量化。条形代表前驱体密度测定数据的平均值±标准偏差。n=每组3个。（c） N-聚糖酶处理降低了分泌的前体蛋白的分子量。（d） 在第6天的介质中检测到前域在体外来自E18幼崽的海马皮层神经元Bdnf公司已见面/+×Bdnf公司已见面/+老鼠乱丢垃圾。分泌的前体蛋白水平在Bdnf公司有效/有效和Bdnf公司已见/已见文化。（e） （d）的量化。条形代表前驱体密度测定数据的平均值±标准偏差。n=每组4个。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。
Val66Met替代改变BDNF前体结构
为了评估Val66和Met66前体蛋白是否存在结构差异，我们在大肠杆菌中生产了两种人类重组前体蛋白（残留23-113在补充图S1). 通过考马斯蓝和银染色检查重组前体蛋白的纯度(补充图S3a、b). 通过SDS-PAGE，前体蛋白在预测的10.2kDa分子量下迁移，使用特定前体蛋白抗体检测Val66和Met66前体蛋白没有差异(补充图S3c). 结构预测软件预测BDNF前体结构紊乱(补充图S4). BDNF前体蛋白中的这种预测性紊乱与proNGF-p75中相关神经生长因子（NGF）前体蛋白的缺失一致NTR公司晶格，表明缺乏有序结构20.
为了确定Val66Met多态性的结构效应，我们使用核磁共振（NMR）检测了Met66和Val66前体蛋白。这个1小时-15N异核相关谱表明，Val66和Met66前体蛋白是内在无序的，缺乏稳定的二级或三级结构(,补充图S5). Val66前体和Met66前体的二级化学位移分析表明，两者都主要是无序结构(补充图S6). 此外，在所用的核磁共振条件下，两个前体蛋白均为单体，没有显示出光谱性质（从2μM到450μM）发生齐聚或浓度依赖性变化的迹象。为了定义准确的Val66Met结构差异，我们生成了特定于序列的1小时/13C类/15使用已建立的三重共振核磁共振方法对Val66和Met66前体蛋白进行N异核核磁共振赋值21该技术将单个共振频率分配给前体序列中每个氨基酸中的特定原子（化学位移显示为和补充图S5a，b). 核磁共振化学位移提供了无序态中构象偏好的敏感指示。Val66前体和Met66前体的化学位移偏差比较表明，Val66Met取代位点附近的七个残基（E64、H65、I67、E68、E69、L70、L71）发生了显著变化(). 前体蛋白的主干化学位移存放在生物磁共振库中：Val66 ID编号：19358。Met66身份证号码：19357。
Val66Met替代对BDNF前体蛋白结构的影响。（a） Val66（蓝色）和Met66（红色）前体蛋白上异核单量子相干（HSQC）光谱的叠加。每个交叉峰（化学位移）对应于前体蛋白序列中的一个残基（每个共价键对的一个化学位移1小时-15N原子分配给前结构域序列内的特定酰胺）。Val66和Met66前体蛋白的完整HSQC光谱可在补充图S5前体蛋白的主干化学位移被保存在生物磁共振库中：Val66 ID编号：19358。Met66身份证号码：19357。（b） BDNF Val66和Met66前体蛋白之间的化学位移偏差（Δδ）表明，取代引起的变化局限于Val66Met取代位点附近的七个残基（E64、H65、I67、E68、E69、L70、L71）。显示窗口外残留量23-55和77-113的Δδ变化在0.007和0.0037 ppm之间。
Val66和Met66前体瞬时二级结构
我们使用二级结构倾向（SSP）评分，根据异核化学位移估计前体二级结构趋势22正SSP分数估计螺旋偏好区域，而负分数表示具有β结构倾向的残基。在Val66Met取代后，在位置66附近观察到构象从β链转变为螺旋构象(). 在取代区外，Val66和Met66前体SSP评分与以残基24、44、57和90为中心的瞬时螺旋区域以及出现相邻残基32、50、80、101和110的β结构一致(). 使用Talos+二级结构分析软件进行化学位移分析23显示出对Val66前体蛋白66位附近β链的强烈偏好。与Val66前体蛋白相比，Met66前体肽采用β链的倾向降低()与SSP得分分析一致。
Val66和Met66前体蛋白在瞬态二级结构上有所不同。（a） 使用主干获得的二级结构倾向（SSP）得分1H、，15N、，13C化学位移来自BDNF前体Val66（蓝色条）和Met66（红色条）。SSP得分确定了瞬态结构形成的区域（正值=α-螺旋，负值=β-片）。（b） （c）利用Val66（b）和Met66（c）前体的异核主链化学位移，通过TALOS+分析进行二级结构预测的图表。蓝色球体中的α-螺旋，红色方块中的β-链，绿色三角形中的无序。TALOS+分析显示，与Val66前体蛋白相比，Met66前体基因的β-片状倾向降低，结果与SSP评分一致。（d） 在10 mM NaH中收集的30μM Val66（蓝色）和Met66（红色）前体蛋白的紫外圆二色性（CD）光谱2人事军官4和23°C时pH 7.0的50mM NaCl。200 nm左右的负峰显示了两个前体蛋白的天然展开构象。然而，与Val66前体蛋白相比，Met66前体在222 nm处的低吸收与螺旋构象的增加趋势一致。每个频谱代表4次平均扫描，并仅归一化为缓冲区频谱。
为了用NMR无关技术证实SSP分析和Talos+结果，我们进行了圆二色性（CD）光谱分析。两种前体蛋白CD光谱在200 nm左右的负峰显示出主要的天然未折叠构象，而222 nm处CD强度的变化是螺旋倾向的特征(). 与Val66前体蛋白相比，Met66前体肽CD光谱在222 nm处显示出更负的吸收，与螺旋趋势增加一致()结果与SSP和Talos+数据一致。综上所述，核磁共振和CD分析均表明，Val66前体蛋白在66位附近的残基中具有增加的β结构倾向，而Met66前体肽显示出增加的螺旋倾向。
BDNF Met66前结构域诱导生长锥收缩
神经元网络的形成依赖于新生神经元过程的生长和收缩。突触网络组织的改变影响神经精神障碍的发生和发展19,24因此，我们使用生长锥收缩试验评估了Val66和Met66前体蛋白在介导海马神经元急性形态学变化中的生物活性16未经处理的前神经生长因子（proNGF）最近被鉴定为一种启动生长锥急性回缩的配体，这种作用由p75的表达介导NTR公司SorCS2是sortilin受体家族的成员16最近的一项研究表明，proBDNF还诱导生长锥回缩15，我们已经证实了这一影响(补充图S7a). 因此，我们检测了分离的BDNF前体蛋白是否可以诱导相同的效果。我们用重组Val66或Met66前体蛋白处理小鼠海马神经元。令人惊讶的是，Met66前体蛋白在20分钟的时间内诱导快速生长锥回缩，而Val66前体素处于非活性状态(). 这种效果是通过1毫摩尔（10ng/ml）浓度的Met66前体蛋白实现的。在50 ng/ml时，Val66前体蛋白也保持不活跃，没有显示明显的生长锥回缩(补充图S8). 与proNGF一样16和proBDNF15(补充图S7a)，Met66前体蛋白诱导的生长锥收缩效应仅限于p75NTR公司培养物中的阳性细胞().
Met66前体蛋白诱导培养海马神经元的生长锥回缩。（a） 用Val66或Met66前体蛋白（10 ng/ml）处理神经元20分钟，固定并染色肌动蛋白和p75NTR公司箭头表示收缩的生长锥；星号表示完整的生长锥。比例尺：20μm。（b） p75中生长锥回缩的量化NTR公司（a）中显示的阳性细胞，与p75相比NTR公司阴性细胞。Prodomain缩写为prod.（b）n=4个独立实验。条形图代表平均值±s.e.m。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。
Met66前体蛋白与SorCS2差异结合
先前的实验已经确定p75NTR公司和sortilin相互作用在细胞表面形成受体复合物25SorCS2促进p75的相互作用NTR公司下游信号蛋白促进生长锥回缩16在这些培养条件下，我们无法检测到菌毛蛋白，但SorCS2在p75中表达NTR公司阳性细胞16因此，我们测试了前结构域是否与SorCS2和p75相互作用NTR公司用免疫共沉淀法对表达前体蛋白的细胞进行分析。我们无法检测到前体蛋白与p75的相互作用NTR公司(). 然而，Met66和Val66前体蛋白都与SorCS2相互作用(). 通过定量分析，Met66前结构域比Val66前结构域更有效地与SorCS2相互作用(). 此外，我们用人重组SorCS2对Val66前体或Met66前体进行了核磁共振波谱分析，以确定前体蛋白与该受体的相互作用是否不同。与联合免疫沉淀结果一致，Val66和Met66前体蛋白都与SorCS2相互作用，如添加受体后前体蛋白中的化学位移扰动所检测到的(,补充图S9a、b). Val66和Met66前体蛋白的氨基酸34、38-40、51、53-54、76-77、80、96和100-111与SorCS2相互作用，如添加受体后的化学位移偏差所示(). 令人惊讶的是，Met66前体蛋白在残基65和71与SorCS2相互作用时显示出更大的化学位移变化，而Val66前体中的相同残基不与受体结合(，在*下）。这代表了Met66取代物赋予的前体蛋白中的一个新的相互作用区域。SorCS2结合后Met66前体蛋白中这些较大的化学位移变化可能反映了更紧密的相互作用或不同的结合构象。因此，尽管两个前体蛋白都与SorCS2相互作用，但相互作用是不同的，并且这种差异可能导致前体蛋白的不同活性。
Val66和Met66前体蛋白与SorCS2的结合方式不同，但不与p75结合NTR公司（a，b）用指示的构建物转染HEK293T细胞，用抗HA抗体免疫沉淀裂解产物，然后用指示的抗体检测。V=Val66前体蛋白和M=Met66前体结构。（a） 我们无法检测到两种前体蛋白与p75的相互作用NTR公司联合免疫沉淀法。4个独立实验的代表性印迹。（b） Val66和Met66前体蛋白均与SorCS2共同免疫沉淀，但Met66前体内的相互作用比（c）中定量的Val66多23%。（c） n=9个独立实验。条形代表平均值±标准误差。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。Val66和Met66前体蛋白与SorCS2（d）或p75的相互作用NTR公司（e） 也通过核磁共振波谱进行了评估。Δδ=Val66和Met66前体蛋白以及受体之间的化学位移偏差。在4.5μM下评估两种蛋白质的前结构域与SorCS2（d）的相互作用，并在600MHz下收集数据。与Val66前体蛋白相比，Met66前体在残基65和71（如#所示）与SorCS2相互作用时显示出更大的化学位移变化。前体蛋白与p75的相互作用NTR公司（e） 在6.6μM下评估两种蛋白质，并在800 MHz下收集数据。前体蛋白与p75的相互作用NTR公司核磁共振检测不到。计算所有分析的标准偏差（s.d.），并绘制相当于2 s.d.的阈值线，以显示所认为的相互作用的极限。
为了进一步证实Val66或Met66前体蛋白与SorCS2的关联，我们进行了扩散核磁共振测量。平移扩散的测量对水动力形状的变化非常敏感，水动力形状可能受到分子内构象和分子间缔合的变化的影响。前结构域（10.2kDa）与SorCS2的外结构域（113kDa）的结合将影响前结构域溶液的迁移率和表观水合半径。Val66和Met66前体蛋白的扩散速率为1.02×10−10米2秒−1和1.04×10−10米2秒−1分别是。添加SorCS2后，Val66的扩散D略有下降T型阀门66=0.99× 10−10米2秒−1而Met66显示扩散速率显著降低至DT型符合66=0.74 × 10−10米2秒−1相当于表观水动力体积的两倍以上(补充表S1). 这表明，与Val66前体蛋白相比，Met66前体与SorCS2的相互作用具有更大的时间范围，并证实Val66和Met66前体与SorCS 2的交互作用存在差异。
使用固有色氨酸荧光光谱法，我们无法检测到任何前体结合后SorCS2的显著结构变化。使用285nm处的色氨酸激发，以SorCS2作为对照，收集329nm处最大值的发射光谱。在SorCS2中添加Val66或Met66前体蛋白，在329nm处的发射最大值分别为对照的98.1%和97.1%。这与神经降压素结合后Sortilin缺乏结构变化一致26添加p75后，未观察到任何前体蛋白的显著化学位移变化NTR公司通过核磁共振(,补充图S9c，d)通过免疫共沉淀分析证实缺乏结合。与分离的前体蛋白相比，proBDNF能够与SorCS2和p75相互作用NTR公司联合免疫沉淀分析评估(补充图S7b).
Met66诱导的生长锥收缩需要SorCS2
由于前体蛋白与SorCS2相互作用，我们评估了SorCS1是否参与Met66前体蛋白诱导的生长锥回缩。为了解决这个问题，我们在添加配体之前，用针对SorCS2外结构域的功能阻断抗体预先培养海马培养物。抗体的添加并不影响神经元形态，但阻断了Met66前体蛋白诱导生长锥回缩的能力(). 对照IgG没有影响效果(). 此外，抗SorCS2抗体也阻断了proBDNF诱导生长锥回缩的能力(补充图S7a). 为了进一步证实SorCS2参与由Met66前结构域触发的生长锥收缩，我们用靶向SorCS2的表达慢病毒的小发夹RNA（shRNA）感染海马培养物。与sh-Scr感染相比，SorCS2 shRNA（sh-SorCS2）的表达导致SorCS1蛋白水平部分但显著降低(). 在没有配体添加的基础条件下，受扰shRNA的感染导致生长锥回缩增加(). 然而，在给予Met66前体蛋白后，shRNA诱导的SorCS2减少导致生长锥回缩减少，这一结果与功能阻断SorCS1抗体实验的效果一致。
需要Met66-SorCS2相互作用来诱导生长锥回缩。（a） SorCS2抗体能够阻止Met66前体蛋白诱导的生长锥回缩。用抗SorCS2（或对照IgG）预先培养神经元，用Val66或Met66前体蛋白（10 ng/ml）处理20分钟，然后进行生长锥回缩分析。p75中评估的量化NTR公司来自3个独立实验的阳性细胞。（b） 与未感染对照组或sh-Scr感染细胞相比，使用SorCS2 shRNA（sh-SorCS2）慢病毒感染击倒培养海马神经元后，显示SorCS1在培养海马神经元中的表达。（c） SorCS2 shRNA实现的SorCS1部分下调能够部分阻止Met66前体蛋白诱导的生长锥回缩。量化4个独立实验。（d） 只有Met66前结构域给药，而不是Val66，诱导培养的海马神经元Rac活性降低。海马神经元与Val66或Met66前体蛋白孵育20分钟，细胞裂解物与GST-PAK-CRIB珠孵育以分离激活的Rac（Rac-GTP）。（e） （d）的量化。活性Rac通过密度计测量，并归一化为输入中的总Rac。在4个独立实验中评估量化。条形代表平均值±标准误差。通过方差检验的单向分析进行统计比较。*p<0.05。
生长锥富含肌动蛋白丝状结构，如跛足纲和丝状足纲。这些肌动蛋白结构的动态伸缩受Rho GTPases家族成员调控，包括Rac27我们之前证明，proNGF诱导鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）Trio从p75中移位NTR公司和SorCS2，从而降低Rac的局部活性以诱导生长锥回缩16为了确定Val66前体、Met66前体或proBDNF是否导致SorCS2下游的差异信号传导，我们使用Rac效应器p21-活化激酶（PAK-CRIB）的Cdc42/Rac交互结合（CRIB。令人惊讶的是，Met66前体蛋白或前BDNF暴露导致培养海马神经元Rac活性显著下降，而Val66前体肽处理或未处理神经元的Rac活性没有影响(;补充图S7c).
结果强烈表明，Met66前体蛋白的螺旋偏好性有利于与SorCS2相互作用并诱导活性结合，这反映在Rac活性和生长锥回缩的下调上。相反，具有β结构倾向的Val66前体蛋白仍然不活跃。
讨论
我们发现变异体Met66前体蛋白在诱导生长锥回缩的同时，会剧烈改变神经元形态。从机械角度来看，我们表明，Val66Met取代诱导了围绕Val66Met取代的残基中的瞬态二级结构从β片转变为螺旋构象。这种转变通过与SorCS2的差异性相互作用赋予Met66前体蛋白生物活性，SorCS1是与分拣素相关的Vps10p域分拣受体2。此外，我们已经证明BDNF前体蛋白在高水平上可以检测到体内并且它是由培养的海马神经元以活性依赖的方式分泌的。
在以前的研究中，分离的BDNF前体未被检测到10众所周知，通过使用戊二醛将肽交联到转移膜，可以更有效地检测低分子量蛋白质28,29在SDS-PAGE和使用先前表征的前体蛋白特异性单克隆抗体后，将蛋白质戊二醛固定到转移膜上10，允许可靠地检测小鼠中枢神经系统中的前结构域。然而，我们不能排除固色剂促进抗原检索效果以揭开前体抗原表位的可能性。我们证实，如氨基酸序列所预测的那样，细胞内和分泌的前体蛋白都是N-连接糖基化的。此外，前体蛋白的发育产物与mBDNF的表达平行10,30,31.
海马前体蛋白的表达Bdnf公司已见/已见小鼠少于对照组Bdnf公司有效/有效小鼠，这与先前的一项研究一致，该研究报告称海马BDNF表达减少Bdnf公司大都会/大都会小鼠酶联免疫吸附试验32Val66Met多态性导致BDNF向分泌囊泡的转运减少，随后BDNF活性依赖性释放受损2,17,18前驱体蛋白水平下降的部分原因可能是传入输入到海马体（如皮层或皮层下区域）的运输和/或分泌减少。或者，先前报道Met66 BDNF转录物显示BDNF mRNA的树突运输减少33这可能导致海马局部翻译和分泌减少。我们不能排除以下可能性：Met66 proBDNF前体对其成熟的对应物和前体蛋白的裂解减少，或者Met66前体蛋白优先降解。尽管如此，我们还是能够在Bdnf公司已见/已见小鼠海马表明其可能发挥局部生物活性。
两种mBDNF34和proBDNF10,11以依赖活动的方式分泌。同样，这里我们证明神经元释放前体蛋白也受活动调节。在我们的培养条件下，使用α-2抗纤溶酶和多种基质金属蛋白酶抑制剂抑制分泌型前BDNF的细胞外裂解，并没有显著改变分泌型前体蛋白的水平，这表明大多数前BDNF-裂解为前体蛋白和mBDNF可能发生在细胞内。据报道，mBDNF的调节分泌受损Bdnf公司已见/已见神经元培养6与这些研究一致，我们发现与Val66前体蛋白相比，内源性Met66前体肽的活性依赖性释放显著降低。然而，无论分泌水平如何，都在培养基中检测到，这表明它们可能作为旁分泌或自分泌信号的配体。
利用核磁共振和CD光谱确定Val66和Met66前体蛋白具有内在无序的瞬态结构特征。我们检测到Val66Met取代区附近残基的特定构象变化，从Val66前体的β结构倾向到Met66的螺旋构象倾向。众所周知，局部结构的微小变化可以显著改变蛋白质的活性。这在内在紊乱蛋白质的情况下尤其如此，这些蛋白质在信号转导、抗原-抗体识别、细胞内运输和激素方面发挥着重要作用，在许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、朊病毒和额颞叶痴呆症中也发挥着重要的作用35,36例如，在α-突触核蛋白的A53T取代中观察到了与Val66Met取代类似的结构变化，这种结构变化与该蛋白聚集动力学和帕金森病毒性相关37Val66和Met66前体蛋白之间的结构变化影响了它们与SorCS2受体的相互作用，因为具有更多螺旋倾向的Met66在结合期间表现出更大的局部化学位移扰动。我们记录了Val66和Met66前体蛋白与SorCS2相互作用，但它们与NMR观察到的作用不同(). Met66前体蛋白的残基65-71与SorCS2相互作用，而Val66前体中的相同残基不与受体结合，这代表了Met66取代所赋予的前体蛋白中的一个新的相互作用区域。这种差异结合可以解释前体蛋白之间的不同生物活性，然而，其他差异，如差异聚集、前体蛋白的生物利用度、差异贩运或前体蛋白与未知因素的相互作用也可能起作用。这种差异性结合通过NMR扩散测量和共免疫沉淀实验得到证实，并且仅在将Met66添加到培养的神经元中后导致Rac失活。
神经元网络的发育、成熟和可塑性依赖于神经元过程的出现、路径发现和收缩。突触网络组织的改变影响神经精神障碍的发生和发展19,24,38最近发现ProNGF可激活p75NTR公司和SorCS2促进筋膜蛋白磷酸化及其与肌动蛋白丝的分离，导致神经突起回缩16ProBDNF还能够诱导生长锥收缩，如补充图S7a确认以前发表的研究15这里我们描述了Met66前体蛋白足以启动生长锥回缩。如NMR所示，Met66前结构域与SorCS2的结合不同，但与p75的结合不同NTR公司然而，Met66前体蛋白仅在p75中有效NTR公司表达细胞提示p75NTR公司在与SorCS2的复合物中起作用或位于SorCS1的下游。
原BDNF与SorCS2和p75相互作用NTR公司并诱导生长锥回缩。在本试验中，这可能有助于增强前BDNF的生物活性，而以不利方式与SorCS2结合的Val66前体是不活跃的。在出生后早期，海马体中存在前BDNF和加工产物（mBDNF与前体蛋白）。在成年期，mBDNF和前体蛋白是最丰富的形式，而proBDNF水平下降10由此我们可以推断，在出生后早期，前BDNF的作用可能占主导地位，但在成年期，前体蛋白的作用可能会占主导地位。
大多数生长因子都是作为前体合成的，前体蛋白被认为主要起到促进蛋白质折叠、细胞内分选或保护成熟结构域免受受体影响以限制生物利用度的作用39在这里，我们已经证明内源性BDNF前体蛋白在海马体中检测到，并以活动依赖性的方式从神经元中分泌。最重要的是，进化上最新的SNP导致前体蛋白中Val66Met的替代，促进海马神经元生长锥回缩，涉及p75NTR公司与非活性Val66前体蛋白相比，与SorCS2结合。Val66前体蛋白的功能尚待阐明，需要对成熟神经元网络进行进一步研究，以了解其他前体蛋白作用。
与Val66Met多态性相关的神经精神疾病相关的内表型与BDNF的分类和分泌减少有关，从而通过TrkB活化减少而损害神经元分化和可塑性32,33在这里，我们表明Met66前体蛋白是一种新发现的配体，它选择性地激活SorCS2以剧烈改变神经元形态，我们认为这种效应是导致SNP患者神经可塑性改变的另一种机制。
方法
动物
不同年龄的C57BL/6雄性小鼠（如图和标题所示）保持12小时的光/暗循环，并可自由获取水和食物。Val66Met敲除小鼠(Bdnf公司已见/已见)和野生型(Bdnf公司有效/有效)如前所述使用6简而言之，BDNF编码区被一个带有BDNF序列的靶向载体所取代，该序列带有或不带有点突变（G196A），该突变被引入以导致Val66Met替代。这些BDNF敲入等位基因由内源性BDNF启动子调控。杂合的Bdnf公司价值/市价将小鼠杂交以产生Bdnf公司有效/有效,Bdnf公司缬氨酸/蛋氨酸和Bdnf公司已见/已见以孟德尔速率繁殖后代。杂合的Bdnf公司+/−老鼠(Bdnf公司tm1日)从杰克逊实验室（美国ME州巴尔港）购买。Sprague-Dawley孕鼠和C57BL/6孕鼠分别购自Taconic Farms（美国纽约州哈德逊市）和Charles River（美国马萨诸塞州威明顿市）。动物护理符合康奈尔大学威尔医学院IACUC的要求。
SDS-PAGE和Western Blot
将解剖的海马或HEK293T（ATCC，Manassas，VA，USA）细胞在1%的triton X-100（Sigma，Saint-Louis，MO，USA，MO）、1%的nonide P-40（Roche，Indianapolis，in，US）、10%的甘油、pH 7.4的Tris缓冲盐水缓冲液中溶解，并添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma-）。蛋白质浓度由Bradford（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测定。对于脱糖基化，100μg裂解物或100μl条件培养基与1μl N-聚糖酶（ProZyme，San Leandro，CA，USA）在37℃下培养1h。在SDS–PAGE中运行裂解液或条件培养基，将蛋白质转移到0.45μm聚偏氟乙烯膜（PVDF）（Millipore，Billerica，MA，USA），除非另有说明，否则用2.5%戊二醛（Sigma）将膜固定在PBS pH 7.4中。在含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭后，将膜与前体抗体孵育10（mAb287，1:2000，在4C下12-16h，GeneCoppoemy，Rockville，MD，USA）、抗β微管蛋白（Sigma，1:15000，在20-25C下1h）或抗SorCS2（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA，1:1000，在4C下12-16h），然后是抗小鼠马萝卜过氧化物酶（HRP）二抗（前结构域为1:5000，或β微管蛋白为1:15000，在20-25C下1h，Calbiochem Millipore）或防滑HRP（SorCS2为1:5000，20-25℃下1h，Calbiochem-Millipore）。用增强化学发光法分析条带（Amersham-GE，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国），用图像J（1.45，NIH，Bethesda，MD，美国，http://rsbweb.nih.gov/ij/). 每个样本的定量标准化为β微管蛋白。全凝胶扫描见补充图S10.
海马培养用于前体瘤分泌分析
从E18 Sprague-Dawley大鼠胚胎中分离出初级海马神经元。用0.05%胰蛋白酶在37°C下分离神经元20分钟，然后用火焰抛光玻璃吸管研磨。在含有B27、1mM丙酮酸盐（Gibco）、2mM谷氨酰胺（Gibco-）和10mM 5-氟脱氧尿苷（Sigma）的神经基底培养基（美国纽约州格兰德岛Gibco市）中培养细胞，将细胞涂布在聚-D-赖氨酸（Sigma-）涂层培养皿上。从体外培养第3天到第6天，向培养物中添加α-2-抗纤溶酶（100μM，钙化酶-微孔）和/或MMP抑制剂II（10μM，钙化酶-多孔；MMP1 IC50=24nM，MMP3 IC50=18.4nM，MMP7 IC50=30nM，和MMP9 IC50=2.7nM）。收集第6天的体外培养基，并添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）。为了进行去极化实验，将25mM KCl添加到培养物中6 h。为了研究内源性Val66和Met66前体蛋白的分泌，我们培养了来自于Bdnf公司已见面/+x个Bdnf公司已见面/+垃圾。每只幼崽的解剖区域都被镀在不同的孔中，并按照描述进行基因分型6随后，按照上述大鼠海马培养的方法进行去极化和培养基的采集。
乳酸脱氢酶释放试验
从培养的DIV6神经元中采集条件培养液（50ul）（使用或不使用KCl去极化），并按照制造商的方案（CytolTox 96；美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）使用比色法分析LDH水平。
重组BDNF前体蛋白的表达与纯化
质粒pET28（美国威斯康星州麦迪逊诺瓦根）含有人BDNF前体Val66或Met66基因（氨基酸23至113前面有N末端His-tag和SUMO）40在BL21（DE3）pLysS活性细胞（美国纽约州格兰德岛Invitrogen）中转化。使用马利介质交换法生产蛋白质，用于同位素标记(15N和13C类/15N） 重组蛋白41使用镍树脂柱（Ni-NTA，Invitrogen）纯化原域样品。SUMO通过Ulp-1（His6标记）蛋白水解进行裂解。随后，在第二个镍树脂柱中对样品进行负面选择，在该柱中，在流动部分中获得了现在未标记的BDNF前体。使用丙酮沉淀所得蛋白质，再悬浮并在50mM NaH中透析2人事军官4pH值7.0。使用考马斯蓝和银染色法通过SDS-PAGE评估样品纯度(补充图S3). 使用水中的随机线圈紫外吸收率（ε(280)=4470万−1厘米−1)42，并使用Bradford方法进行确认。
核磁共振波谱
核磁共振样品在93%H中制备2O/7%D2O、 50 mM氢氧化钠2人事军官4100 mM NaCl pH 7.0，浓度从2μM到450μM不等。核磁共振谱是在威尔康奈尔医学院的Bruker Avance 500 MHz光谱仪、瓦里安INOVA 600 MHz光谱仪和纽约结构生物学中心的Bruke Avance 800 MHz光谱仪上获得的。600 MHz和800 MHz光谱仪配备了三重共振低温探头。500 MHz光谱仪配有BBO室温探头，NMR化学位移分配在7℃下进行。使用nmrPipe软件处理核磁共振数据43并使用Sparky进行分析44使用SSP根据观察到的化学位移进行二级结构预测22和TALOS+23程序。化学位移偏差：Δδ=[（Δδ1H）2+(0.153*Δδ15否）2]1/2，式中Δδ1H和Δδ15N是1H和15N化学位移变化，0.153是15N档换档。在4.5μM下评估前体蛋白与重组人SorCS2（R&D系统）的相互作用，并在600 MHz下收集数据。前体蛋白与人重组p75的相互作用NTR公司（R&D Systems）在6.6μM下评估两种蛋白质，并在800 MHz下收集数据。使用Topspin软件（Bruker Instruments 2.1版）处理和分析数据。使用标准的三维HNCO、HNCA、HN（CO）CA、HNCACB和CBCA（CO）NH共振异核实验实现了连续主干共振分配45.
核磁共振扩散测量
梯度扩散测量是使用BPP-LED脉冲序列获得的46在布鲁克Avance光谱仪中，温度为500 MHz，温度为25℃。样品均在体积收缩的Shigemi管中进行，在柱塞和管底部之间使用20mm的样品高度，以最大限度地减少对流伪影。使用32个梯度实验在298K下收集数据，z梯度强度从最大55.7 G/cm的2%线性增加到95%，同时在100 ms扩散期内保持恒定的6 ms梯度延迟。使用10mM二恶烷作为内标物校准流体动力半径47使用2.1版Bruker上旋软件对数据进行处理和分析。使用Stokes-Einstein方程D计算流体动力半径T型=kB类T（6πηR小时)−1其中DT型是平移扩散系数，kb条是玻尔兹曼常数，T是以开尔文为单位的温度，η是溶剂粘度，R小时是水动力半径，使用二恶烷作为内部参考，可以计算出半径R小时=（DT型二恶烷/天T型)R（右）小时二恶烷，假设R小时二极管= 2.12 Å.
内源性色氨酸荧光光谱
在20°C的PTI分光光度计（国际光子技术公司）上收集荧光数据，测量范围为305 nm至500 nm，增量为1 nm。在0.17μM浓度下，在50 mM Tris、100mM NaCl pH 7.0中使用SorCS2、Val66前体蛋白和Met66前体肽。
圆二色光谱法
CD光谱在Aviv 62DS（Aviv Associates，Lakewood，NJ，USA）圆二色分光光度计上获得，使用0.1cm路径长度的试管，在10mM NaH中含有30μM前体蛋白2人事军官450 mM NaCl pH 7.0。摩尔椭圆度[θ]的波长依赖性在23°C下监测，作为4次扫描的平均值，使用5秒的积分时间，波长增量为1.0 nm。光谱仅针对缓冲液进行基线校正。
生长锥回缩试验
从E15 C57BL/6小鼠胚胎中分离出初级海马神经元。用0.05%胰蛋白酶（Gibco）在37°C下分离神经元8分钟，然后用火焰抛光玻璃吸管研磨。细胞被镀在聚-D-赖氨酸（Sigma）涂层培养皿上，在含有B27（Gibco）和0.5 mM谷氨酰胺（Gibco-）的神经基底培养基（Gibco/）中生长。Val66 proBDNF是从HEK293FT细胞（ATCC）的上清液中收集的，该细胞转染了编码人类proBDNF（furin裂解位点突变：RR128AA）的构建物。通过western blot（使用来自Santa Cruz的BDNF抗体）与已知的重组BDNF浓度（PeproTech，新泽西州洛基希尔）进行比较，估算出了前BDNF的浓度。在实验中，我们在固定前20分钟向海马神经元中添加10或50 ng/ml的Val66前体蛋白、Met66前体肽或前BDNF。为了阻断SorCS2，我们在37°C下添加前体蛋白或前BDNF之前，用抗SorCS1（20μg/ml，研发系统）预先培养细胞或在冰上控制绵羊IgG 20分钟。DIV3神经元用冰镇甲醇固定10分钟。盖玻片用10%正常驴血清、2%牛血清白蛋白和0.25%鱼皮明胶在Tris缓冲盐水中封闭30分钟；与抗肌动蛋白孵育（1:10000，Sigma，克隆AC-74；抗p75NTR公司1:1000，研发系统；均在20-25°C下保持30分钟）；然后用二抗（抗山羊Alexa 488和抗小鼠Alexa 555，1:1000，Invitrogen）与Hoechst（1:10000）在20-25°C下混合30分钟；并安装Mowiol488（Calbiochem-Millipore）。用LSM 510激光扫描共聚焦显微镜（40×Plan Neofluor，数字孔径1.3 DIC油浸物镜，德国奥伯科钦卡尔蔡司）对细胞进行成像。使用LSM 510软件（卡尔蔡司）和Image J处理图像。
HEK293T细胞共免疫沉淀实验
HEK293T细胞（ATCC）在补充有10%胎牛血清（Gibco）和青霉素-链霉素的DMEM中生长。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）和Myc-tagged p75转染细胞NTR公司（Phil Barker博士馈赠的礼物）、Myc-tagged SorCS2和HA/Flag-tagged Val66前体蛋白、Met66前体肽（均由PCR以人类pcDNA3.1 proBDNF为模板生成）以及proBDNF-构建物。转染后48小时，细胞被裂解，蛋白质浓度由Bradford（Bio-Rad）测定。用蛋白A-琼脂糖（Sigma）预先清除裂解物，用HA抗体（Sigma）免疫沉淀，然后用蛋白A-琼脂糖树脂（Sigma）。SDS-PAGE后，将膜与Myc抗体（1:15000，20-25°C下1hr，Bethyl）孵育，然后与抗兔HRP二级抗体（1:150000，20-25℃下1hr、Calbiochem-Millipore）或HA.11抗体（1:10000，20-25癈下1hr）孵养然后是抗鼠HRP二级抗体（1:10000，20-25°C下1hr，Calbiochem-Millipore）。
慢病毒载体和转导
从Open Biosystems Thermo Scientific（Waltham，MA，USA）获得含有针对小鼠SorCS2的shRNA的慢病毒质粒（pLKO.1）（靶向序列：CGCTGAACTCTCATGAATCA）和加扰对照。使用TransIT-LT转染试剂（Mirus，Madison，WI，USA）将shRNA构建物与包装质粒pMD2.G和pCMV-dR8.9联合转染到HEK293-FT细胞中，从而包装慢病毒。24小时后更换培养基，转染48小时后收集培养基上清液。上清液通过0.45μm过滤器过滤，并用PEG-it离心造粒（System Biosciences，Mountain View，CA，USA）。将颗粒重新悬浮在神经基底细胞培养基（Gibco）中。DIV0感染小鼠初级海马神经元，第二天改变培养基。
Rac活性测定
如前所述进行Rac活性分析48简单地说，用Val66前体蛋白、Met66前体肽或前BDNF（10 ng/ml）刺激DIV2海马神经元20分钟，并在补充有10 mM MgCl2的裂解缓冲液中裂解细胞。将清除的裂解物与谷胱甘肽S-转移酶（GST）或GST-PAK-CRIB珠（每次反应20μg）在4C下培养30分钟。使用Rac1抗体（Millipore，克隆23A8）通过Western blot分析分离的活性Rac，并将其归一化为输入。GST和GST-PAK-CRIB蛋白在BL21（DE3）pLysS细胞（Invitrogen）中表达，然后与谷胱甘肽sepharose孵育。用考马斯蓝染色法分析重组蛋白的纯度。
致谢
这项工作得到了NIH（NS21072和HD23315到M.V.C.，NS052819到F.S.L.，NS030687和NS064114到B.L.H.和S10-RR023694-01EWOF到C.B.）以及K.D.人类前沿科学计划的支持。我们感谢Myc标记的p75NTR公司由Phil Barker博士（加拿大蒙特利尔麦吉尔大学）建造。我们感谢杨建民对手稿的有益讨论和修订。这项工作的一部分是在美国国家卫生研究院、凯克基金会和纽约州科学、技术和学术研究办公室支持的纽约结构生物学中心（NYSBC）进行的。我们感谢NYSBC员工的出色协助。
脚注
作者贡献：
A.A.对脑裂解物、原代培养细胞和转染的异种细胞进行了生化分析。A.A.和N.E.W.生成了构造。A.A.和C.B.合成并纯化了重组前体蛋白，并进行了圆二色性、荧光和核磁共振光谱分析。K.D.进行了生长锥回缩试验。KI产生SorCS2 shRNA慢病毒。A.A.、K.D.、M.V.C.、F.S.L.、B.L.H.和C.B.设计了实验并撰写了手稿。
竞争性财务利益声明：
提交人声明他们没有利益冲突。
工具书类
1Hajek T，Kopecek M，Hoschl C.脑源性神经营养因子Val66Met多态性健康携带者海马体积减少：荟萃分析。世界生物杂志。精神病学。2012;13:178–187. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Egan MF等。BDNF val66met多态性影响BDNF的活性依赖性分泌、人类记忆和海马功能。单元格。2003;112:257–269.[公共医学][谷歌学者] 三。Frielingsdorf H等。变异脑源性神经营养因子Val66Met内表型：创伤后应激障碍的意义。Ann N.Y.科学院。2010;1208:150–157. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Soliman F等人。一种遗传变异BDNF多态性改变了小鼠和人类的灭绝学习。科学。2010;327:863–866. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Verhagen M等人，《严重抑郁症患者BDNF-Val66Met多态性的荟萃分析：性别和种族的影响》。分子精神病学。2010;15:260–271.[公共医学][谷歌学者] 6.Chen ZY等。基因变体BDNF（Val66Met）多态性改变焦虑相关行为。科学。2006;314:140–143. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7.丁切娃一世，格拉特CE，李FS。BDNF-Val66Met多态性对认知的影响：行为遗传学的意义。神经科学家。2012 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Martinowich K，Manji H，Lu B.对BDNF在抑郁症和焦虑症中的作用的新见解。自然神经科学。2007;10:1089–1093.[公共医学][谷歌学者] 9Teng KK，Felice S，Kim T，Hempstead BL。理解前神经营养素的作用：最新进展和挑战。开发神经生物学。2010;70:350–359. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Nagappan G等。通过高频神经元活动控制ProBDNF的细胞外裂解。程序。国家。美国科学院。2009;106:1267–1272. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12.Lee R，Kermani P，Teng KK，Hempstead BL.分泌的前神经营养素对细胞存活的调节。科学。2001;294:1945–1948.[公共医学][谷歌学者] 13Mizoguchi H等人。基质金属蛋白酶-9通过将前BDNF转化为海马中成熟的BDNF，促进戊四氮治疗小鼠的点燃性癫痫发作发展。神经科学杂志。2011;31:12963–12971. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Teng HK等。ProBDNF通过激活p75NTR和sortilin的受体复合物诱导神经元凋亡。《神经科学杂志》。2005;25:5455–5463. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Sun Y等。ProBDNF通过激活RhoA抑制初级神经元的神经突起生长。公共科学图书馆。一个。2012;7：e35883。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Deinhardt K等。神经生长锥回缩依赖于通过Rac的前神经营养素受体信号。科学信号。2011;4：ra82。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Chen ZY，等。Sortilin控制脑源性神经营养因子向调节分泌途径的细胞内分选。神经科学杂志。2005;25:6156–6166. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Chen ZY，等。变异脑源性神经营养因子（BDNF）（Met66）改变神经分泌细胞和皮层神经元中野生型BDNF的细胞内转运和活性依赖性分泌。神经科学杂志。2004;24:4401–4411. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Price JL、Drevets WC。情绪障碍的神经回路。神经精神药理学。2010;35:192–216. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20冯德等。p75NTR和sortilin与proNGF结合的分子和结构见解。分子生物学杂志。2010;396:967–984. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Sattlera M，Schleucherb J，Griesinger C.利用脉冲场梯度测定溶液中蛋白质结构的异核多维核磁共振实验。核磁共振光谱研究进展。1999;34:93–158. [谷歌学者] 22Marsh JA、Singh VK、Jia Z、Forman-Kay JD。二级结构倾向对α-和γ-同核蛋白序列差异的敏感性：对纤颤的影响。蛋白质科学。2006;15:2795–2804. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23.Shen Y，Delaglio F，Cornilescu G，Bax A.TALOS+：一种从核磁共振化学位移预测蛋白质骨架扭转角的混合方法。生物分子杂志。核磁共振。2009;44:213–223. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Bassett DS，Bullmore ET。健康和疾病方面的人脑网络。货币。操作。神经醇。2009;22:340–347. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Nykjaer A等。Sortilin对proNGF诱导的神经细胞死亡至关重要。自然。2004;427:843–848.[公共医学][谷歌学者] 26Quistgaard EM等。配体在十叶β-螺旋桨结构域的隧道中与Sortilin结合。国家结构。分子生物学。2009;16:96–98.[公共医学][谷歌学者] 27Gonzalez-Billault C等人。小GTPases在神经元形态发生和极性中的作用。细胞骨架（霍博肯）2012;69:464–485.[公共医学][谷歌学者] 28Kurien BT，Scofield RH。其他著名蛋白质印迹检测方法的简要回顾。方法分子生物学。2009;536:557–571.[公共医学][谷歌学者] 29Karey KP，Sirbasku DA。戊二醛固定增加了转移到尼龙膜上的低分子量蛋白质（生长因子）的保留，以进行蛋白质印迹分析。分析。生物化学。1989;178:255–259.[公共医学][谷歌学者] 30Baquet ZC，Gorski JA，Jones KR。早期纹状体树突缺损，在缺乏顺行皮质脑源性神经营养因子的情况下，随着年龄的增长，神经元丢失。神经科学杂志。2004;24:4250–4258. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Kolbeck R、Bartke I、Eberle W、Barde YA。野生型和神经营养素基因突变小鼠神经系统中的脑源性神经营养因子水平。神经化学杂志。1999;72:1930–1938.[公共医学][谷歌学者] 32.Bath KG等，BDNF Val66Met损害氟西汀诱导的成年海马可塑性增强。神经精神药理学。2012 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Chiaruttini C等。BDNF mRNA的树突状贩运由转译蛋白介导，并被G196A（Val66Met）突变阻断。程序。国家。美国科学院。2009;106:16481–16486. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Goodman LJ等。海马神经元脑源性神经营养因子的调节释放和极化定位。分子细胞神经科学。1996;7:222–238.[公共医学][谷歌学者] 35Uversky VN、Oldfield CJ、Dunker AK。人类疾病中的内在无序蛋白质：引入D2概念。每年。生物物理版。2008;37:215–246.[公共医学][谷歌学者] 36.Tompa P.本质紊乱的蛋白质：10年回顾。生物化学趋势。科学。2012;37:509–516.[公共医学][谷歌学者] 37Bussell R，Jr.，Eliezer D.帕金森病相关突变体α-同核蛋白的残留结构和动力学。生物化学杂志。2001;276:45996–46003.[公共医学][谷歌学者] 38德维维迪·Y。自杀病理生理学中的脑源性神经营养因子。2012[公共医学][谷歌学者] 40Mossessova E，Lima CD。Ulp1-SUMO晶体结构和遗传分析揭示了保守的相互作用和酵母细胞生长所必需的调节元件。摩尔细胞。2000;5:865–876.[公共医学][谷歌学者] 41.Marley J，Lu M，Bracken C.重组蛋白的有效同位素标记方法。生物分子杂志。核磁共振。2001;20:71–75.[公共医学][谷歌学者] 42.Gill SC，von Hippel PH.从氨基酸序列数据计算蛋白质消光系数。分析。生物化学。1989;182:319–326.[公共医学][谷歌学者] 43Delaglio F等人，NMRPipe：一个基于UNIX管道的多维光谱处理系统。生物分子杂志。核磁共振。1995;6:277–293.[公共医学][谷歌学者] 44Goddard TD，Kneller DG。火花3。加利福尼亚大学；旧金山：2002年。[谷歌学者] 45Cao W，Bracken C，Kallenbach NR，Lu M.螺旋形成和52残留螺旋蛋白的未折叠状态。蛋白质科学。2004;13:177–189. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Wu DHC，A.D.，Johnson CS。结合双极梯度脉冲的改进扩散有序光谱实验。磁共振杂志，A辑。1995;115 [谷歌学者] 47Jones JAW，D.K.，Smith LJ，Dobson CM。通过核磁共振扩散测量表征蛋白质去折叠。《生物分子杂志》。核磁共振。1997;119 [谷歌学者] 48Neubrand VE、Thomas C、Schmidt S、Debant A、Schiavo G.Kidins220/ARMS通过与RhoGEF Trio的直接相互作用调节Rac1依赖性神经突起的生长。细胞科学杂志。2010;123:2111–2123.[公共医学][谷歌学者] 
