甲型流感病毒的M2蛋白是一种由低pH值激活的四聚体质子选择性离子通道，其通道活性对病毒的生命周期至关重要。抗病毒药物金刚烷胺通过与M2质子通道的跨膜结构域（TMD）结合抑制病毒复制。1然而，超过90%的近期甲型流感病例发现M2蛋白上的S31N突变导致金刚烷胺耐药。2除了实验，三–9广泛的计算研究10–17已经对M2 TMD的结构进行了建模，并了解质子通道的电导和选择性的机制。H37的四分体是对通道电导和选择性至关重要的假定初级栅极的一部分。5,9最近通过固态核磁共振波谱测定了存在金刚烷胺时M2 TMD的结构。18在这里，我们报道了一项旨在模拟金刚烷胺与M2 TMD结合的研究。我们的结果提供了金刚烷胺抑制M2的机制性见解，以及导致金刚烷碱耐药性的突变的可能解释。
我们将金刚烷胺分子模拟成在金刚烷烷胺存在下测定的M2 TMD结构（PDB代码2h95；18参见“仿真系统设置”和支持信息中的图S1). 金刚烷胺最初位于S31附近，与该残基在金刚烷碱耐药突变星座中的中心位置一致（在V27、A30、S31和G34上）。三然后在M2 TMD上以金刚烷胺结合形式和载脂蛋白形式（后者基于PDB代码1nyj中发现的载脂蛋白结构）进行长达15 ns的并行分子动力学模拟19).
我们在载脂蛋白和金刚烷胺结合模拟中监测了M2 TMD通道孔的半径。在这两个模拟中，数据显示存在两个阻塞，一个朝向通道入口，另一个朝向出口(;支持信息图S2). 后者在前后达到顶峰z（z）=−10º，主要由四个W41残基的侧链和H37的侧链接壤，因此，它可以被识别为主栅极。另一个堵塞发生在z（z）=+10º，在载脂蛋白模拟中与V27残基的侧链相邻。这个“次级”门是由V27侧链的物理遮挡引起的；一个辅助因素可能是由于缺少氢键结合伙伴，水分子从该区域消失。在金刚烷胺结合模拟中，这种阻塞被结合的金刚烷烷胺延伸到TMD的中心。
在最后10ns的模拟中，apo和金刚烷胺结合形式的M2 TMD的孔径。孔半径值，由HOLE程序计算32沿通道的步长为0.5°z（z）-轴（平行于四聚TMD的对称轴）由从黑色（0Å）到白色（≥3Å）的光谱表示。的起源z（z）-轴位于C的中心α四个G34残基的原子；V27（黄色）、S31（橙色）、H37（绿色）和W41（蓝色）的侧链显示为杆。
水线是质子电导机制的重要组成部分。20我们通过识别孔隙中水分子之间的氢键来确定在我们的模拟中是否形成了连续的水线。在apo模拟期间()在大多数情况下，水线都被主闸门和副闸门打破；偶尔，它会被其中一个人打破；只有极少数情况下观察到连续的水线。事实上，在apo模拟中，水线大部分时间都被二次门打破，这可能部分解释了为什么即使在激活时，M2通道的打开概率也很低。21在金刚烷胺结合模拟中()二次闸门和结合的金刚烷胺形成的连续堵塞总是会破坏水管。
载脂蛋白（a–d）和金刚烷胺结合物（e–f）模拟的代表性快照显示通道孔隙中的水线断裂。水和金刚烷胺呈球形（氢：白色；碳：青色；氮：蓝色；氧：红色）；V27（黄色）、S31（橙色）、H37（绿色）和W41（蓝色）的侧链显示为杆。
通过确定药物分子和通道蛋白之间的接触，分析金刚烷胺与M2 TMD的特异性相互作用。发现两个残基S31和A30对金刚烷胺的结合位点贡献最大(支持信息图S3). 三个相邻的残基V27、I33和G34偶尔与结合药物分子接触。在典型快照中(支持信息图S4; 另请参见)金刚烷胺的金刚烷基团呈近球形，由C包裹β; A30和Oγ位于四个V27残基的非极性环的正下方。在底部，金刚烷胺的胺形成了一个或多个氢键，其伙伴在S31羟基、A30主链羰基和水分子之间交替（金刚烷碱基本上一直与至少一个水分子接触）。因此，金刚烷胺通常在M2 TMD内部向下(支持信息图S5)，这与脂质双层内金刚烷胺的取向相反。22在最近的分子动力学模拟中，17A29周围的金刚烷胺结合被作为“初步”结果呈现，没有进一步的细节。
Duff等人的中子衍射数据。23直接支持我们的观察，即金刚烷胺的结合位点是由S31和A30形成的。同样的数据也表明，金刚烷胺的取向是各向异性的，并暗示着向下的取向，如我们的模拟所示。在我们的模拟中，金刚烷胺和V27之间直接接触的可能性很低，这与核磁共振数据一致，表明该残基的偶极分裂和化学位移不受金刚烷碱结合的影响。24作为在我们的模拟中，金刚烷胺通常通过三层水分子与H37分离。这种分离与之前模拟的金刚烷胺和H37之间的直接氢键形成对比25但核磁共振数据表明H37 N的各向同性化学位移δ1绑定amandatine后保持不变。18
在我们的模拟中发现的金刚烷胺结合位点为Astrahan等人获得的M2 TMD金刚烷烷胺亲和力的突变效应提供了合理的解释。26他们发现赋予金刚烷胺耐药性的A30T和S31N突变消除了金刚烷烷胺结合。在这两个位置中的任何一个位置用更大的侧链替换都会减少假定的结合位点的体积；额外的极性基团也会降低与金刚烷胺非极性部分的相互作用。Astrahan等人还发现，V27（到G、A、S或T）的突变也赋予金刚烷胺抗性，但仍保留金刚烷烷胺结合。金刚烷胺可能以不同的方式与V27突变体结合。或者，金刚烷胺仍然以类似的方式结合，但二级门不再延伸堵塞。我们注意到S31对应于B型流感病毒M2蛋白中的F。粗大侧链的取代可能会显著降低金刚烷胺结合亲和力，8这反过来可以解释金刚烷胺不能抑制M2通道活性和B型流感病毒的复制。27
总之，我们的分子动力学模拟表明V27的四分体形成了一个次级栅极。当金刚烷胺结合时，形成一个扩展的阻塞，导致水管破裂和质子通道失活。我们的模拟结果得到了大量实验观察的支持，并为导致金刚烷胺耐药性的突变提供了合理的解释。由于M2蛋白的过度表达会对细胞内蛋白质转运产生有害影响28（可能表明超通道活性是不受欢迎的）并且已知一些V27突变会增加质子电导，29很容易认为，V27形成的二次栅极对减弱M2质子通道的活性起着重要作用。
在本文综述期间，发表了通过X射线晶体学和溶液核磁共振测定的M2 TMD结构。30,31X射线结构证实了我们在MD模拟中观察到的最重要特征(支持信息图S6). 特别是，河道孔隙“在Val27附近最为狭窄”，这为我们的二级闸门建议提供了直接支持。在我们的模拟中发现的金刚烷胺的位置和方向也与X射线晶体学测定的位置和方位一致。在核磁共振结构中，金刚乙胺（金刚乙烷的类似物）位于外部，紧邻残基L40、I42和L43。这些残基的突变不影响金刚烷胺结合。6这种位置受到金刚烷胺的青睐，而它与脂质双层结合。22
