单元格。作者手稿;PMC 2014年6月6日提供。
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尼姆斯:美国国立卫生研究院480457
好氧糖酵解对T细胞效应器功能的转录后控制
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张志浩
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
乔纳森·柯蒂斯
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
小伦纳德·B·马吉。
2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院布莱特研究所分子肿瘤科
布兰登·福伯特
三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学生理学系古德曼癌症研究中心H3G 1Y6
亚历杭德罗·维拉里诺
4美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所,邮编:20892
大卫·奥沙利文
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
斯坦利·程成(Stanley Ching-Cheng Huang)
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
Gerritje J.W.van der Windt公司
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
朱莉安娜·布拉吉
三加拿大蒙特利尔麦吉尔大学生理学系古德曼癌症研究中心H3G 1Y6
金秋
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
杰森·韦伯
2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院布莱特研究所分子肿瘤科
爱德华·皮尔斯
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
罗素·G·琼斯
三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学生理学系古德曼癌症研究中心H3G 1Y6
埃里卡·皮尔斯
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
1美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院病理与免疫学系,邮编63110
2美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院布莱特研究所分子肿瘤科
三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学生理学系古德曼癌症研究中心H3G 1Y6
4美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所,邮编:20892
结果
激活幼稚T细胞需要OXPHOS,但不需要好氧糖酵解
我们测量了体外和体内激活的T细胞的细胞外酸化率(ECAR)(有氧糖酵解的指标)和耗氧率(OCR)(OXPHOS的指标),发现与原始细胞相比,两者都具有较高的ECAR和OCR()表明活化的T细胞同时使用需氧糖酵解和OXPHOS(Gatza等人,2011年;Michalek等人,2011年;范德温特和皮尔斯,2012年;Wang等人,2011年). 为了评估来源于OXPHOS的线粒体ATP对T细胞激活是否必要,我们在ATP合酶抑制剂寡霉素存在下激活了CFSE标记的原始T细胞,并测量了随后的增殖。即使低浓度的寡霉素(4.1 nM)也会抑制增殖()和激活标记表达(). 我们验证了抑制激活和增殖的寡霉素浓度也降低了OCR()和ATP(图S1A在线提供)。这些数据表明T细胞激活需要线粒体ATP。值得考虑的是,除了直接抑制ATP的生成外,用寡霉素阻断原始T细胞中的电子传递链(ETC)流量可能会导致自由基氧物种(ROS)积累,从而诱导细胞应激并导致ATP生成的随后下降。
激活T细胞需要OXPHOS,但不需要好氧糖酵解(A) 评估原始和活化T细胞的OCR和ECAR。激活的CD4+T细胞来源于单核细胞增生李斯特菌-感染小鼠或用抗CD3/28体外刺激72小时后,还测定了细胞的OCR/ECAR比值*p=0.014和**p<0.0001。
(B) 在寡霉素(Oligo)存在或不存在的情况下,用抗CD3/28激活CFSE标记的原始T细胞指定时间,然后通过CFSE稀释度测量增殖。
(C) 在不使用(无药物)或使用寡霉素的情况下,用抗CD3/28激活Naive T细胞72小时。测定活化标记CD44和CD25的平均荧光强度(MFI),并将其归一化为在原始细胞中表达的水平*CD44的p=0.001,CD25的p=0.002。
(D) 用抗CD3/28激活并在低浓度寡霉素存在下培养3天的T细胞OCR,*p=0.0001。
(E) 用抗CD3/28激活CFSE标记的原始T细胞,并在添加(+Glc)或不添加(−Glc)葡萄糖或添加半乳糖(+Gal)或半乳糖+寡霉素(+Gal/Oligo)的培养基中培养6天。激活后1、3或6天测量CFSE稀释度。
(F) 测定T细胞的活细胞(7AAD−)数量,并将其归一化为指定时间在葡萄糖培养基中培养的活细胞数量。
(G) 用抗CD3/28激活3天并在补充葡萄糖(+Glc)或半乳糖(+Gal)的培养基中培养的T细胞的OCR和ECAR,*p=0.0001。
数据代表了至少两个独立实验,并描述了四重(A)、(C)、(D)、(F)和(G)或三个独立实验(B)和(E)的平均值±SEM(误差线)。另请参见图S1.
葡萄糖是T细胞培养基中的正常糖,当在葡萄糖中被激活时,T细胞会进行有氧糖酵解(Frauworth等人,2002年;Gerriets和Rathmell,2012年). 以前的研究表明,无糖培养的T细胞有严重缺陷(Cham等人,2008年;Cham和Gajewski,2005年;Tripmacher等人,2008年). 为了明确有氧糖酵解在T细胞激活中的作用,我们在葡萄糖或半乳糖中激活了原始T细胞。生长在半乳糖中的细胞被迫呼吸,不进行有氧糖酵解(Bustamente等人,1977年;Le Goffe等人,1999年;Rossignol等人,2004年;Weinberg等人,2010年). 我们发现半乳糖培养的T细胞激活(图S1B),生成ATP(图S1C),增殖-尽管初始速度比葡萄糖中生长的细胞慢()-并幸存下来(). 不含糖生长的细胞不会增殖()它们的存活率急剧下降(). 重要的是,在含有寡霉素的半乳糖中生长的细胞既没有增殖()也没有幸存下来()证实了T细胞在半乳糖燃料增殖中被激活,并通过OXPHOS的线粒体ATP存活(; OCR),而不是通过有氧糖酵解(; ECAR)。
活化的T细胞可以利用好氧糖酵解或氧化还原磷进行燃料增殖
为了确定OXPHOS是否是爆破T细胞持续增殖所必需的,我们激活了原始T细胞,并在1、2或3天后添加了寡霉素。然后,我们评估了添加药物后24小时和72小时的持续增殖(). 激活后2天,细胞能够在高浓度寡霉素(100 nm-1μm)中增殖(). 激活后1天的情况并非如此,这表明T细胞在激活后1至2天内不会放弃从线粒体产生能量的需要(). 为了证实这一结果,并测试ETC活性是否是增殖所必需的,我们分别在鱼藤酮和抗霉素A复合物I和III抑制剂存在下培养活化T细胞,发现两者都没有抑制活化T细胞的增殖(,左)。然而,我们确实发现,黏液噻唑,一种阻止该位点产生ROS的复合III抑制剂,抑制了T细胞分裂(数据未显示),这与已发表的观察结果一致,即ROS可以作为细胞增殖的阳性信号(Weinberg等人,2010年). 重要的是,添加寡霉素或抗霉素A和鱼藤酮可以降低OCR,同时增加ECAR((右),表明细胞通过增强有氧糖酵解来抵消ETC抑制,并且随着时间的推移,细胞补偿了寡霉素引起的ATP初始下降(图S1D). 我们的代谢产物分析显示,在使用线粒体抑制剂培养的T细胞中,α-酮戊二酸增加(图S2A). 尽管这些数据不能证明谷氨酰胺是补充这种情况下TCA循环的补体底物,但它们可能与谷氨酰胺依赖性代谢增加相一致(Wang等人,2011年). 最近发表的论文表明,由于ETC或TCA循环突变、缺氧或与线粒体抑制剂培养而无法参与氧化代谢的细胞在生长和增殖过程中使用α-酮戊二酸的还原羧化来产生柠檬酸盐和其他前体(Metallo等人,2012年;Mullen等人,2012年). 我们可能推测,谷氨酰胺依赖的还原羧基化,而不是氧化代谢,也会刺激TCA循环,并支持前体生物合成,以促进在我们的系统中与ETC抑制剂培养的T细胞的增殖。
活化的T细胞可以交替使用好氧糖酵解或OXPHOS来促进燃料增殖和存活(A) 用抗CD3/28激活Naive T细胞1、2或3天,并用CFSE标记,用或不用寡霉素培养。CFSE标记后24小时和72小时通过CFSE稀释度测量增殖。
(B) 用抗CD3/28激活Naive T细胞3天。然后对细胞进行CFSE标记,并用线粒体抑制剂培养。在CFSE标记后24、48和72小时通过CFSE稀释度测量增殖(左),在培养后72小时测量OCR和ECAR,无论是否有线粒体抑制剂(O、寡霉素、R/A、鱼藤酮和抗霉素A)(右)。
(C) 在葡萄糖培养基中用抗CD3/28激活Naive T细胞3天,然后进行CFSE标记。然后将CFSE标记的活化细胞培养在添加葡萄糖(+Glc)、葡萄糖加1μM寡霉素(Glc+Oligo)、不添加葡萄糖−Glc或添加半乳糖(+Gal)或半乳糖加4 nM寡霉菌素(Gal+Oligon)的培养基中。在CFSE标记后24小时和72小时测量CFSE稀释度。
(D) 生命细胞(7-AAD−)72小时时测定活化CD4+T细胞的数量,并将其归一化为0小时时在葡萄糖培养基中培养的活细胞数量。
在葡萄糖培养基中用抗CD3/28激活(E和F)T细胞3天。将这些细胞切换到含有葡萄糖(+Glc)或不含葡萄糖(−Glc)或者含有半乳糖(+Gal)的培养基中1小时后,测量OCR和ECAR。
数据代表至少三个独立实验(A)、(B,左)和(C)或两个独立实验,并描述四重(B,右)、(D)、(E)和(F)的平均值±SEM(误差条)*p=0.0001。另请参见图S1和S2.
为了确定激活的T细胞持续增殖是否需要有氧糖酵解,我们在葡萄糖中激活T细胞3天,然后我们继续在葡萄糖中培养或将细胞转换为半乳糖。我们发现活化的T细胞增殖(),幸存(),保留的激活标记(图S1E),并生成ATP(图S1F),无论是利用有氧糖酵解还是OXPHOS。与生长在葡萄糖上的T细胞不同,当将寡霉素添加到被迫生长在半乳糖上的活化T细胞中时,细胞停止增殖()存活率急剧下降()表明这些细胞使用OXPHOS()而不是有氧糖酵解()以满足新陈代谢需求。不同于培养在13C-葡萄糖,培养细胞13与葡萄糖培养细胞相比,C-半乳糖产生的乳酸和丙酮酸水平较低(图S2B)并且这些细胞将低水平的半乳糖碳并入已经降低的丙酮酸水平中(图S2C)、乳酸或TCA循环中间产物(图S2D). 与先前发表的其他细胞类型的观察结果一致(Bustamente等人,1977年;Gohil等人,2010年;Le Goffe等人,1999年;Rossignol等人,2004年;Weinberg等人,2010年)这些结果表明,半乳糖在糖酵解途径或在T细胞的TCA循环中不如葡萄糖代谢有效。我们还发现半乳糖培养的T细胞具有较高水平的谷氨酰胺和谷氨酸(图S2B). 虽然这些结果并不能证明这些细胞在这种情况下是否使用谷氨酰胺作为OXPHOS的替代底物,但它们可能暗示了这种可能性,如果是这样的话,将与先前的观察结果一致,即谷氨酰胺是半乳糖培养细胞的主要能量来源(Reitzer等人,1979年). 总之,这些数据表明活化的T细胞可以使用OXPHOS或有氧糖酵解来支持增殖和存活。
T细胞最佳IFN-γ细胞因子产生需要好氧糖酵解
我们在这里表明,T细胞的活化和增殖可以在无需氧糖酵解的情况下进行,并且可以由OXPHOS完全支持。然而,激活的T细胞参与有氧糖酵解的观察结果仍然存在(). 因此,我们提出了一个问题:有氧糖酵解在活化的T细胞中起什么作用?由于活化的T细胞除了增强增殖外,还具有效应器功能,例如产生适应性细胞因子,因此我们测量了在葡萄糖或半乳糖中培养的活化T细胞的细胞因子生成。我们发现在半乳糖中培养的T细胞在IFN-γ和IL-2生成方面存在严重缺陷(,S3A和S3B). 细胞因子的产生不需要线粒体ATP或ETC功能,因为线粒体抑制剂培养的细胞中的水平不受影响(和S3A系列)表明有氧糖酵解而非OXPHOS是效应器功能的关键代谢途径。葡萄糖和半乳糖培养细胞中IFN-γ或IL-2信使RNA(mRNA)的表达以及转录因子T-bet的蛋白表达均无差异,表明细胞因子产生缺陷是由于翻译障碍而非转录障碍所致(和数据未显示)。为了排除半乳糖培养的T细胞产生的较低量的IL-2导致其较低的IFN-γ细胞因子表达的可能性,所有T细胞都在10U/ml外源性IL-2的存在下培养。
T细胞最佳IFN-γ细胞因子产生需要好氧糖酵解(A) 在含有葡萄糖(Glc)或半乳糖(Gal)的培养基中,用抗CD3/28激活T细胞4天(顶部),或在Glc中培养3-4天,然后在Glc或Gal中培养1天(底部,(B)-(H),测量细胞内IFN-γ;或用寡霉素或鱼藤酮/抗霉素A再服用一天(C)。
(B) 再刺激后用ELISA法检测培养上清中的IFN-γ。IFN-γ产生细胞的频率如(A)和(C)所示。
(D) IFN-γmRNA和T-bet表达。
(E) 对p-4EBP1和p-S6K以及p-AMPK和p-eIF2-α进行蛋白质印迹分析。
(F)Hspa5型和第1r15a页用0.1 mM thapsigargin(Thaps)处理4小时后表达。
(G) 用激光光散射法测量的平均细胞直径和体积。
(H) 分别通过Sypro-Ruby染色和BCA分析测定总蛋白密度(左)和总蛋白浓度(右)。
(A)和(C)中的曲线代表3个以上的独立实验;(B) 图表显示了两个独立实验的平均值±SEM(*p=0.001);(D) qPCR数据由五个独立实验产生,显示为平均值±SEM,不显著,FACS图代表两个独立实验;(E) 印迹是两到四个独立实验的代表;(F) 未经Thaps处理的细胞的六个独立实验和经Thaps处理的细胞的一个实验的结果以平均值±SEM表示;(G) 数据代表了两个独立的实验;和(H)数据表示为来自三个独立实验的平均值±SEM。另请参见图S3.
我们推断改变的细胞因子翻译可以反映细胞应激反应(Scheu等人,2006年)由葡萄糖到半乳糖的底物转变引起。为了探索这种可能性,我们评估了葡萄糖和半乳糖培养的细胞中mTOR靶点的激活以及AMPK-α和eIF2-α的磷酸化,发现这些途径没有差异(). 我们还测量了整合应激反应基因的mRNA表达Hspa5型和第1r15a页在葡萄糖和半乳糖培养的细胞中加入或不加入thapsigargin,可诱导内质网应激(Scheu等人,2006年). 我们发现,葡萄糖和半乳糖培养的细胞表达BiP或GADD34到相似的水平,而不是在内质网应激诱导时表达的高水平(). 总之,这些数据表明,经典应激反应的诱导并不是半乳糖培养T细胞中效应细胞因子mRNA翻译受阻的原因。我们还发现细胞大小(),总蛋白质水平(),IFN-γ蛋白稳定性(图S3C)和ROS生产(图S3D)在葡萄糖和半乳糖中培养的T细胞之间相似,表明细胞因子生成的减少不是由于细胞健康的广泛差异。总之,这些数据表明,有氧糖酵解的参与构成了与内质网应激无关的生理机制,内质网胁迫控制细胞因子mRNA的翻译。
有氧糖酵解控制IFN-γmRNA的优先翻译
为了确定有氧糖酵解的参与是否优先调节细胞因子mRNA的翻译,我们从葡萄糖和半乳糖培养细胞中分离核糖体,并测量IFN-γ和β-肌动蛋白转录物。我们发现,IFN-γ转录物主要与使用有氧糖酵解的活化T细胞中的多聚体相关,这表明IFN-γmRNA正在进行翻译,而更多的IFN-γ基因转录物与半乳糖培养的活化T淋巴细胞中的单体相关,表明使用OXPHOS的细胞中IFN-γRNA的翻译较少(). 重要的是,与干扰素γ转录物相比,β-肌动蛋白mRNAs高度翻译并与更多的多聚体相关(峰值向右移动),在这两种情况下与多聚体的相关程度相同(). 这与β-肌动蛋白的正常表达相一致,而与所使用的糖底物无关。这些结果表明,有氧糖酵解的参与特别允许激活T细胞中IFN-γmRNA的翻译,从而调节细胞达到完全效应状态的能力。
GAPDH与IFN-γmRNA结合增强标志着无需氧糖酵解时细胞因子产生的翻译缺陷(A) 在含有葡萄糖的培养基中用抗CD3/28激活T细胞3天,然后在含有葡萄糖(Glc)或半乳糖(Gal)的培养基上进行差异培养一天的T细胞多糖体分析。对40、60和80S核糖体亚单位和多聚体进行分离,并用连续A法监测254测量值。上面板显示了Glc(红色)和Gal(蓝色)中细胞的典型多聚体剖面。从每个组分中提取总RNA,通过qPCR测量IFN-γ(中间)和β-肌动蛋白(底部)的表达,并计算为所有组分中收集的总RNA的百分比。绘制了非翻译(1-7)和翻译(8-14)部分之间每个mRNA的比例。数据是两个独立实验的代表性结果。
(B) 用GAPDH特异性抗体从Glc或Gal培养基中差异培养的活化T细胞提取物中免疫沉淀GAPDH。结合的GAPDH及其相关mRNA通过western blot(顶部)和qRT-PCR(底部)进行分析。显示了每次免疫沉淀的总输入(顶部)。数据显示六个独立实验的结果为平均值±SEM(误差线),并归一化为Glc细胞(*p=0.025)。
(C) 在半乳糖(Gal)培养的细胞中与在葡萄糖(Glc)培养的细胞中结合GAPDH蛋白的IFN-γmRNA转录物和管家基因转录物(GAPDH mRNA)。通过从主要抗体特异性结合中减去背景结合(无主要抗体控制),然后将其归一化为Glc细胞中与GAPDH结合的转录物水平,计算相对水平。
三个独立实验的平均值±SEM(误差线)。另请参见图S4.
GAPDH与IFN-γmRNA结合增强标志着IFN-γ翻译缺陷在无需氧糖酵解的情况下明显存在
接下来我们研究了有氧糖酵解如何特异性改变IFN-γmRNA的翻译。假设生长在半乳糖上的细胞不参与有氧糖酵解(和)-它们也不能将半乳糖代谢为糖酵解途径(图S2)-我们假设,当细胞在半乳糖中生长时,其糖酵解酶的参与程度与在葡萄糖中生长的细胞不同,因此可以执行其他功能。除了代谢功能外,糖酵解酶GAPDH还有几个其他作用,包括作为mRNA结合蛋白(辛格和格林,1993年)调节mRNA翻译(Bonafé等人,2005年;Kondo等人,2011年;Nagy等人,2000年;Rodríguez-Pascual等人,2008年;Zhou等人,2008). 具体而言,GAPDH已被证明与IFN-γ和IL-2 mRNA的3′UTR中富含腺苷酸-尿苷酸(AU)的元素结合(Nagy和Rigby,1995年). 此外,众所周知,3′UTR依赖性机制限制了细胞因子mRNA的翻译(安德森,2010年;Garcia-Sanz和Lenig,1996年;维拉里诺等人,2011年). 为了研究有氧糖酵解是否调节GAPDH蛋白结合细胞因子mRNA的能力,我们从葡萄糖或半乳糖培养的活化T细胞中免疫沉淀GAPDH,并评估其与IFN-γ转录物的相关性。我们发现在半乳糖培养的细胞中GAPDH-相关IFN-γ转录物比在葡萄糖培养的细胞增加了10倍以上(). 半乳糖培养细胞中GAPDH与IFN-γmRNA的结合增强与其IFN-γ生成缺陷相关(,S3A和S3B). 在两种细胞类型之间观察到GAPDH mRNA与GAPDH蛋白的类似结合,表明GAPDH蛋白质仅在半乳糖培养的细胞中优先结合IFN-γ转录物而非看家基因转录物(). 我们还发现,当细胞在半乳糖中而不是葡萄糖中培养时,IL-2 mRNA在更大程度上与GAPDH相关(图S4). 总之,这些结果表明,有氧糖酵解的参与通过阻止GAPDH结合和抑制细胞因子转录物的翻译,允许效应细胞因子的产生。
一种3′UTR依赖机制限制半乳糖培养CD4 T细胞中IFN-γ的表达
此前已有研究表明,3′UTR依赖机制限制了细胞因子mRNA的翻译(维拉里诺等人,2011年). 我们试图确定3′UTR依赖机制是否限制半乳糖培养的CD4 T细胞中IFN-γ的产生。为了实现这一点,我们使用了一系列先前报道的UTR传感器,其中IFN-γ3′UTR或对照3′UTR在逆转录病毒载体中与绿色荧光蛋白(GFP)融合,从而允许通过GFP荧光测量蛋白质表达(维拉里诺等人,2011年). 我们发现,在用富含AU的元件的特定残基突变的突变体(ARE*)转导的CD4 T细胞中,GFP的表达比用全长IFN-γ3′UTR构建体转导的细胞大大增加()表明mRNA的翻译受到IFN-γ3′UTR富含AU区域的限制。我们还用另外两个IFN-γ3′UTR突变体转导细胞,一个突变体缺少AU-富集区,另一个突突变体包含AU-富集区域,但在启动子的不同区域被截断,发现它们分别增强或限制GFP的表达。作为对照,我们用含有GAPDH 3′UTR融合到GFP的构建物转导细胞。正如预期的那样,缺乏AU富集区的GAPDH 3′UTR并不限制GFP的表达(). 这些结果证实了IFN-γ3′UTR富含AU的区域限制了半乳糖培养细胞中IFN-γ的产生。
GAPDH与IFN-γ3′UTR的AU-Rich区相关并调节IFN-γ的产生(A) 在葡萄糖(Glc)中培养的T细胞用UTR传感器转导2天,然后在半乳糖(Gal)中再培养1天,然后用流式细胞术检测GFP荧光。左上角显示了GFP+细胞的百分比,这些GFP+事件的MFI垂直显示,如图所示。
(B) 用GAPDH特异性抗体从培养在Gal培养基中的UTR传感器构建转导T细胞的提取物中免疫沉淀GAPDH。用qRT-PCR分析与GAPDH结合的相关GFP mRNA。数据显示了一个实验的结果,该实验被归一化为ARE*突变IFN-γ3′UTR构建转导细胞。
(C) 用Scrambled或GAPDH siRNA转染T细胞。细胞孵育24小时,然后用流式细胞仪分析IFN-γ。垂直显示的是IFN-γ产生细胞事件的MFI。数据显示了七个独立实验的代表性结果。
(D) 通过qRT-PCR测定GAPDH的表达。加扰或GAPDH siRNA转染后GAPDH mRNA的相对表达归一化为加扰siRNA样本的GAPDH表达,p=0.0049。显示为平均值±SEM(误差线)的条形图是根据四个独立实验的数据生成的。
用GAPDH(GAPDH EX)和空载体控制逆转录病毒(EV)转导(E和F)T细胞,再刺激后用ELISA(F)检测细胞内IFN-γ(E)和IFN-γ分泌。点图显示来自CD4的IFN-γMFI+T细胞,是三个独立实验的代表;从一个实验中收集上清液(平均值±SEM)。
(G) 在重新刺激之前,将活化的T细胞暴露于冰块上0.01%皂苷中不同浓度的3-磷酸甘油醛(G3P)中10分钟。数据代表了三个独立实验的类似结果。另请参见图S5.
GAPDH结合半乳糖培养CD4 T细胞中IFN-γ3′UTR的AU-Rich区
以前曾报道过GAPDH与T细胞中IFN-γmRNA的AU-富集区结合的发现(Nagy和Rigby,1995年)因此,我们试图确定GAPDH蛋白是否与我们系统中IFN-γ3′UTR的AU-富集区结合。因此,我们用全长IFN-γ3′UTR或ARE*突变体构建物、免疫沉淀GAPDH转导半乳糖培养的CD4 Th1细胞,并通过qRT-PCR评估结合GFP mRNA转录物。我们发现,与表达ARE*突变体的细胞相比,用全长IFN-γ3′UTR构建物转导的细胞中与GAPDH相关的GFP mRNA增加了约10倍(). 总之,这些结果证实GAPDH蛋白与半乳糖培养的CD4 T细胞中IFN-γ启动子的AU-富集区结合。
GAPDH直接调节CD4 T细胞IFN-γ蛋白表达
为了评估GAPDH是否直接调节IFN-γ的产生,我们使用小干扰RNA(siRNA)方法来降低CD4 T细胞中GAPDH的表达。我们发现在表达GAPDH siRNA的细胞中,IFN-γ平均荧光强度与表达干扰siRNA的相比略有增加,但具有统计学意义(增加约10%,其中p=0.00009和n=7)(). 这一结果与siRNA介导的这种高度丰富的转录物的基因表达适度下降有关(). 为了进一步研究调节GAPDH表达如何影响IFN-γ的产生,我们创建了一个逆转录病毒构建物,以增强激活T细胞中GAPDH的表达。我们发现,与单独用空载体(EV)转导的T细胞相比,GAPDH的逆转录病毒表达降低了IFN-γ的产生(). 总之,这些结果表明,活化T细胞中GAPDH的总水平可以影响细胞因子的产生。
为了更牢固地在CD4 T细胞中GAPDH和IFN-γ的产生之间建立直接联系,并验证我们的观点,即除了GAPDH蛋白的总水平外,GAPDH参与糖酵解途径也会影响细胞因子的产生,我们采用了不同的方法并引入了GAPDH底物3-磷酸甘油醛(G3P)并评估其对细胞因子表达的影响。我们推断,因为GAPDH酶活性的催化位点与报道的mRNA结合的位点相同(Nagy等人,2000年),我们基本上可以通过向T细胞加载G3P来迫使GAPDH“参与”糖酵解途径。我们发现,引入G3P后,半乳糖培养的T细胞增加了IFN-γ的产生,而葡萄糖培养的细胞则没有(). 我们推测,由于内源性糖酵解通量,G3P在葡萄糖培养的T细胞中已经存在。我们还发现G3P的引入促进了半乳糖培养细胞中IL-2的表达(图S5A). 综上所述,这些结果支持GAPDH直接调节T细胞中IFN-γ的产生,并扩展了我们的研究结果,表明GAPDH的表达水平,除了其在糖酵解途径中的作用外,还可以影响细胞因子的产生。
此前已有研究表明,GAPDH可以作为驱动髓系细胞转录选择性翻译的蛋白质复合体的一部分存在(Mukhopadhyay等人,2009年). 这种复合物被称为GAIT(γ-干扰素(IFN-γ)激活的翻译抑制剂)复合物的形成是由IFN-γ信号诱导的(Mukhopadhyay等人,2009年). 因此,我们研究了GAPDH是否作为GAIT复合体的一部分存在于T细胞中。我们首先评估了GAIT调节因子IFN-γ信号是否影响T细胞中IFN-γ的表达。用已知可诱导髓系细胞GAIT的外源性IFN-γ浓度培养T细胞(Arif等人,2012年)也没有添加针对IFN-γ的中和抗体对T细胞表达IFN-γ产生任何影响(图S5B). 我们还从葡萄糖和半乳糖培养的细胞中免疫沉淀GAPDH,并通过蛋白质印迹评估其他GAIT复合蛋白与GAPDH的结合。我们没有发现证据表明,无论是在葡萄糖还是半乳糖中培养的T细胞中,GAIT复合蛋白EPRS、NSAP1或L13a与GAPDH的结合达到了任何可察觉的程度(图S5C). 虽然这些观察并不排除GAPDH可能作为GAIT的一部分存在于T细胞中,但它们表明这并不是GAPDH在我们系统中如何发挥作用的主要机制。
感染后CD4 T细胞GAPDH表达与IFN-γ产生的反向相关
为了研究GAPDH的总水平是否会影响体内IFN-γ的产生,我们用单核细胞增生李斯特菌并在7天后效应T细胞反应高峰时分析CD4 T细胞()这种病原体。我们测量了CD4 T细胞中GAPDH的表达,发现表达较高GAPDH水平的T细胞比表达较低GAPDH浓度的T细胞产生的IFN-γ要少得多()表明GAPDH表达水平决定了感染后T细胞中效应细胞因子的产生。鉴于PD-1是T细胞功能的负调节因子,其表达通常与T细胞在许多疾病状态下无法产生最佳水平的细胞因子(称为T细胞衰竭)有关(巴伯等人,2006年)我们还评估了高和低GAPDH水平细胞上PD-1的表达。我们发现,与表达低GAPDH的细胞相比,表达最高GAPDH水平的T细胞,其细胞因子产生量最低,PD-1的表达也最高(). 这些数据表明PD-1表达与有氧糖酵解的参与之间存在联系。
CD4 T细胞中GAPDH的表达决定了治疗后IFN-γ的产生单核细胞增生李斯特菌体内感染(A–C)示意图(A)显示小鼠感染了单核细胞增生李斯特菌7天后分析脾细胞GAPDH(B)和(C)以及IFN-γ(B)与PD-1(C)的表达。GAPDH阳性细胞中GAPDH表达的高(GAPDH hi)和低(GAPDH-lo)水平的门控,或PD-1表达,根据同型对照确定。IFN-γ+事件的平均荧光强度垂直显示,如图所示。数据(B)和(C)代表了至少两个独立的实验。
代谢表型测定CD4 T细胞PD-1的表达
为了进一步探讨PD-1与代谢的关系,我们测量了葡萄糖和半乳糖培养的CD4 T细胞PD-1的表达,发现半乳糖细胞表达较高水平的PD-1()这与它们在细胞因子产生方面的缺陷有关。接下来,我们评估了细胞在强迫呼吸后是否能够重新获得产生细胞因子的能力,并发现当使用有氧糖酵解(葡萄糖)的细胞被迫呼吸(半乳糖)时,他们产生IFN-γ的缺陷,在再次接触葡萄糖和参与有氧糖解后立即逆转(). 我们还发现,当CD4 T细胞在葡萄糖和半乳糖之间转换时,PD-1的表达水平直接与底物利用所指示的代谢适应相关,并且在其之前(). 总之,这些结果表明细胞代谢可以影响CD4 T细胞中PD-1的表达水平。
肿瘤细胞对T细胞施加营养限制抑制IFN-γ产生(A) 在含有葡萄糖(Glc)或半乳糖(Gal)的培养基中用抗CD3/28激活T细胞,并测量PD-1的表达。
(B) 活化的T细胞在含有Glc的培养基中培养,然后在Glc或Gal(Glc→Gal)中差异培养1天。然后在Gal中培养的细胞在Glc中再培养1天(Glc→Gal→Glc)。活化5天后测量IFN-γ的表达。显示了产生IFN-γ的细胞的频率,曲线图代表了三个独立的实验。
(C和D)如(B)所述,评估在指定培养基中培养的活化T细胞的OCR与ECAR的比率(C)和PD-1表达(D)。
(E) 活化的T细胞在含有Glc的培养基中培养,然后在Glc或Gal中进行差异培养,再培养1天(Glc→Gal(1d))或2天(Glc-Gal(2d))。然后在Gal中培养的细胞在Glc中再培养1天(Glc→Gal→Glc)。激活5天后测量PD-1表达。数据代表至少两个独立实验(A)、(B)和(D),数据表示为至少三个独立实验的平均值±SEM(误差条)(C)和(E)*p=0.0001。
在Th1极化条件下,用抗CD3/28激活(F和G)(F)T细胞3天。随后将细胞与等量的Th1细胞单独或50/50的EL4淋巴瘤细胞:Th1细胞混合培养过夜。对细胞进行再刺激(restim),并测量IFN-γ产生量(F)和培养基中的葡萄糖浓度(G)。在重新刺激时,要么什么都没有(没有变化),要么加入10 mM葡萄糖,要么加入新的培养基。数据(F)和(G)是三个独立实验的代表。数据(G)表示为平均值±SEM(误差线)。
(H) 显示了EL-4淋巴瘤细胞和Th1细胞的指示共培养比率的T细胞上PD-1表达的MFI。
数据以一个实验(n=6)的平均值±SEM(误差线)表示*p=0.0423**p=0.0001。另请参见图S6.
肿瘤细胞对T细胞施加可逆的营养限制,抑制细胞因子的产生
为了进一步证实营养限制引起的代谢适应如何影响T细胞效应器功能,我们使用了肿瘤细胞:CD4 T细胞共培养系统。我们单独或在EL-4淋巴瘤细胞:Th1细胞的50/50混合物中孵育相同数量的Th1细胞过夜,然后在4小时的再刺激后,我们测量细胞因子的产生。在重新刺激过程中,我们要么什么都不加(没有变化),要么添加10 mM葡萄糖,要么添加新的培养基。我们发现,随着肿瘤细胞密度的增加,CD4 T细胞减少IFN-γ生成的程度比单独与T细胞培养时更大(,顶行)。我们发现,干扰素-γ产生中的这种缺陷可以通过简单地添加葡萄糖来修复(,中排),并通过添加新媒体进一步增强(,底行)。重要的是,我们证实了当T细胞与肿瘤细胞共同培养时,培养基中的葡萄糖浓度实际上低于单独培养T细胞时的浓度()而且单独培养基中的葡萄糖浓度要比这两种条件中的任何一种都高(图S6). 我们还发现,随着共培养中肿瘤细胞数量的增加,CD4 T细胞上PD-1的水平增加(). 这些结果表明,淋巴瘤细胞对T细胞施加营养剥夺,限制了其产生效应细胞因子的能力。
讨论
增殖细胞中代谢途径的调节,以及有氧糖酵解如何促进代谢调节的信号机制,仍然缺乏了解(Loca-sale和Cantley,2011年;Lunt和Vander Heiden,2011年). 我们发现OXPHOS和有氧糖酵解可交替促进T细胞增殖和存活,但只有有氧糖解才能促进完全效应状态。具体来说,有氧糖酵解的参与/脱离允许T细胞IFN-γ生成的转录后调节。我们推测,这种调节机制的优势在于,它提供了一个代谢检查点,允许T细胞增殖,无论是否伴随细胞因子的产生。这种调节水平很重要,因为当不需要也不需要IFN-γ产生时,T细胞需要进行稳态增殖,而在免疫反应期间,当效应细胞因子的产生至关重要时,则需要进行抗原驱动的增殖。在这个模型中,CD28通过共刺激分子与病原体激活的抗原呈递细胞的结合,驱动有氧糖酵解,使T细胞达到完全效应状态(Frauworth等人,2002年).
用半乳糖而不是葡萄糖培养细胞使我们能够加强呼吸,同时提供T细胞活化和细胞因子产生的所有已知关键因素,即T细胞受体连接、共刺激和生长因子。通过仅改变所提供的糖底物,我们能够揭示有氧糖酵解是T细胞细胞因子生成的关键调节器。除了调节细胞因子的产生外,我们还发现PD-1的表达直接受到T细胞代谢的影响。这一发现暗示了一个有趣的想法,即在许多疾病状态下,T细胞衰竭的不同状态(其特征是效应器功能丧失和PD-1表达增强)基本上是由代谢约束而非慢性抗原刺激本身调节的(巴伯等人,2006年). 同样值得注意的是,在只能使用OXPHOS的半乳糖中培养细胞可能会模拟T细胞获取或获取营养物质的生理条件。这可能是由于缺乏适当的共刺激,缺乏生长因子信号,或其他快速增殖细胞的存在导致的直接营养限制,例如可能发生在肿瘤微环境中;我们的数据表明,在共培养中,肿瘤细胞施加营养限制,抑制T细胞产生细胞因子的能力,这说明了这种可能性。虽然我们的实验专门讨论了肿瘤细胞介导的葡萄糖剥夺对T细胞细胞因子产生的影响,但很明显,新的完整培养基甚至可以比在我们的T细胞:肿瘤细胞共培养模型中单独添加葡萄糖更能促进IFN-γ的产生。这可能是培养基中其他营养物质影响T细胞细胞因子产生的结果。例如,除了葡萄糖之外补充谷氨酰胺可能会为T细胞提供额外的底物,并使细胞因子表达进一步增加。如果是这样的话,这可能意味着T细胞在肿瘤微环境中除了单纯的葡萄糖消耗外,还受到了严重的营养损害。然而,肿瘤细胞也有可能产生抑制T细胞细胞因子生成的抑制因子,而替代培养基可以去除或稀释这些因子,从而使T细胞产生细胞因子。如果代谢产物或代谢副产物(如乳酸)的积累能够抑制细胞因子的产生,这也可能适用(Fischer等人,2007年). 目前正在研究这些类型的代谢限制在体内如何表现。
我们的结果表明,糖酵解酶GAPDH通过与细胞因子mRNA的3′UTR中富含AU的区域结合并减少蛋白质翻译,在转录后调节T细胞效应器功能。我们的数据表明,GAPDH介导的对T细胞效应器功能的抑制可能在多个水平上进行控制,例如该酶是否被其代谢功能或其在细胞内的表达水平所占据。众所周知,GAPDH的活性在很大程度上受到细胞氧化还原状态的影响,氧化还原介导的变化可以改变其功能,甚至改变其在不同细胞区室中的位置(Colell等人,2007年;Tristan等人,2011年). 很可能所有这些过程都有助于GAPDH如何在体内控制细胞因子的表达。虽然GAPDH在T细胞的细胞因子翻译中显然起着重要作用,但我们的研究并不排除,甚至可能表明,其他代谢酶控制效应细胞因子翻译或甚至细胞内其他翻译程序的可能性。这将继续是进一步调查的重点。
除了任何一种特定的代谢酶外,我们的结果更广泛地暗示有氧糖酵解通常是一种靶点,以专门控制T细胞效应器功能,而不是简单地控制反应性T细胞的存活和增殖。因此,开发用于抑制肿瘤中需氧糖酵解的抗癌药物可能被重新用于靶向自身反应性T细胞。这种方法可以通过分化的效应T细胞抑制细胞因子的产生,而不影响更广泛的T细胞室的存活、维持或增殖。此外,可以推测,一些肿瘤采用Warburg代谢并不是为了增殖本身,而是为了功能,甚至可能是为了促进生存或调节免疫反应的因子的最佳表达。不管这些发现的应用如何,他们都意外地揭示了有氧糖酵解的目的是转录后调节特定的细胞功能。
实验程序
小鼠和免疫
所有实验均使用C57BL/6小鼠。所有动物都按照圣路易斯华盛顿大学医学院的动物护理指南进行护理。减毒重组菌株单核细胞增生李斯特菌删除actA(LmOVA)用于免疫接种。小鼠腹腔内感染亚致死剂量为1×107结肠组织单位(CFU)。天真(CD44洛CD62L型你好)和效应器(CD44你好CD62L型洛)CD4细胞+从脾脏和淋巴结中分离和分选T细胞。
细胞培养
天真的CD4+T细胞通过MACS(Miltenyi Biotech)纯化并用于所有实验。如图所示,在非极化(10 U/ml的IL-2)或辅助性T细胞1型(Th1)极化条件下(10 U/ml的IL-2、10 ng/ml的IL-12和10μg/ml的抗IL-4抗体),用平板结合抗CD3(5.0μg/ml)和可溶性抗CD28(0.5μ/ml)抗体激活T细胞3至4天。对于EL4/CD4细胞共培养,活化T细胞与或不与EL4细胞共培育,细胞数量比率不同,如图所示。在细胞培养实验中,用含有10%透析血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM L-谷氨酰胺以及10 mM葡萄糖或10 mM半乳糖的RPMI培养基(无葡萄糖)培养细胞。在体外存活试验中,将细胞置于96-well板中,并加入指示的抑制剂,每天通过7-AAD排除法评估活细胞。在Moxi Z细胞计数器上测量细胞大小/体积。
流式细胞术和细胞内细胞因子染色
所有抗体均购自BD PharMinen或eBioscience。为了评估细胞增殖,在室温下用1μM CFSE荧光标记细胞8分钟。对于细胞内细胞因子染色,在37°C的葡萄糖或半乳糖培养基中刺激细胞4小时,在GolgiStop(BD PharMinen)、PMA(Sigma)和离子霉素(Sigma:。为了将3-磷酸甘油醛(G3P)引入细胞,将T细胞在冰上渗透10分钟,在含有葡萄糖或半乳糖的介质中加入0.01%的皂苷。然后清洗细胞并将其置于G3P存在的培养基中(再刺激前37°C下30分钟恢复时间),以便在测量细胞内细胞因子之前进行再刺激。流式细胞术的代表性曲线均在活细胞上进行门控,要么通过7-AAD排除,要么通过固定的水死细胞染色(Invitrogen)。
细胞外通量分析
在XF培养基(含有10mM或25mM葡萄糖或半乳糖、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的无缓冲RPMI 1640)中,在基础条件下,对线粒体抑制剂、1μM寡霉素、,和/或XF-24或XF-96细胞外通量分析仪上的100 nM鱼藤酮+1μM抗霉素A(Sigma)(Seahorse Bioscience)。
RT-PCR和蛋白质印迹
总RNA用RNeasy试剂盒(QIAGEN)分离,cDNA用高效cDNA逆转录试剂盒(Applied Bio-systems)合成。所有定量RT-PCR均采用Taqman法进行,GFP mRNA除外,GFP的mRNA采用SYBR绿色法进行测定。相关基因的mRNA表达归一化为β-肌动蛋白的表达。如前所述完成细胞裂解物制备、SDS-PAGE、电泳转移、免疫印迹和显影(Pearce等人,2009年). 用于西方分析的抗体购自Cell Signaling。根据BCA方法(Thermo Scientific Pierce)测定总蛋白浓度。根据方案对凝胶进行Sypro-Ruby(Molecular Probes,Inc.)染色。
核糖体分析
细胞在收获前用环己酰亚胺(Sigma)处理5分钟。如前所述,对等量的细胞进行裂解,并通过超速离心将细胞溶质提取物分离至7%–47%的蔗糖梯度(Miceli等人,2012年). 使用密度梯度系统(Teledyne ISCO,Lincoln,NE)在254 nm处持续监测吸光度,收集馏分。根据制造商的规范,使用RNAsolv(Omega Bio-Tek)从单体(40和60S)、二体(80S)和多体部分提取RNA。如上所述进行逆转录和qPCR。IFN-γ和IL-2转录物的数量是根据已知数量的亚克隆cDNA的连续稀释产生的标准曲线计算的。mRNA分布计算为所有收集部分中转录物总数的百分比。
RNA免疫沉淀
新鲜采集细胞,然后用1%甲醛处理10分钟使其交联。细胞重新悬浮并在多聚体裂解缓冲液中溶解。将裂解物预先清除并用兔抗GAPDH多克隆抗体(Sigma)免疫沉淀过夜。用蛋白A琼脂糖(Invitrogen)回收免疫复合物,用洗涤缓冲液洗涤五次,并用1%十二烷基硫酸钠和0.1 M NaHCO洗脱三用总裂解液和1%的洗脱部分进行western blot分析。为了进行交联逆转,将洗脱部分在42°C下培养1小时,然后在65°C下在200 mM NaCl和20μg蛋白酶K的存在下再培养2小时。然后使用RNAsolv从洗脱部分提取RNA,并如上所述通过qPCR测量mRNA表达。