胰腺导管腺是对慢性损伤做出反应并介导Shh诱导的上皮化生的独特导管室

组织学和免疫组织化学

标本在4%多聚甲醛或10%福尔马林/PBS中固定过夜。组织学分析由经验丰富的胃肠道病理学家（G.Y.L.）对3-4μm石蜡包埋切片进行。使用阿尔西安蓝（pH 2.8）和周期性酸-雪夫染色检测粘蛋白。免疫组织化学的主要抗体和条件见补充表1内源过氧化物酶活性被3%H猝灭₂O（运行）₂生物素化二级抗体以1:1000的稀释度使用。使用DAB（Zymed）通过棕色色素沉着对蛋白质进行可视化。用苏木精对载玻片进行复染。

通过用LacZ底物5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷（X-Gal）（Sigma）染色，确定Ptch1-LacZ动物中Ptch1的表达。样品在4°C的4%多聚甲醛中预先放置75–90分钟，在缓冲液中清洗，并在室温下在含有蛋白酶抑制剂的X-Gal溶液中培养24小时。标本在4%多聚甲醛中固定4小时，脱水，石蜡包埋，切片，并用抗核红进行复染。年龄匹配的野生型窝鼠为阴性对照。

管道系统铸件

通过导管内灌注铸型介质（Mercox Resin，Ladd Research Industries，用10%甲基丙烯酸甲酯单体稀释），获得器官捐赠的五只小鼠胰腺和一只人类胰腺导管系统的腐蚀铸型。将树脂填充的组织浸泡在热水（60°C）中1小时以进行树脂固化。然后，通过在5–10%氢氧化钾和热水交替冲洗中浸渍去除组织，在甲酸中清洗，在蒸馏水中清洗并冻干。铸件通过光学显微镜成像，然后用金/铂溅射涂层（Hummer V，Anatech），用于15kV的LEO 1450VP扫描电子显微镜（Carl Zeiss）的扫描电子显微镜。

定量实时PCR

从RNAlater（Ambion）中储存于−20°C的组织中提取RNA（RNA隔离试剂盒，Ambion。使用ABI 7700序列检测器系统进行一步多重TaqMan实时RT-PCR。用18S RNA作为内部对照，评估SHH、IHH、DHH、PTCH、SMO、GLI1和GLI2的表达。探针和引物设计成跨越外显子-外显子连接，以避免基因组DNA扩增。热循环条件为：在48℃下逆转录30分钟，在95℃下初始激活10分钟，然后在95℃进行40次变性15秒，在60℃下退火/延伸60秒。在退火过程中收集荧光数据，并使用SDS1.7软件（Applied Biosystems）进行分析。根据相应的Ct（阈值周期）值确定相对基因表达。

体外SHH实验

人胰腺导管上皮细胞^17,18在补充有牛垂体提取物和人表皮生长因子（GIBCO，Invitrogen）的无血清角质形成细胞培养基中培养。细胞在培养基中暴露于0、5、10或20 nM重组人SHH（R&D系统）。每48小时更换一次培养基。8天后（192小时），对细胞进行PAS染色，并采集总RNA以进行RTq-PCR分析。

慢性损伤导致PDG发生增生

通过建立一个成熟的慢性胰腺损伤小鼠模型，评估整个导管系统的形态学变化。^2,16

慢性损伤6周或6周以上，导管上皮和间质均发生严重变化；PDG频率和形态变化(图3). 对照组近端导管周围有一层薄的间充质壁，PDG很少。PDG很小，通常只有一个管腔，很少显示几个腺体单位(图3A). 对慢性损伤的反应是导管间质增厚。PDG的数量和大小都增加，显示出复杂的结构，有分支和褶皱，以及乳头状和核假层化等异型性特征(图3B). 上皮呈现出更粘稠的外观。这些PanIN-like特征在较大导管的PDG中更常见，但可以在周围导管中检测到。

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图3

慢性损伤导致PDG增生。对照动物（a）和慢性损伤和化生动物（B）的近端导管系统概述。（A） 正常胰腺有少量小PDG（箭头所示），在薄的导管间质中有规则的单层粘液样内层。（B） 在慢性损伤中，PDG的数量和大小都显著增加（箭头所示）。PDG表现为增生，形态复杂（星号），内衬不太规则的上皮，有多层和乳头（插图）。近端PDG的变化更为明显。导管间质增厚。

因此，作为对慢性损伤的反应，PDG似乎经历了增生，并发展成具有PanIN样特征的粘液化生。

PDG保留胃肠粘液是胃肠道转移的来源

转移性导管病变，包括PanIN和癌症，经常表达GI标记物。^19,20正常胰腺导管表达PAS⁺，但不是Alcian-blue⁺粘蛋白。相反，化生病变经常表现为阿尔西安蓝⁺粘蛋白和胃Muc5ac，这被认为是化生的早期迹象。^19,21为了确定PDG是否是一种可能的来源，对正常胰腺和受损胰腺的粘蛋白表达模式进行了表征，并与正常胰腺和胃肠道上皮进行了比较。

小鼠试验结果(图4)密切反映人类的结果(补充图3). PAS公司⁺粘蛋白和Muc1存在于整个导管系统的管腔膜上(图4A). 然而，只有PDG表现出强烈的细胞质的PAS染色，提示粘蛋白分泌功能(图4B). 此外，PDG express Alcian blue⁺粘蛋白，包括通常存在于胃幽门腺深层的粘蛋白，即Muc6(图4 B&E). 因此，正常胰腺中的PDG表达粘蛋白，到目前为止被认为是化生的。作为对慢性损伤的反应，PDG出现增生，不仅表现出Muc6的上调和扩张，而且还表现出从头开始Muc5ac表达，导致粘液化生(图4 C&D). 然而，胃粘膜Muc5ac经常在PDG中发现，以应对损伤，从头开始很少观察到肠道Muc2的表达。

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图4

小鼠胰腺：PDG保留胃肠粘液，是胃肠粘液化生的来源。（A） 正常外周胰管有立方至低柱状上皮，PAS低表达⁺粘蛋白（洋红）和Muc-1，但为阿尔西安蓝⁻（B）PDG含有PAS的独特上皮⁺和阿尔西安蓝⁺（绿松石色）粘蛋白。PDG，但不是主管腔内壁（下图），表达通常在胃深部粘膜（下壁）（E中的胃肠道）中发现的粘蛋白。（C，D）在慢性损伤中，PDG肥大，粘蛋白表达增加，形态异型性增加。胃粘蛋白上调（下两排）。Muc5ac经常表达，Muc2很少表达。这导致类似幽门区（E）的化生表型，而非正常胰腺导管（a）。

粘蛋白表达模式证实PDG不同于胰腺导管上皮的其他部分，并经历进行性粘液化生，这与胃幽门上皮的特征密切相关。

PDG保留和上调发育途径，包括Shh

胰腺导管上皮的更新率较低，对其再生的了解较少。在许多组织中，再生和化生的形成受发育过程中指导组织分化的相同基因控制。⁷因此，我们的下一步是分析PDG中已知在胰腺发育和疾病中起关键作用的发育基因的表达。在对照组中分析Hh通路基因以及Pdx-1和Hes-1的表达，并在先前使用的相同小鼠中分析其对慢性损伤的反应。此外，通过Ki-67表达或BrdU掺入分析增殖活性。

正常胰腺

与之前未在正常胰腺中发现Shh的研究相比，Shh是专门在PDG中发现的(图5A). 在Ptch1-LacZ动物中，在PDG周围的导管间质中发现了Hh受体Ptch1。Ptch2受体与Shh在PDG上皮和正常导管上皮的单个细胞中共同表达。Pdx-1主要在PDG中表达，但也可在主管腔的上皮衬里中发现。已知Hes-1在外周导管和中心泡细胞中表达，¹²主要在PDG中的大导管中表达(图5A).

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图5

PDG是发育因子和增殖的优先表达位点。（A） 在正常状态下，Shh在PDG（箭头）中以低水平表达，但在管腔上皮中不表达。受体Ptch2在PDG中与Shh共表达，在导管表面上皮（箭头）的一些细胞中也有表达；Ptch1在PDG周围的间质中表达。Pdx-1主要在PDG（箭头）中表达，但可以在导管上皮中识别。Hes-1主要在大导管（箭头）的PDG中表达，但可以在导管上皮中识别。（B） 作为对慢性损伤的反应，所有这些标记物似乎都上调了。Shh对PDG内的黏液细胞仍具有特异性。Ptch2在PDG中表达，但在表面上皮（箭头）中扩张；Ptch1广泛分布于导管间质。Pdx-1和Hes-1在导管上皮中的表达增加或广泛。（C） 在重度化生和异型性中，这些变化更为明显。Shh对粘液上皮仍具有特异性。Pdx-1和Hes-1扩张至表面上皮，但在深层上皮中仍强烈表达。（D） 作为对损伤的反应，大导管中的增殖（BrdU掺入）主要位于PDG（箭头所示）。在慢性损伤和化生中，增殖标记物Ki-67的表达主要见于PDG和粘膜皱襞顶点。MD：主管上皮衬里。

外围PDG证据

为了寻找外周PDG，在对照小鼠和慢性损伤小鼠的外周导管中评估PDG室的特异性标记物Shh、Alcian蓝和胃粘液。这些标记物在对照组的小胰腺导管中均未发现；但在两小叶间增厚的间质中都可以发现共同表达这些标记的外溢物(图6A)和小叶内导管(图6B)作为对慢性损伤的反应，这表明它们的存在可能太小，无法在非增生状态下识别。

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图6

PDG室位于外围管道中。在慢性损伤Shh中，Alcian blue和Muc6识别小叶间（A）和小叶内（B）导管间质中的PDG室。

Shh错误引导胰腺导管朝向胃肠道粘膜转移

在发育过程中，Shh将前肠中胚层导向胃肠道命运；在成人中Shh似乎促进胃腺分化，²²并被确定为胰腺癌发生的早期介质。¹⁵在PDG中Shh和胃型粘液化生的严格共定位使我们推测，Shh的不适当上调可能是导致慢性损伤中的化生的原因，该化生通过引导胰腺导管上皮朝向胃的方向。转染Hh效应物Gli1的HPDE细胞上调前肠标记物²³我们的目的是确定胰腺导管上皮是否对配体Shh有直接反应，以及Shh水平升高是否会导致胃粘液化生。

HPDE细胞^17,18暴露于重组Shh并分析Ptch和黏蛋白的表达。与对照细胞相比，暴露于重组SHH 8天的HPDE显示出粘蛋白表达增强的表型变化(图7A). 定量RT-PCR显示HPDE细胞表达Hh受体和下游基因PTCH2，并上调其表达以响应Shh暴露，显示Hh途径激活。此外，HPDE细胞上调胃粘蛋白MUC6的表达，尤其是MUC5ac的表达(图7A). 因此，HPDE细胞对配体Shh反应，并在Hh途径激活后进行胃粘液转化在体外.

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图7

Shh错误地将胰腺导管上皮导向胃肠道粘液化生。（A） Shh暴露导致HPDE细胞中粘蛋白表达增强（PAS：洋红，箭头）。实时定量RT-PCR显示HPDE细胞是表达受体的Hh靶细胞PTCH2公司.为响应Shh暴露，该途径被激活(PTCH2公司上调）以及胃粘液蛋白上调（MUC5ac、MUC6）。（B） Pdx-Shh小鼠中Shh转基因错误表达导致胰管GI表型表达PAS⁺（洋红）和阿尔西安蓝⁺粘蛋白，包括Muc5ac。比例尺指示100μm。

分析Shh是否具有类似效果体内，我们评估了工程化Shh错表达对胰腺导管表型和粘蛋白表达的影响。对Pdx-Shh转基因小鼠胰腺的分析表明，导管上皮首先具有非粘液外观，其次发展为粘液化生。同样，Shh介导的化生以胃粘蛋白的表达为特征，如Muc5ac(图7B).

体外和体内结果表明，成人胰腺导管上皮对Shh信号有反应，Shh水平升高足以导致胃肠道粘液化生。因此，PDG-衍生的Shh可能会导致胰腺疾病中的粘液化生和PanIN样形成。

拨款支持：这项工作得到了德国研究基金会（STR 690/1-1）和海德堡外科基金会（Lautenschläger奖学金）（O.S.）、Karin Grunebaum癌症研究基金会、Lustgarten胰腺癌研究基金会的资助（RFP05-008），和国家卫生研究院（K08DK71329、P50CA127003和P01CA117969）（S.P.T.）。

我们感谢Matthew Scott的Ptch1 LacZ小鼠，Ming Sound Tsao的HPDE细胞，Chris Wright的Pdx-1抗体，Tetsuno Sudo的Hes-1抗体，Samuel Ho的小鼠胃粘蛋白抗体，以及Victoria Petkova和Rebecca Stearns的RTq PCR和SEM协助。