半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1介导的饮食诱导脂肪性肝炎中纤维生成的调节

细胞系与培养

从6周MCD饮食的C57BL/6小鼠中分离出原代小鼠肝细胞和总非实质细胞。将小鼠麻醉，用温热氧合Hanks（-）灌注肝脏，再灌注1mM EGTA和10mM HEPES，然后用每只小鼠含有10mg胶原酶的Williams E培养基。离心后收集肝细胞，用所得细胞悬液用Percoll梯度离心法收集非实质细胞总数。Caspase 1和IL-1β的表达通过western blot分析确定，详情如下。

组织病理学、免疫染色和血清分析

如前所述，禁食5小时后，在深度麻醉下采集血样和肝组织(26)。将肝组织固定在10%福尔马林中，并嵌入组织路径（宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific）。苏木精和曙红以及油红O染色的肝脏标本通过光学显微镜进行评估。按照制造商的说明，使用特定试剂盒进行肝甘油三酯测定（Pointe Scientific）。使用商业试剂盒（Sigma Diagnostics）进行血清丙氨酸氨基转移酶测定。由经验丰富的病理学家（BGP）以盲法对喂食MCD和CTL的动物的个体特征，包括脂肪变性程度、炎症和肿胀进行评估。根据NAFLD活动评分（NAS）对脂肪变性、炎症和气球膨胀进行评分(27).

肝caspase-1激活和细胞定位的评估

使用从Abcam购买的Caspase 1荧光测定试剂盒（cat.ab39412），使用200μg全肝蛋白测定Caspase l活性。使用标准DAB技术，用石蜡包埋的肝组织进行caspase 1的免疫组织化学。使用以下主要抗体：从Millipore购买的兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（猫06-503稀释1:80）。

细胞凋亡评估

制备组织切片（4μm），并按照制造商的说明进行末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记（TUNEL）分析(就地细胞死亡检测试剂盒；罗氏分子生物化学公司，德国曼海姆）。通过使用裂解的Caspase-3抗体（细胞信号）对活性Caspase 3进行免疫染色来量化Caspase激活。如前所述，通过在5个随机显微镜场（40倍）中计数TUNEL阳性或活性caspase 3阳性细胞的数量来量化肝切片中的肝细胞凋亡(12).

肝纤维化的测定

肝纤维化用天狼星红定量。直接红80和快速绿FCF（颜色指数42053）由Sigma-Aldrich提供。肝切片在室温下在黑暗中与含有0.1%固绿FCF和0.1%直接红的饱和苦味酸水溶液孵育2小时(26)。将染色的载玻片在流动蒸馏水下缓慢冲洗6分钟，脱水（每个步骤3分钟），装裱，并用光学显微镜检查。通过数字图像分析对红色胶原纤维进行定量，不包括血管。

免疫印迹和免疫沉淀分析

用购自Millipore的5μg兔抗caspase-1抗体（cat.06-503）免疫沉淀500μg总肝蛋白。使用30-40μg全肝裂解物、20μg肝细胞或非实质部分或免疫沉淀裂解物进行免疫印迹分析。全肝裂解物和肝细胞/非实质样品用12-15%SDS-PAGE进行分离，免疫沉淀的肝裂解物样品用从Invitrogen购买的4-20%梯度凝胶（cat.EC60285BOX）进行分离，转移到硝酸纤维素膜上，并用适当的一级抗体进行印迹。用过氧化物偶联二级抗体（稀释度1:10000（BIOSOURCE International，Camarillo，CA）培养膜，并使用化学发光底物（ECL，Amersham Biosciences）和柯达X-OMAT胶片（Eastman Kodak，Rochester，NY）观察结合抗体。使用以下主要抗体：从Millipore购买的兔抗Caspase 1（cat.06-503稀释度1:80），从Abcam购买的兔抗白细胞介素1β（cat.Ab9722，稀释度1:5000）；兔抗细胞凋亡相关斑点样蛋白，其含有半胱天冬氨酸募集结构域（ASC）（cat.ab64808稀释液1:1000），购自Abcam；从Abcam购买的兔抗α-平滑肌肌动蛋白（cat.ab5694稀释度1:500）。

实时PCR

使用RNeasy tissue Mini试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚，齐亚根）从肝组织中分离出总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）从1μg总RNA合成逆转录本（cDNA）。进行实时PCR定量。简言之，25μl的反应混合物包含：cDNA、Syber Green缓冲液、Gold Taq聚合酶、dNTP和终浓度为200μm的引物。用于定量PCR的引物序列如下：αSMA 5′-GTC CCA GAC ATC AGG GAG TAA和5′-TCG GAT TCA GCG TCA GGA；COL1A1 5′-CAA GAA CAG CAA CGA GTA CCG和GTC ACT GGT CAA CTC CAG CAC；转化生长因子-β5′-CTCCCTGGCTTCTAGTGC和5′-GCCTTGTGGAGAGGATCTGG；TNFα5′-CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CT和5′-GCT ACG TGG GCT ACA G；F4/80 5′-CCCAGTGTCTTACAGAGTG和5′-GTGCCAGAGGTGTGTGTCT；CD11c 5′-CTG GAT AGC CTT TCT TCT GCT G和5′-GCA CAC TGT GTC CGA ACT CA；ASC 5′CTT GTC AGG GGA TGA ACT CAA AA和5′GCC ATA CGA CTC CAG ATA GTA GC；Casp1 5′ACA AGG CAC GGG ACC TAT G和5′TCC CAG TCA GTC CTG GAA ATG；IL-1 5′GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC T和5′ATC TTT TGG GGT CCG TCA ACT；IL-18 5′GAC-TCT-TGC-GTC-AAC-TTC-AAG-G和5′CAG-GCT-GTT-TGT-CAA-CGA；CRP2 5′GCTACGGAAAG AAGTATGGACC和5′CTCAGTCAAGTTGTAGACTCC.18S核糖体RNA 5′-和ACG GAA GGG CAC CAG GA 5′-CAC CAC CCA CGG AAT CG用作内源性对照。在Mx3000P循环器（Stratagene）中进行RT-PCR：95°C 10 min，40个循环，在95°C下15 s，在60°C下30 s，在72°C下30s，然后在95°C下1min，在55°C下30ms，在95℃下30s。使用CT、ΔCT和ΔΔCT值，使用MxPro软件（Stratagene）计算对照样品的折叠变化。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的抑制与肝脏甘油三酯积聚和炎症活性之间的分离有关

在确定MCD喂养小鼠肝脏中存在炎症小体激活和caspase-1活性增加后，我们接下来利用caspase-1基因敲除小鼠研究caspase-2是否参与NASH的发育(Casp1型^−/−)。我们首先调查了Casp1型^−/−小鼠对肝脏脂肪变性和炎症具有抵抗力。将C57BL/6野生型Casp1基因敲除小鼠置于MCD饮食或对照（CTL）饮食中6周Casp1型^−/−小鼠在MCD饮食中的体重变化相似(图2A)。然而，H&E和油红O染色的显微镜检查显示Casp1^−/−与食用MCD饮食的WT小鼠相比，食用MCD食物的小鼠发生了更为显著的大泡状肝脂肪变性(图2B、C)。与这些结果一致，肝甘油三酯水平在Casp1型^−/−MCD饮食中小鼠与WT小鼠的比较(图2D)。对与NASH相关的其他个体特征的肝脏样本进行的组织学检查显示，炎症灶减少，导致Casp1型^−/−MCD饮食小鼠与WT饮食小鼠的比较(表1)。然而，两组小鼠的总NAFLD活性评分（NAS）相似，这主要是因为MCD-fed Casp1中脂肪变性程度较高以及肝细胞气球化程度较高^−/−老鼠(表1)。血清ALT水平在Casp1型^−/−与喂食对照饮食的动物相比，喂食MCD饮食的小鼠和WT小鼠(图2E)。接下来，我们在分子和细胞水平上检查了肝脏的炎症状态，发现喂食MCD的MCD-α、F4/80和CD11c的mRNA水平显著降低Casp1型^−/−小鼠与MCD饮食中的WT动物的比较(图2F、G、H).

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图2

在饮食诱导的脂肪性肝炎中，Caspase 1抑制与肝甘油三酯积累和炎症活动之间的分离有关

（A） 在第0周、第1周、第3周和第6周测量体重Casp1型^−/−喂食6周CTL或MCD饮食的小鼠（每组5-7只）。（B，C）肝组织H&E和油红O染色（ORO）的代表性图像显示了细胞损伤的严重程度，进一步通过：（D）肝甘油三酯（TG）（n=4-5）和（E）血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平（n=5-6）进行研究。（F） 肝组织中促炎细胞因子肿瘤坏死因子（TNFα）（n=3-4）、巨噬细胞标志物F4/80（n=6-8）和CD11c（n=4-5）的RT-PCR分析Casp1型^−/−小鼠与WT小鼠进行比较。结果表示为平均值±S.E.M.*P<0.05；**P＜0.01***与对照组相比，P<0.001。

通过不依赖于caspase 3激活和凋亡的caspase 1抑制，MCD饮食诱导的HSC激活和胶原沉积减少

caspase 1在肝细胞损伤和炎症信号传导中的关键作用的发现，这两个与HSC激活有关的事件，使我们进一步研究了caspase 1在MCD饮食诱导的纤维化和纤维化中的作用。然而，正如预期的那样，在MCD饮食六周后，野生型动物HSC活化和纤维化相关基因的mRNA表达显著增加，如TGFβ、αSMA、COL1A1和CRP2(图3A-D)。这些变化在Casp1型^−/−MCD喂养的小鼠。此外，在WT MCD喂养的小鼠中，αSMA蛋白表达增加，而在Casp1型^−/−MCD喂养小鼠(图3E、F)。更重要的是，与对照组动物相比，MCD饮食中的野生型动物的胶原蛋白沉积几乎增加了四倍，这一点可以通过肝组织天狼星红染色结合数字图像分析定量来证明(图3G，H)而胶原蛋白沉积的增加在Casp1型^−/−小鼠尽管仍高于CTL饮食中的小鼠(图3G，H)。接下来，我们量化了不同组小鼠中肝细胞死亡的数量。在WT动物和Casp1型^−/−MCD饮食小鼠与CTL饮食动物的比较(图4A–D).

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图3

饮食诱导脂肪性肝炎期间HSC活化和胶原沉积在Casp1型^−/−

（A-D）RT-PCR分析HSC激活标记物转化生长因子β（TGFβ）、I型胶原α1（COL1A1）、α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）、富含半胱氨酸和甘氨酸的蛋白2（CRP2）、肝组织中mRNA表达Casp1型^−/−小鼠与WT小鼠进行比较（每组n=5-7）。（E） WT和WT中全肝裂解物上αSMA的Western blotCasp1型^−/−喂食MCD的小鼠与喂食CTL的小鼠进行比较，（F）对HSC70进行相应的密度分析（n=3）。（G） 胶原纤维用天狼星红染色，（H）用每40x场面积染色的表面积进行量化（每组5～7个），不包括血管。结果表示为平均值±S.E.M.*P<0.05；**P<0.01***与对照组相比，P<0.001。

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图4

对MCD饮食诱导的小鼠纤维化的保护作用Casp1型^−/−与caspase 3激活和肝细胞凋亡无关

（A，B）TUNEL染色和活性caspase 3免疫组织化学的代表性显微照片（40x）。（C，D）通过计算TUNEL阳性细胞数和5个随机显微镜视野（40倍）中裂解caspase 3阳性细胞数，定量肝切片中的肝细胞凋亡。结果表示为平均值±S.E.M.*P<0.05；**与对照组相比，P<0.01。

总之，这些观察结果表明，在NASH的发展过程中，肝细胞中的胱天蛋白酶1激活在肝细胞损伤、炎症信号传导、HSC激活和肝纤维化中发挥着重要作用，与胱天蛋白酶3激活和肝细胞凋亡无关。

这项工作得到了NIH向AEF提供的赠款（DK076852）和（DK082451）的支持。