氯硝柳胺通过抑制STAT3在非小细胞肺癌中克服埃洛替尼获得性耐药

细胞系和细胞培养

HCC827、H1650和H1975于2010年直接从美国型培养物收藏中心（ATCC，Manassas，VA）购买，并用10%胎牛血清保存在RPMI 1640中。这些细胞系用于所述实验，无需进一步验证。

获得性埃洛替尼耐药非小细胞肺癌细胞系的建立

E类罗替尼-第页通过将亲代HCC827细胞暴露于3.5μM厄洛替尼2个月，然后按照所述的5天给药和5天不给药交替暴露于7.5μM厄洛替尼1个月，建立了一个稳定的HCC827/ER细胞系(23). 然后用含有1μM埃洛替尼的培养基对耐药细胞群进行常规培养。即使在无埃洛替尼的培养基中长时间培养6个月，耐药表型仍保持不变，这表明耐药表型是不可逆的(23). 我们没有分离出纯单克隆。HCC827/ER细胞的混合群体用于进一步研究。

细胞裂解物的制备和Western blot

用冷PBS清洗细胞，并将其重新悬浮在含蛋白酶抑制剂混合物组I的冰镇EBC缓冲液（0.5%Nonide P-40、50mM Tris、pH 7.6、120 mM NaCl、1 mM EDTA和1 mM-β-巯基乙醇）中。在4°C下，通过14000×g的超声和离心进行细胞裂解15分钟，收集所得上清液作为总细胞裂解液。如前所述，通过Western blot分析蛋白质表达(24).

定量逆转录PCR（RT-PCR）

对于定量逆转录-PCR，纯化总RNA，并使用随机六聚体和SuperScript III（Invitrogen）进行逆转录。利用ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems）和特异性引物，使用2×SYBR绿色PCR混合物（Bio-Rad，CA）进行扩增：人类Bcl2：正向，5′-GGT GGA GGA GCT CTT CAG G-3′和反向，5′-ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC-3′；人类Bcl-XL：正向，5′-ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC-3′和反向，5′-TGG GAT GTC AGG TCA CTG AA-3′；人MCL-1：正向，5′-TAA GGA CAA AAC GGG ACT GG-3′和反向，5′-ACC AGC TCC TAC TCC AGC AA-3′，β-actin：正向，5'-TCA GGA TCC ACG TGC TTG TCA-3′；反向，5′-TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC TTT GA-3′。以β-actin为内标，根据比较Ct法进行相对基因表达定量。用7500 v2.0.5软件程序分析基因表达的量化，并用2-ΔΔCt法进行量化。数据表示三个独立实验的平均值±SD。

RNA干扰

慢病毒pSIH1-puro-STAT3 shRNA和pSIH1-puro-control shRNA来自Addgene（马萨诸塞州剑桥）。控制shRNA质粒-A编码一个扰乱的shRNA序列，该序列不会导致任何细胞信息的特定降解。对照shRNA发夹序列：CCT AAG GTT AAG TCG CCC TCG CTC GAG CGA GGG CGA CTT AAC CTT AGG。STAT3 shRNA发夹序列：GAT CCG CAT CTG CCT AGA TCG GCT ATT CAA GAG ATA GCC GAT CTA GGC AGA TGT TTT TTG。PTPMeg2 shRNA（sc-44670-SH）及其对照shRNA（sc-108060）购自圣克鲁斯生物科技公司（加州圣克鲁斯）。发夹序列：GAT CCC TAG AGT GAA GCT AAC TCA AGA GAT TGT TAG CTT CAC TCT AGT TTA。对于假病毒的产生，使用纳米汁转染试剂盒（EMD Chemical，Inc.）将STAT3 shRNA或PTPMeg2 shRNA与慢载体包装质粒混合物（System Biosciences，CA）共转染到293FT细胞中，如所述(25). 48h后，以20000×g离心收集含病毒培养基。将细胞在含有聚brene（8ug/ml）的培养基中感染24h，然后使用1ug/ml嘌呤霉素选择稳定的阳性克隆。

磺基罗丹明B（SRB）测定

如前所述，使用磺胺基罗丹明B（SRB）试验评估厄洛替尼和氯硝柳胺对细胞生长的抑制作用(26,27). 电池（6×10^三-8×10^三)在完整的RPMI 1640培养基中，使用96 well平板在三个孔中培养。隔夜生长后，用厄洛替尼、氯硝柳胺或其组合处理细胞72小时。生长抑制程度通过以下等式计算：生长抑制率=（1-At/Ac）×100，其中At和Ac分别表示处理培养物和对照培养物中的吸光度，如前所述(28).

集落形成分析

如前所述，在6孔板中对塑料表面进行集落形成分析(23). 对HCC827和HCC827/ER细胞进行胰蛋白酶化（单细胞悬浮液），并将其置于6孔板中（1000个细胞/孔）。用厄洛替尼（0.1μM）处理细胞，连续暴露10天（每3天补充一次厄洛替尼基培养基）。处理后，用结晶紫（0.1%甲醇溶液）对培养板进行染色。如前所述，在菌落计数之前，获得平板的数字图像作为永久记录(29).

肺癌异种移植和治疗

埃默里大学动物护理和使用委员会批准了动物实验。从哈兰购买6周龄的Nu/Nu裸鼠，并将其置于无致病条件下的微型隔离器笼中。通过注射5×10提高异种移植物⁶HCC827和HCC827/ER细胞在平衡盐溶液中注入裸鼠腹部皮下组织。允许肿瘤生长到平均体积250毫米^三开始治疗前(30). 将荷瘤小鼠随机分为四个治疗组（每组8只），如下所示：(1)车辆控制（0.5%二甲基亚砜，100μl/d，i.p.）；(2)厄洛替尼（40mg/kg/d，静脉注射）；(三)氯硝柳胺（20mg/kg/d，静脉注射）；(4)厄洛替尼（40mg/kg/d，静脉注射）+氯硝柳胺（20mg/kg/d，静脉滴注）。每两天用卡尺测量一次肿瘤体积，计算公式为：V=（L×W²)/2（L：长度；W：宽度）如所述(31). 在连续32天的治疗后，通过吸入CO2杀死小鼠。收集的肿瘤用于Western blot、免疫组织化学（IHC）或QD-IHF分析。

免疫组织化学（IHC）分析

使用兔抗人活性caspase 3抗体对肿瘤组织进行IHC染色，如下所述(30). 简单地说，将收获的肿瘤包埋在石蜡中并切割成4μm的切片。按照制造商的标准方案（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories），使用R.T.U.Vectastain试剂盒进行染色。用2.5%的正常马血清封闭组织切片10分钟。然后用兔抗人活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3抗体（稀释1:50）在4°C下孵育过夜。清洗后，将组织切片与抗兔IgG HRP二级抗体孵育10分钟。载玻片用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）（Vector Laboratories）染色，用苏木精（Vectors Laboratory）复染，脱水，用二甲苯处理，然后装裱。使用奥林巴斯BX41显微镜（奥林巴斯美国，梅尔维尔，纽约）检查所有载玻片并拍摄代表性照片。使用基于染色细胞百分比和染色强度的免疫核心对活性caspase 3的IHC染色进行半定量测定(32).

基于量子点的免疫组织荧光（QD-IHF）及其信号量化

如前所述，进行QD-IHF以测量肿瘤组织中的pSTAT3和pEGFR(33-35). 简单地说，将采集的肿瘤包埋在石蜡中，并切成4μm的切片。脱蜡和复水后，用柠檬酸（10 mmol/L，pH 6.0）在微波中加热10分钟，进行抗原回收。在一级抗体孵育之前，用2.5%的正常马血清封闭组织切片10分钟。将兔抗人pEGFR和鼠抗人p-STAT3抗体以1:50的稀释度混合在含有2.5%马血清的1×PBS中。使用正常兔IgG作为阴性对照。组织切片与p-EGFR和p-STAT3抗体的混合溶液在4°C下培养过夜。用1×PBS洗涤三次后，向载玻片中添加QD705山羊抗鼠IgG结合物（绿色）和QD605山羊抗兔IgG偶联物（红色）二级抗体，并在37°C下进一步孵育1h。用1×PBS清洗载玻片三次，用DAPI复染，在黑暗条件下安装并保存在4°C下。如前所述进行QD成像和量化程序(35). Nuance™荧光显微镜系统（CRi与马萨诸塞州霍普金顿的PerkinElmer公司Caliper合并）用于量化QD-IHF信号。所有立方图像文件均从肿瘤组织载玻片中收集，波长间隔为10 nm，420-720 nm，每波长间隔自动曝光时间为200～400倍放大倍数。使用带有长波长带通滤波器的立方体可以传输420 nm以上的所有发射波长。在建立量子点光谱库并分解图像立方体后，获得了分离和组合的量子点图像。每个组织片取10个方块。为了准确量化QD信号，去除了背景信号。通过选择每个立方体上的肿瘤区域，通过Nuance成像软件（Caliper/PerkinElmer）量化，获得每个QD信号的平均值。获得10个立方体的平均读数，作为两个QD信号的每个组织载玻片的总平均信号计数。

RNA干扰（RNAi）特异性敲除PTPMeg2导致人类肺癌细胞STAT3/Bcl2/Bcl-XL生存途径激活

为了从遗传学上证明PTPMeg2是否调节STAT3/Bcl2/Bcl-XL生存途径，使用PTPMeg2-shRNA进行RNA干扰，从HCC827细胞中去除PTPMeg2.与表达对照shRNA的细胞相比，表达PTPMeg2-shRNA的胞体PTPMeg-2蛋白表达减少了95%以上(图2A). PTPMeg2的特异性敲除导致pSTAT3、Bcl2和Bcl-XL水平升高(图2A)与生理STAT3磷酸酶的鉴定一致(21). 重要的是，通过PTPMeg2的特异性缺失上调STAT3/Bcl2/Bcl-XL通路，导致HCC827细胞对埃洛替尼产生显著耐药性(图2B).

在单独的窗口中打开

图2

HCC827细胞PTPMeg2的耗尽导致pSTAT3和Bcl2/Bcl-XL的上调。A、 PTPMeg2 shRNA或对照shRNA转染HCC827细胞。Western blot分析pSTAT3、Bcl-XL、Bcl2和Mcl-1的表达水平。B、 表达PTPMeg2 shRNA或对照shRNA的HCC827细胞用增加浓度的埃洛替尼处理48小时。通过SRB分析测定细胞生长。数据为三个独立实验的平均值±SD。

埃洛替尼耐药与STAT3/Bcl2/Bcl-XL生存途径激活相关

HCC827细胞系含有埃洛替尼敏感突变1(即Del E746-A750），无抗性突变2(即.T790M）(37). 这使得HCC827细胞对厄洛替尼和其他EGFR-TKI（如吉非替尼）治疗高度敏感(23,37). 为了证明厄洛替尼诱导的STAT3/Bcl2/Bcl-XL信号通路的激活是否与厄洛替尼耐药性相关，一种获得性厄洛替宁耐药的肺癌细胞系(即HCC827/ER）按照“方法”中的描述建立(23). SRB和集落形成分析证实HCC827亲代细胞敏感，但HCC827/ER细胞对埃洛替尼耐药(图3A、B). 有趣的是，与HCC827细胞相比，HCC827/ER细胞中pSTAT3、Bcl2和Bcl-XL水平升高(图3C). 实时PCR证实HCC827/ER细胞中Bcl2和Bcl-XL蛋白水平的增加是由于Bcl-2和Bcl-XL mRNA水平的增加所致(图3D)这表明Bcl2/Bcl-XL水平升高是STAT3转录调控的结果。重要的是，在HCC827/ER细胞中也观察到STAT3磷酸酶PTPMeg2水平降低(图3C)，这可以解释为什么与HCC827亲代细胞相比，在HCC827/ER细胞中观察到pSTAT3水平升高。这些结果强烈表明，厄洛替尼耐药可能是由于人类肺癌细胞PTPMeg2/STAT3/Bcl2/Bcl-XL信号通路的改变引起的，至少部分是这样。众所周知，EGFR的二次突变与埃洛替尼耐药性有关(6,38). 对HCC728和HCC827/ER细胞基因组DNA的DNA测序分析表明，在这两个细胞系中均未观察到埃洛替尼二次耐药突变（如T790M、T854A、L747S和D761Y），这表明HCC827/ER细胞获得厄洛替尼耐药性并不是该系统中这些继发性基因突变的结果。然而，我们不能排除HCC829/ER细胞中可能发生的其他可能的遗传变化。

在单独的窗口中打开

图3

PTPMeg2的降低和pSTAT3和Bcl2/Bcl-XL水平的升高与人类肺癌细胞对厄洛替尼的耐药性有关。A、 增加厄洛替尼（Erlo）浓度处理HCC827细胞和获得的厄洛替尼耐药HCC827/ER细胞48小时。采用SRB法分析细胞生长情况。B、 用厄洛替尼（Erlo，1μM）处理HCC827和HCC827/ER细胞，并按照“方法”中的描述进行集落形成分析。C、 用Western Blot分析pSTAT3、PTPMeg2、Bcl2、Bcl-XL等。D、 用RT-PCR分析Bcl2、Bcl-XL和Mcl-1的mRNA水平。

氯硝柳胺抑制STAT3阻断厄洛替尼激活的STAT3/Bcl2/Bcl-XL通路并逆转人肺癌细胞对厄洛替尼可的耐药性

我们的研究结果表明，埃洛替尼激活STAT3/Bcl2/Bcl-XL通路有助于人类肺癌细胞对埃洛替尼产生耐药性(图1和​和3）。三). 为了确定STAT3/Bcl2/Bcl-XL通路的抑制是否克服埃洛替尼耐药，在没有或存在浓度增加的氯硝柳胺（STAT3抑制剂，0.1～2μM）的情况下，用埃洛替尼布（0.1μM）处理HCC827和HCC827/ER细胞72小时(图S2). 结果表明，氯硝柳胺阻断厄洛替尼诱导的HCC827或HCC827/ER细胞中的STAT3磷酸化，并随后降低Bcl2/Bcl-XL(图4A). 在功能上，氯硝柳胺不仅使HCC827细胞对厄洛替尼敏感，而且还逆转了HCC827/ER细胞对厄洛替尼的耐药性(图4B).

在单独的窗口中打开

图4

用氯硝柳胺处理细胞可阻断厄洛替尼诱导的STAT3/Bcl2/Bcl-XL活化并逆转厄洛替尼可抵抗。A、 在没有或存在氯硝柳胺（Niclo）浓度增加的情况下，用厄洛替尼（Erlo，0.1μM）处理HCC827和HCC827/ER细胞48小时。用Western Blot分析pSTAT3、Bcl2、Bcl-XL和Mcl-1。B、 用不同浓度的厄洛替尼（Erlo）、氯硝柳胺（niclosamide，0.5μM）或其组合处理HCC827和HCC827/ER细胞48小时。通过SRB分析评估细胞生长。

特异性敲除STAT3恢复肺癌细胞对厄洛替尼的敏感性

为了测试STAT3生存途径是否是埃洛替尼耐药所必需的，通过STAT3 shRNA的RNA干扰，从HCC827和HCC827/ER细胞中去除STAT3(图5A). STAT3 shRNA对STAT3表达的影响具有高度特异性，对照shRNA无影响(图5A). 重要的是，STAT3沉默下调Bcl2和Bcl-XL(图5A). SRB实验表明，通过RNA干扰去除STAT3不仅可以逆转HCC827/ER细胞对埃洛替尼的耐药性，而且可以使HCC827细胞对埃罗替尼敏感(图5B). 这些发现表明，STAT3/Bcl2/Bcl-XL生存途径可能参与了人肺癌细胞对埃洛替尼的从头抵抗，并且是获得性耐药发展所必需的。

在单独的窗口中打开

图5

STAT3的特异性缺失逆转埃洛替尼耐药性。A、 STAT3 shRNA或对照shRNA转染HCC827细胞。Western blot分析STAT3、Bcl-XL和Bcl2的表达水平。B、 用厄洛替尼（Erlo）处理表达STAT3 shRNA或对照shRNA的HCC827细胞48小时。通过SRB分析测定细胞生长。

氯硝柳胺克服获得性埃洛替尼耐药性体内实现长期无瘤生存

测试氯硝柳胺是否能克服肺癌获得性埃洛替尼耐药性体内用厄洛替尼（40mg/kg/d）处理来自HCC827细胞或HCC827/ER细胞系的异种移植物，每组8只小鼠(10)，氯硝柳胺（20mg/kg/d）(39)或按照“方法”中的说明，将其组合使用32天。对照组给予0.5%二甲基亚砜载体治疗。我们观察到，来源于HCC827细胞的肺癌异种移植物对埃洛替尼治疗非常敏感，肿瘤明显缩小，而来源于HCC827/ER细胞的异种移植物对埃洛替尼治疗具有耐药性，肿瘤体积与载体治疗的对照组相当(图6A). 相比之下，氯硝柳胺和厄洛替尼联合应用可显著抑制厄洛替尼耐药HCC827/ER细胞衍生的肺肿瘤，表明氯硝柳胺可逆转获得性厄洛替宁耐药，并恢复HCC827/ER异种移植物对厄洛替nib治疗的敏感性体内(图6A). 有趣的是，用埃罗替尼和氯硝柳胺联合治疗的八只HCC827/ER异种移植小鼠中，有两只表现出完全的肿瘤消退(图S3)截至本报告发布之日（自第32天治疗结束后超过8个月），这种情况持续存在。确定厄洛替尼单独或联合氯硝柳胺是否通过细胞凋亡抑制肺癌体内IHC对采集的肿瘤组织的代表性样本进行活性caspase 3分析，如前所述(30). 结果表明，厄洛替尼仅能增强HCC827肿瘤组织中caspase 3阳性细胞的活性，而对HCC827/ER肿瘤组织无增强作用(图6B). 相比之下，这两种药物的联合使用增加了HCC827和HCC827/ER肿瘤组织中活性caspase 3阳性细胞(图6B). 肿瘤裂解物的Western blot分析显示，用氯硝柳胺治疗HCC827和HCC827/ER小鼠也能阻断STAT3磷酸化，与Bcl2和Bcl-XL的降低相关(图6C).

在单独的窗口中打开

图6

厄洛替尼和氯硝柳胺联合使用克服获得性厄洛替尼布耐药性体内A、携带HCC827或HCC827/ER肺癌异种移植物的小鼠接受载体对照、厄洛替尼（厄洛，40mg/kg/d）、氯硝柳胺（尼洛，20mg/kg/d）或其联合治疗32天。每组包括8只小鼠。每2天测量一次肿瘤体积。32天后，处死小鼠，切除肿瘤并进行分析。拍摄了具有代表性的肿瘤照片。B、 实验结束时，通过IHC染色分析肿瘤组织中的活性caspase 3，并按照“方法”中的描述进行量化。C、 Western blot分析不同治疗组肿瘤组织中pEGFR、pSTAT3、Bcl2和Bcl-XL的表达水平。

肿瘤组织中pEGFR和pSTAT3的量子点免疫组织荧光分析

QD-IHF技术对于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中多个生物标记物的同时和同时免疫染色是一种有价值的工具，从而允许在同一组织载玻片上同时定量几个生物标记物(33-35,40). 为了证实厄洛替尼抑制EGFR是否增强pSTAT3，以及氯硝柳胺是否可以抑制厄洛替尼诱导的肿瘤组织中STAT3磷酸化，使用具有两种不同发射波长的一级抗体和QD结合的二级抗体，在同一组织切片上用QD-IHF同时分析pEGFR和pSTAT3(即.QD705（绿色）和QD605（红色））。在确定QD光谱库并分解立方图像后，获得了分离和组合的QD图像。HCC827和HCC827/ER异种移植物的QD图像显示，pEGFR定位于细胞膜，pSTAT3定位于细胞核(图7A、B). Erlotinib治疗下调HCC827和HCC827/ER异种移植物中pEGFR并增加pSTAT3(图7A、B). 重要的是，厄洛替尼增强的pSTAT3可被氯硝柳胺在HCC827和HCC827/ER肿瘤组织中抑制(图7A、B).

在单独的窗口中打开

图7

肿瘤组织中pEGFR和pSTAT3的QD-IHF分析。A和B、HCC827或HCC827/ER异种移植物接受载体对照、厄洛替尼（厄洛，40mg/kg/d）、氯硝柳胺（尼洛，20mg/kg/d）或其联合治疗32天。实验结束时，通过QD-IHF分析肿瘤组织中的pEGFR和pSTAT3，并如“方法”中所述进行定量。

我们感谢Anthea Hammond对手稿的专业编辑。

赠款支持：这项工作得到了NCI、美国国立卫生研究院R01CA112183（X.Deng）和R01CA136534（X.邓）以及空乘医学研究所临床创新奖（X.Teng）的支持。