胶原分子MRI对肝纤维化的诊断和分期

摘要

简介

肝纤维化是反复肝损伤的结果，导致组织修复机制的慢性激活，以细胞外基质瘢痕取代坏死组织[1]. 历史上，肝纤维化是酒精过量或乙型或丙型肝炎感染的结果，但最近糖尿病、脂肪性肝病和代谢综合征导致的非酒精性脂肪性肝炎的增加增加了肝纤维化的发病率。如果疾病的根本原因得到足够早的抑制或消除，肝纤维化有可能退化到较轻的阶段，甚至逆转到正常的结构[2]. 然而，如果不加以控制，纤维化将发展为肝硬化，据估计，该疾病的晚期将影响全球1-2%的人口[三–4]. 肝硬化的主要临床后果是肝功能受损和肝细胞癌（HCC）的发展，这两者都会增加死亡风险。因此，对于可用于确定患者疾病进展以及监测治疗反应的技术，存在着尚未满足的医疗需求。

尽管存在一些局限性，但评估肝纤维化的金标准是活检[5]. 例如，肝活检后的严重并发症（定义为需要住院或延长住院时间）发生在1-5%的患者中，据报道死亡率在0.01%至0.1%之间[6–7]. 此外，活检存在采样错误、观察者之间的变异性，并且无法对整个器官的疾病差异进行采样。值得注意的是，即使是肝硬化等肝纤维化的晚期，也有33%的诊断错误率被报告[8]. 由于患者依从性和并发症风险的增加，重复活检以评估疾病进展或治疗反应的吸引力不大。由于所有这些原因，迫切需要能够在整个器官中反复评估肝纤维化的非侵入性策略。

不幸的是，尽管近年来弹性成像技术显示出了良好的前景，但传统成像无法检测到肝纤维化的轻度至中度阶段[9]. 由于肝纤维化的特点是包括I型胶原在内的细胞外基质蛋白过度沉积，我们假设，提供胶原蛋白水平测量的磁共振成像（MRI）试剂不仅在肝纤维化分期中具有广泛的用途，而且在监测治疗反应方面也有广泛的用途。I型胶原是一个很有吸引力的靶点，因为随着纤维化的进展，其浓度增加[10]并且其细胞外位置使其易于被探针接近。与其他成像技术相比，MRI具有一些技术优势，包括其深层组织穿透性、高空间分辨率和对整个肝脏的完全覆盖。此外，MRI不需要电离辐射，电离辐射有助于监测一种已知需要多年才能进展或消退的疾病，因此很可能需要几轮成像。

之前，我们鉴定了一种对1型胶原具有特异性的16氨基酸肽，并通过添加3个GdDTPA螯合剂使其功能化用于MRI。我们证明，这种名为EP-3533的化合物与I型胶原可逆结合（Kd=1.8μM）且不饱和，可用于检测心肌瘢痕[11]. 最近，我们证明EP-3533可以在两种啮齿动物模型（二乙基亚硝胺处理的大鼠和四氯化碳（CCl₄)-治疗小鼠）[12]. 然而，由于这些动物只在一个时间点进行成像，因此该初步可行性研究并不能用于分期纤维化。在这里，我们表明EP-3533可以可靠地区分CCI中的不同疾病阶段₄小鼠模型。我们还将EP-3533增强MRI与之前报道的其他MRI技术（如弥散和松弛时间测量）进行了比较，以检测纤维化。此外，我们还进行了生物分布、药代动力学和体外评价EP-3533安全性的药理学研究。

材料和方法

结果

对CCl治疗的小鼠进行了EP-3533的剂量优化₄持续18周，如天狼星红染色所示，导致晚期纤维化(补充图1). 在纤维化CCl中使用四种剂量的EP-3533（5、10、20或40μmol/kg）进行MRI检查₄-治疗过的小鼠和没有纤维化的对照组。为了找到鉴别纤维化的最佳剂量，我们量化了注射EP-3533后40分钟肝脏中信号增强的百分比，与探针注射前的肝脏信号相比。正如预期的那样，随着剂量的增加，肝脏信号增强增强，但随着剂量的增大，区分纤维化动物和对照动物的能力减弱(补充图1). 相比之下，在最低剂量下，纤维化动物和对照动物之间有很好的区分，但信号增强较低，导致较大的相对误差。10μmol/kg的剂量可以将纤维化动物与对照动物区分开来，因此被选择用于所有剩余的研究。

在EP-3533成功转化为临床应用之前，有必要了解其药代动力学。为了解决这个问题，我们对静脉注射EP-3533的小鼠的胸部和腹部进行了3D T1加权MR成像，以估计血液和其他器官的信号洗脱率(补充图2). EP-3533的血液半衰期为19±2分钟，与其细胞外分布和初级肾脏清除率一致，如肾脏和膀胱的强MR增强所示(补充图2). 纤维化小鼠与对照组的血液半衰期没有差异。我们还对Gd进行了全身生物分布分析，以追踪EP-3533在注射后2小时和24小时的位置(补充图2). 到24小时时，除了骨头和肾脏中有少量残留外，探针基本上已从体内清除。

为了评估潜在的离目标影响，我们运行了一个体外Cerep的“铅副作用小组”测量EP-3533抑制33种不同受体结合或酶活性的能力体外化验(补充表1). EP-3533在10μM下进行测试，在抑制受体结合或酶活性方面没有明显效果。综上所述，这些结果表明EP-3533对其靶点具有特异性，并迅速从体内消除。

为了确定EP-3533能否区分早期肝纤维化和晚期疾病，我们用CCl治疗小鼠₄或将溶媒控制6、12或18周，导致不同阶段的肝纤维化。在静脉注射10μmol/kg EP-3533之前和之后立即对小鼠进行MR成像。基线MRI还包括T1的测量[14]，T1ρ[16]，T2型[14]，模数转换器[15,19]和MTR[17]因为这些测量结果也被报道与纤维化相关。所有影像学结果均与肝纤维化组织学Ishak评分相关。

正如预期的那样，疾病在CCI中逐步发展₄天狼星红染色法建立小鼠模型(图1A). CCl 6周后₄给药后，大多数动物出现广泛的门脉纤维化，偶尔出现桥接性纤维化（Ishak 2–3），在12至18周时，疾病发展为完全桥接性肝纤维化，出现一些再生结节（Ishak4–5）。一贯地，肝组织羟脯氨酸分析测定的胶原沉积与Ishak评分的模式相同(图1B). 我们还通过计算每只动物代表性载玻片中天狼星红染色的总量来量化胶原蛋白沉积量，该测量值与Ishak评分密切相关(图1C)和肝脏羟脯氨酸水平(图1D).

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图1

CCl的特征₄-诱导小鼠肝纤维化模型

（A）CCl后天狼星红染色的代表性图像₄给药6、12或18周。（B）通过羟脯氨酸分析评估的总胶原蛋白是通过Ishak评分确定的随着疾病进展而计算的。（C）使用Image J软件定量天狼星红染色，并与疾病进展进行比较。（D）总胶原蛋白（羟脯氨酸）和天狼星红定量之间的相关性**p<0.001和***p<0.0001。

我们发现，将MR信号与纤维化联系起来的最敏感的MR测量是注射EP-3533后肝脏和邻近骨骼肌之间的对比噪声比（CNR）的变化。为了进行这项分析，我们在肝脏上绘制了一大片感兴趣的区域，不包括任何大血管，并测量了信号强度（SI）。我们还测量了背部肌肉的SI。根据动物附近空气中SI的标准偏差（SD）估算噪声。CNR计算为{（SI_肝脏−国际单位制_肌肉)/标准偏差_空气}. 我们使用了一个反转恢复序列，该序列具有反转时间，可以在探针注射之前消除肝脏中的信号。这提供了肝脏信号变化的最大动态范围，如图2A其中有代表性的图像显示了小鼠的轴视图解剖结构，并标记了胃、肝脏和背部肌肉。灰度图像显示了进行MR测量的解剖图像，而假彩色叠加是注射后40分钟拍摄的反转恢复图像与注射EP-3533前拍摄的图像之间的差异图像。术后，我们发现对照组和纤维化动物的肝脏显著增强，但肌肉几乎没有增强。正如预期的那样，我们观察到纤维化动物的肝脏有更大的增强。

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图2

胶原蛋白增强MRI对肝纤维化分期的研究

（A）对照组（Ishak 0）和纤维化（Ishak5）小鼠的代表性轴位MR图像，显示肝脏、胃和背部肌肉。假彩色叠加是EP-3533注射后和注射前图像之间的差异图像。以相同比例渲染的两个图像。（B）根据Ishak评分确定的疾病进展情况，计算ΔCNR（肝脏：肌肉）。（C）中存在的探针数量体外根据Ishak评分确定的疾病进展情况计算肝脏（注射剂量Gd/g肝脏的%）。（D）ΔCNR（肝脏：肌肉）和总胶原蛋白（羟脯氨酸）之间的相关性。（E）ΔCNR（肝脏：肌肉）与天狼星红定量之间的相关性#p<0.05，p<0.01和***p<0.0001。

如所示图2B肝脏的变化：在纤维化CCl中，注射EP-3533后的肌肉对比度（CNR肝脏：肌肉）随着疾病进展而增加（Ishak评分）₄-受伤的老鼠。一贯地，体外肝脏Gd水平（探针摄取的另一个标志）也随着Ishak评分的增加而增加(图2C). （CNR肝脏：肌肉）和肝脏羟脯氨酸水平之间也有很强的相关性（r=0.89，图2D)和（CNR肝脏：肌肉）和天狼星红定量（r=0.83，图2E). 后两个结果都突出了EP-3533对胶原蛋白的强特异性。最后，我们计算出检测纤维化的ROC下面积（AUROC）（Ishak 0与Ishak≥2）为0.933±0.059（95%CI=0.82–1.05，p=0.0011；补充图3). 为了区分早期和晚期纤维化（Ishak≤3 vs.Ishak≥4），AUROC计算为0.942±0.052（95%CI=0.84–1.05，p=0.00087；补充图3).

我们还检查了其他与胶原探针无关的MRI测量，以确定单独的MRI是否对肝纤维化敏感。已有文献报道松弛时间（T1、T2或T1ρ）、弥散（ADC）和磁化传递测量可作为肝纤维化的敏感指标[14–17,19]. 然而，在这个动物模型中，我们只观察到这些参数与肝脏羟脯氨酸水平的微弱相关性(图3A)总的来说，观察到的变化与测量的不确定度有关。只有T1ρ测量可以在Ishak评分方面显著区分纤维化动物和对照动物(图3B)但T1ρ不能区分中度（Ishak 2-3）和重度（Ishak4-5）纤维化。其他MR测量（T1、T2、ADC、MTR）无法根据Ishak评分将动物分类。

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图3

诊断肝纤维化的其他MR测量分析

MR测量值与Ishak评分和肝总胶原（羟脯氨酸，Hyp）的相关性。（A）T1弛豫时间vs Ishak；（B）表观扩散系数（ADC）vs Ishak；（C）T1ρ松弛时间vs Ishak；（D）T2弛豫时间vs Ishak；（E）磁化传递比（MTR）vs Ishak；（F）T1与Hyp；（G）ADC vs Hyp；（H）T1ρvs Hyp；（一）T2 vs Hyp；（J）MTR与Hyp#p<0.05。

缺乏评估肝纤维化的非侵入性手段是开发抗纤维化药物的主要障碍[9]. 由于目前还没有批准的治疗肝纤维化的药物，我们使用了常见的毒素戒断方法作为纤维化消退的模型。用CCl治疗小鼠₄持续9周诱导肝纤维化，然后一组小鼠继续接受CCl₄而另一组有CCl₄撤回。如图所示图4A-B，撤回CCl₄通过天狼星红染色评估改善了肝脏疾病。事实上，天狼星红染色的组织学评分表明，CCl小鼠的Ishak评分平均提高了2个阶段₄撤回(图4C). EP-3533的MR成像无法检测到这两组小鼠之间的纤维化阶段差异(图4D). 有趣的是，最近的一份报告表明，即使CCl后观察到疾病的组织学改善₄停药后，羟脯氨酸分析评估的总胶原蛋白在至少12周内没有减少[20]. 一贯地，当我们分析动物体内的总胶原蛋白水平（羟脯氨酸）时，我们没有发现继续接受CCl的动物之间存在显著差异₄还有那些撤回的(图4E). 因此，这些结果进一步突出了EP-3533对胶原蛋白的特异性，而不是肝病。

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图4

CCl后肝纤维化的胶原靶向MRI研究₄撤回

（A）CCl处理小鼠肝脏天狼星红染色的代表性图像₄18周（CCl₄)或CCl₄持续9周，然后退出9周（退出）。对照组动物仅口服灌胃给药。天狼星红染色（B）使用Image J软件量化或（C）通过Ishak评分进行评估。（D）计算ΔCNR（肝脏：肌肉）。（E）通过羟脯氨酸分析测定总胶原蛋白#p<0.05，p<0.01，**p<0.001和**p<000001。

讨论

在这里，我们首次表明胶原蛋白增强MRI可以准确监测和分期CCl患者的肝纤维化进展₄-治疗小鼠。此外，我们观察到MR成像与总胶原蛋白水平之间存在显著相关性，并且MR成像和Ishak评分之间存在较强相关性。这一结果可能是因为探针是专门针对胶原蛋白的。然而，也值得注意的是，虽然Ishak评分受到活检的限制，仅代表对非常小的肝脏样本进行组织学分析，但对约20%的肝脏进行了羟脯氨酸分析，因此可能更好地反映整个肝脏中实际存在的纤维化程度。在相同的Ishak评分中观察到的胶原水平的变化支持了这一观点，并表明整个肝脏的胶原增强MRI可能比活检肝组织的组织学评分更好地代表疾病阶段。

据我们所知，这是第一份直接比较相同纤维化动物的几种MR测量值的报告。放松时间、ADC和MTR取决于许多因素，如蛋白质含量、铁浓度、水肿和细胞外体积。这使得这些参数的变化难以解释。例如，细胞外体积增加可能会增加水分扩散，但基质生成增加可能会产生相反的效果。与之前的观察结果一致，我们观察到这些参数随着纤维化程度的增加而发生变化的趋势。然而，疾病变化的幅度与测量本身的不确定性相当，这导致相关性相对较弱。这些固有MR标记物的结果强调了我们使用胶原蛋白靶向探针的发现的重要性。用靶向探针对胶原蛋白进行直接分子MR成像对纤维化变化更为敏感。

磁共振弹性成像（MRE）在纤维化分期方面显示出巨大的前景。MRE使用振动源在组织中产生低频机械波，这些波可以被MRI检测到并进行处理，以给出机械特性图，如肝脏硬度。由于MRE需要额外的硬件，我们无法在本研究中直接将我们的分子成像方法与MRE进行比较。然而，这里进行的用于区分不同纤维化阶段的AUROC分析显示了与MRE相似的诊断准确性[21]. 我们注意到，EP-3533的分子成像与MRE兼容，并且这两种技术可以结合使用，以获得潜在的更高精度。

还有其他几种无创性评估纤维化的方法[22]. 血清生物标记物面板，如FibroTest[23]ECM标记物增强型肝纤维化（ELF）面板[24]，已被开发为肝纤维化的预测因子。总的来说，大多数这些测试可以排除或排除纤维化，但不能可靠地区分纤维化的阶段[9]. 瞬态超声弹性成像（FibroScan）已被广泛研究[25]. 最近对50项肝脏瞬态弹性成像研究进行的荟萃分析得出结论，该技术可以以优异的诊断准确性进行，并且在肝硬化诊断中独立于潜在的肝脏疾病[26]. 然而，对于早期纤维化的诊断，发现ROC的高变异性取决于潜在的肝脏疾病。因此，所有这些技术都需要进一步评估和优化，但我们相信胶原蛋白增强MRI可以与其他测试一起进行，以便更准确地诊断肝纤维化。

胶原蛋白增强磁共振成像是否可以用于监测治疗或干预后的纤维化消退（例如去除侮辱性物质，如酒精、丙型肝炎病毒或脂肪肝），仍有待观察。我们尝试使用CCl₄停药作为一种纤维化回归模型，但通过羟脯氨酸分析，观察到总胶原蛋白没有变化，尽管天狼星红染色显示动物的组织学更好。这一令人困惑的结果可以用这些检测方法在CCl后检测胶原蛋白的能力的差异来解释₄已被撤回。我们的结果表明，胶原蛋白以某种方式被修饰，可能只是通过消化，这使得它可以通过羟脯氨酸分析和胶原蛋白靶向MRI而不是天狼星红染色来检测。事实上，Schuppan小组的最新结果也表明，羟脯氨酸分析和天狼星红染色在CCl后监测胶原蛋白水平方面存在差异₄停药后，他们注意到总胶原蛋白（通过羟脯氨酸评估）在停药后至少12周内没有减少[20]. 目前尚不清楚降低人体胶原蛋白水平需要多久的干预。如果胶原蛋白水平在很长一段时间内没有下降，那么EP-3533在这些情况下可能无法有效监测疾病的退化。然而，目前正在开发各种可能会降低胶原蛋白水平的纤溶剂，并且可以使用EP-3533监测其疗效。

我们使用高场专用小动物扫描仪进行研究。然而，我们预计在典型的1.5T扫描仪中转换为临床环境时不会遇到特别的挑战。此处使用的Gd剂量（总计0.03 mmol/kg）低于常规Gd对比剂（0.1 mmol/kg.）。我们还注意到，EP-3533在1.5T时的松弛度是4.7T时的3倍，因此可能在低场下进一步降低该剂量[11,13]. 在这项研究中，对纤维化最敏感的MR变化只是将延迟的探针后图像与基线图像进行比较时肝脏与肌肉CNR的变化。我们使用了一个反转准备好的涡轮自旋回波型序列，该序列类似于临床扫描仪上身体成像的标准序列。因此，在临床环境中，在一个呼吸孔内获得完整的肝脏图像是可行的，这将能够对纤维化进行空间分辨率的完整器官测量。

还应该提到的是，导致疤痕组织积聚的持续损伤和修复周期与肝脏或其他器官（如肾或肺）慢性损伤的反应相似。心脏病[27]，肾[28]和肺纤维化[29]都以I型胶原过度沉积为特征。因此，我们监测肝纤维化过程中胶原变化的MRI方法也应适用于这些其他纤维化病理。然而，探针在肾脏中的分布将导致高背景，这可能使肾纤维化的定量具有挑战性。我们实验室目前正在研究其他器官系统的纤维化评估。

总之，我们已经证明EP-3533对CCl纤维化进展过程中观察到的I型胶原水平的变化敏感₄-经过治疗的小鼠和胶原蛋白增强MRI可以准确地分期这些动物的纤维化。由于EP-3533能迅速排出体外，并表现出最小的非特异性结合，因此应检查其检测人类肝纤维化的能力。结合其他非侵入性策略，如血清测试和弹性成像，胶原蛋白增强MRI可能不仅可以更好地识别哪些患者有快速进展的疾病，还可以监测这些患者的干预措施。

补充材料

致谢

缩略语清单

脚注

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