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临床投资杂志。2004年4月1日；113(7): 1040–1050.
数字对象标识：10.1172/JCI20465
预防性维修识别码：PMC379325型
PMID：15057311

VEGF-A通过巨噬细胞募集刺激炎症新生血管的淋巴管生成和血管生成

克劳斯·柯西芬,1 陆晨,1 莱昂纳多·博尔赫斯,1 大卫·杰克逊,2 曹景泰,三 泽斯劳·拉齐耶夫斯基,三 帕特里夏·德阿莫尔,1 M.Reza Dana先生,1 斯坦利·威根,三和J.韦恩·斯特雷林1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

淋巴血管生成是肿瘤转移和移植增敏的重要初始步骤，由VEGF-C和-D对VEGFR3的作用介导。相反，VEGF-A结合VEGFR1和VEGFR2，是一种重要的血管生成因子。我们使用一种新的模型重新评估了VEGF-A在淋巴管生成中的潜在作用，该模型在正常无血管角膜中诱导淋巴管生成和血管生成。VEGF Trap是一种基于受体的融合蛋白，可结合和中和VEGF-a，但不结合VEGF-C或-D，给药后可完全抑制血管生成和LYVE-1的生长+损伤后的淋巴管。此外，VEGF-A转基因小鼠的淋巴管生成和血管生成均显著减少164/164或VEGF-A188/188（每一种都只表达三种主要VEGF-A亚型中的一种）。由于VEGF-A对巨噬细胞具有趋化性，我们在这里证明炎症角膜中的巨噬细胞释放淋巴管生成性VEGF-C/VEGF-D，因此我们评估了巨噬细胞募集在VEGF-A-介导的淋巴管生成中发挥作用的可能性。损伤前，所有骨髓衍生细胞的全身耗竭（通过照射）或角膜中巨噬细胞的局部耗竭（使用氯膦酸盐脂质体）均显著抑制血管生成和淋巴管生成。我们的结论是，通过提供/放大病理性血管生成和淋巴管生成所必需的信号，VEGF-A招募单核细胞/巨噬细胞在诱导炎症性新生血管中起着关键作用。

介绍

血管生成是原有血管新生的产物，是肿瘤生长、慢性炎症疾病和大多数致盲性眼病的重要致病因素（综述见参考文献。1). 为了清楚地将其与淋巴管生成过程区分开来，我们将血管新生称为血管生成（HA）。近年来，人们对HA和淋巴管生成的刺激物和抑制剂有了很多了解，VEGF家族成员已成为这两个过程的主要介导者（有关综述，请参阅参考文献。2–4). VEGF生长因子家族由五个成员组成，它们结合并激活三种不同的受体。VEGF-A与VEGFR1和VEGFR2结合，胎盘生长因子（PlGF）和VEGF-B仅与VEGFR1结合。VEGF-C和VEGF-D与VEGFR2和VEGFR3结合（审查见参考。2).

VEGF-A已明确成为主要负责正常血管生成和HA的家族成员。VEGF-A对血管内皮细胞的直接作用主要通过VEGFR2结扎介导，而直到最近，VEGFR1被认为主要介导抑制或诱饵功能（综述见参考文献。1,2). VEGF-A在多种形式的病理性血管生成中也发挥着主导作用，包括实体瘤快速生长所必需的血管生成（综述见参考文献。1,2). 因此，目前正在开发的许多用于治疗癌症的抗血管生成药物都以VEGF-A或VEGFR2为靶点（综述见参考文献）。2,三; http://www.cancer.gov网站).

与HA相反，淋巴管生成被认为主要由VEGF-C和-D与其高亲和力受体VEGFR3的结合介导（综述见参考文献。4). 与HA一样，淋巴管生成作为肿瘤发病机制中的一个重要初始步骤，近年来受到了广泛关注（综述见参考文献。4; 参考文献。5–7). 研究表明，在动物模型和人类肿瘤中，瘤内和/或瘤周淋巴管生成增加了转移的风险（综述见参考文献）。4). 淋巴管生成生长因子VEGF-C和-D的释放与CD14的循环亚组分有关+，VEGFR3表达的单核细胞被招募到肿瘤生长部位并在肿瘤生长部位激活(8). 针对VEGFR3介导的信号传导的抗淋巴管生成策略已被报道可抑制淋巴管生成并提高转移癌动物模型的生存率(5).

如上所述，VEGF-C和-D也与VEGFR2结合，在某些情况下表现出血管生成活性(9,10). 相反，VEGF-A被认为仅作为一种血管生成因子发挥作用，即在角膜中放置VEGF-A-浸渍颗粒(11)，皮肤中VEGF-A过度表达(12–14)和VEGF-A应用于绒毛尿囊膜(15)据报道，所有这些都会导致HA，但不会导致淋巴管生成。然而，最近有研究表明，与血液内皮细胞一样，淋巴内皮细胞也表达VEGFR2，并且VEGF-A能有效促进其体外存活(16–19). 此外，兔耳中VEGF-A的腺病毒过度表达导致增生的“巨大”淋巴管的形成，进一步表明VEGF-A有可能刺激某些形式的淋巴管生成(20).

由于几种靶向VEGF-A的抗血管生成药物已经进入临床试验，这些药物是否也会影响淋巴管生成的问题变得尤为重要(4–7). 除了促进肿瘤转移外，淋巴管生成的诱导还与正常无血管角膜免疫状态的终止有关。在这些条件下，角膜移植存活率显著下降，因此必须确定以VEGF-A为靶点的抗血管生成策略是否也会干扰角膜淋巴管生成（综述见参考文献。21).

为了解决这个问题，并解决关于VEGF-A在淋巴管生成中作用的相互矛盾的发现，我们首先描述了角膜炎症新生血管的新模型，以确定HA是否伴有淋巴管生成(22,23). 然后，我们评估了使用VEGF Trap选择性阻断内源性VEGF-A（和PlGF）作用的效果(24)或通过使用只表达VEGF-A亚型164或188（VEGF-A-164/164或VEGF-A188/188）(25,26). 最后，众所周知，VEGF-A可以招募表达VEGFR1的单核细胞/巨噬细胞(27,28)已知其不仅释放血管生成因子，还释放淋巴管生成生长因子(8)在我们的模型中，由于VEGF介导的HA和淋巴管生成伴随着显著的炎症反应，我们评估了（a）骨髓源性细胞的全身耗竭和（b）巨噬细胞的局部耗竭对角膜损伤后淋巴管生成和HA的影响。

方法

老鼠和麻醉。

之前已经描述过在瑞士韦伯斯特背景下只表达VEGF-A亚型164或188的敲除小鼠的产生(25,26). 6–8周龄的BALB/c小鼠用于所有未涉及敲除小鼠的实验（美国纽约州日耳曼镇塔科尼农场）。所有受检小鼠均在8至12周龄之间，并按照视力和眼科研究协会关于在眼科和视力研究中使用动物的声明进行治疗。使用氯胺酮和木聚嗪的混合物（分别为120 mg/kg体重和20 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。

缝合诱导的炎症性角膜新生血管小鼠模型。

如前所述，使用缝合诱导的炎症性角膜新生血管（CNV）小鼠模型(29). 简单地说，将直径为2mm的角膜环钻轻轻放置在麻醉小鼠的中央角膜上，仅用于标记中央角膜区域。然后将三条11-0缝合线放置在角膜基质内，两条角膜基质侵入线均延伸至角膜周长120°以上。缝线放置的外点位于角膜缘和2mm环钻所勾画线的中间；内缝合点与2mm环钻线的距离相同，以获得标准化的血管生成反应。缝合线保留7天。对小鼠实施安乐死，切除带角膜缘的角膜，并按如下所述进行平板双免疫组化。

角膜HA和淋巴管生成的免疫组织化学和形态计量学。

简单地说，角膜平垫在PBS中冲洗，在丙酮中固定，在PBS内冲洗，在2%BSA中封闭，用FITC-共轭CD31（血小板-内皮细胞粘附分子1[PECAM-1]）抗体染色过夜（1:100稀释；美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物科技公司），用抗LYVE-1（1:500稀释；LYVE-1是一种淋巴内皮特异性透明质酸受体；D.Jackson，牛津大学，英国牛津）(22,30)使用吲哚碳菁结合二级抗体（1:100稀释；美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories）对其进行可视化。使用蔡司Axiophot显微镜分析双染色切片。使用Spot Image Analysis system（Spectra Services Inc.，Webster，New York，USA）获得了平面支架的数字图片，CD31覆盖的区域+++LYVE-1型–血管和CD31+LYVE-1型+++淋巴管(22,23)（其中+++表示强阳性；++表示中等阳性；+表示轻度阳性）使用NIH Image软件进行测量。以角膜缘拱廊的最内侧血管为边界勾画出角膜总面积，然后计算角膜内的血液和淋巴新生血管面积，并将其归一化为角膜总面积（表示为血管覆盖角膜的百分比）。如前所述，对角膜进行石蜡包埋，对LYVE-1进行免疫染色，并用苏木精和伊红进行复染(22).

炎症细胞的组织学特征和定量以及VEGF-C和VEGF-D的免疫组织化学。

在眼球摘除后固定在10%多聚甲醛中的塑料包埋角膜的苏木精和伊红染色连续切片中，对正常角膜中存在的炎症细胞及其在缝线放置1周后重新聚集到角膜中的情况进行量化。此外，为了进一步表征角膜吸收的炎性细胞，在角膜整体支架和冷冻切片上使用巨噬细胞标记物CD11b（Pharmingen，San Diego，California，USA）、CD68（Santa Cruz Biotechnology）和F4/80（Caltec，San Francisco，Califor，USA，如前所述，泛白细胞标志物CD45（致敏原）和中性粒细胞标志物GR1（致敏素）(22).

为了确定淋巴管生成性生长因子VEGF-C和-D的角膜内来源，对VEGF-C-和-D进行双重免疫组化（多克隆抗体；1:100稀释；圣克鲁斯生物技术）在角膜缝合线放置48小时后，再加上Fc阻断剂，对角膜整体支架进行上述巨噬细胞标记（圣克鲁斯生物技术公司）。使用共焦显微镜对切片进行评估（Leica TCS–SP2共焦激光扫描显微镜，Leica，Wetzlar，德国）。

使用VEGF陷阱选择性中和VEGF-A和PlGF。

VEGF陷阱R1R2型是一种融合蛋白，由人VEGFR1（IgG域2）和VEGFR2（IgG-域3）的胞外域部分与人IgG1的Fc部分偶联而成（Regeneron Pharmaceuticals Inc，Tarrytown，New York，USA）(24)、VEGF陷阱R1R2型选择性结合VEGF-A和PlGF，但不结合VEGF-C/VEGF-D（见下文）。小鼠单次注射VEGF TrapR1R2型角膜损伤时腹腔注射12.5mg/kg。对照组小鼠接受人Fc注射（12.5 mg/kg腹腔注射）。在一项研究中，我们使用了另一个Trap（VEGF TrapR1/A40型)仅包含部分VEGFR1（IgG域1–3）与Fc融合，以完全消除与VEGF-C和-D结合的可能性。由于与VEGF-Trap相比，这种结构物的生物利用度降低，对VEGF-A结合的亲和力降低R1R2型，剂量为25 mg/kg（腹腔注射）。

VEGF-A、-C和-D与VEGF-Trap结合的生化特征R1R2型和VEGF陷阱R1/A40型.

使用Biacore（美国新泽西州皮斯卡塔韦市比亚科尔）评估VEGF家族成员与各种VEGF受体嵌合体结合的特异性。蛋白质A（美国伊利诺伊州罗克福德皮尔斯生物技术公司）在所有流动细胞上的CM5芯片和VEGF Trap上进行胺偶联（2000共振单位[RU]）R1R2型和VEGF陷阱R1/A40型分别以1324和2315 RU的水平捕获到芯片表面。VEGFR1-Fc、VEGFR2-Fc和VEGFR3-Fc（美国明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）被用作对照蛋白；这些构建物包含与人Fc融合的所示人类受体的完整胞外结构域，并在530、522和441 RU的蛋白A涂层芯片上捕获。使用仅含胺偶联蛋白A的流动细胞来减少非特异性结合。

在含有0.1 mg/ml BSA的HEPES盐水缓冲液中以10μl/min的速度注射VEGF配体（每个325μl）（瑞士布赫市福卢卡）。分别以200 nM的浓度注射人VEGF-C、人VEGF-D和小鼠VEGF-D-（均来自研发）。人VEGF-A165，人VEGF-A121（Regeneron Pharmaceuticals Inc.）和小鼠PlGF-2（R&D）分别以50nM的浓度注射。两个100 mM H的1分钟脉冲三人事军官4用于清洁蛋白A表面，并在芯片上重新捕获每个评估配体的受体-Fc嵌合体。数据表示为蛋白A表面捕获的受体融合蛋白每股骨特异性结合配体的RU。

角膜微袋试验中VEGF-A和VEGF-C的淋巴管生成作用分析。

如前所述进行角膜微袋分析(10). 简单地说，角膜微袋是使用改良的冯·格雷夫刀和蔗糖硫酸铝微粒（0.4×0.4 mm）制成的，该微粒涂有含有200 ng VEGF-a的氢聚合物164（R&D）或200ng重组大鼠VEGF-C作为阳性对照（RDI，Flanders，New Jersey，USA）植入每个口袋中。将颗粒放置在距角膜缘0.6-0.8毫米的位置，并用抗生素软膏（红霉素）覆盖该部位，放置10天(n个>每只10只老鼠）。如上所述，使用CD31/LYVE-1双重免疫染色定量血管生成和淋巴管生成反应。对于两种血管类型，下缘和颗粒之间血液与淋巴管的最大生长程度分为四类：0，无生长；1、生长不足角膜缘-珠距离的1/3；2、在角膜缘珠距离的1/3至2/3之间生长；3、容器到达颗粒。

γ射线照射小鼠骨髓衍生细胞的系统性耗竭。

BALB/c小鼠用酸化水预处理3天，然后暴露于单剂量9Gy全身γ射线照射。18小时后，如上所述将缝线放入角膜。对照组小鼠接受酸化水预处理和缝线放置。七天后，对小鼠实施安乐死，取下角膜进行上述平板染色和形态测量（每组至少三只小鼠）。

使用结膜下氯膦酸盐脂质体局部消耗巨噬细胞。

如前所述完成单核细胞/巨噬细胞的局部耗竭(31,32). 缝合时以及手术后第2、4和6天，结膜下注射充满二氯甲烷二磷酸的脂质体（CL2MDP-LIP；10μl；荷兰阿姆斯特丹Vrije大学Nico van Rooijen慷慨捐赠）。对照组小鼠在同一时间点接受含有PBS的脂质体或仅接受PBS结膜下注射。为了排除血管内皮细胞摄取氯膦酸脂质体的可能性以及氯膦酸酯对血液和淋巴内皮细胞的直接影响，对比结膜下注射Fc蛋白对先前存在的病理性角膜血管的影响（之前由角膜缝合诱导）注射12小时后对正常角膜缘血管进行评估。

培养骨髓来源的巨噬细胞。

如前所述，采集并培养骨髓来源的巨噬细胞(33). 简单地说，对6周龄的BALB/c小鼠实施安乐死，解剖并切割其股骨两端，并使用PBS填充的25号针头将骨髓冲洗到HBSS（比利时维维尔Cambrex Bio-Science）中。然后，清洗骨髓细胞并将其悬浮在含有10%马血清（Sigma-Aldrich）、10%CPSR-1（Sigma-Aldrich）、10%L929细胞条件培养基、1%MEM维生素（Invitrogen，Carlsbad，California，USA）、1%丙酮酸钠（Cambrex）、1%NEAA（Cambrix）、，1%L-谷氨酰胺（Cambrex）和1%青霉素/链霉素（Cambrix）。培养7天后，如上文所述，对贴壁细胞进行RNA和RT-PCR处理。

统计分析。

Mann-Whitney分析了统计显著性U型测试。差异被认为在P（P）< 0.05. 每个实验至少进行两次，结果相似。使用Graph Pad Prism 3.02版（Graph Pad-Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）绘制图形。

结果

缝合诱导的炎症性CNV以HA、淋巴管生成和炎性细胞浸润为特征。

为了解决内源性VEGF-A是否参与淋巴管生成的问题，我们首先研究了一个已建立的缝合诱导炎症CNV模型，以评估淋巴管向正常无血管角膜的生长(22,29). 该模型的特征是边缘拱廊新生血管的强健生长（图​（图1，1（A–C），并在小鼠体内常规使用，为角膜移植研究创建血管化“高危床”。术后1周新生血管到达缝合处，并伴有密集的炎性细胞浸润。CD45型+角膜基质内的炎性细胞主要由GR-1组成+中性粒细胞和不太显著的F4/80+CD11b型+巨噬细胞（图​（图1）。1). 为了确定早期HA是否伴有淋巴管生成，使用CD31作为泛内皮标记物和LYVE-1对角膜整体进行双重染色(22,30)作为特异性淋巴管标记物。手术后一周，两个CD31+LYVE-1型+++淋巴管和CD31+++LYVE-1型–血管长入角膜（图​（图1，1，D–F），证明在该CNV模型中也诱导了强大的淋巴管生成。

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炎症性角膜新生血管中HA和淋巴管生成的同时诱导。（A–F）中央间质内缝合线放置（A）七天后，生物显微镜（A）和角膜平片（绿色）CD31（PECAM1）免疫染色（D）可观察到强健的血管生成反应（A；血管[BV]）以及炎症细胞的涌入（B[H&E]和C）。CD45+炎性细胞浸润（C）主要由GR-1+中性粒细胞（红色）和F4/80+巨噬细胞（绿色）组成。除了CD31++LYVE-1血管（D和E；绿色）外，还有平行的CD31+LYVE-1++淋巴管（LV；D–F；红色）。血管不会与淋巴血管特异性透明质酸受体LYVE-1（F）发生反应。放大倍数，×20（A）、×200（B和F）、×400（C和E）和×100（D）。

CNV中的血管和淋巴管显示出快速平行的生长。

根据皮肤伤口愈合研究，有人认为淋巴管的长入比血管的长出推迟了几天(34). 为了确定这是否适用于CNV模型，我们进行了一项时间过程研究，比较了两种血管类型的生长。如图所示​图2，2HA与淋巴管生成同时发生。早在手术后24小时就可以检测到先前存在的角膜缘血管产生的小芽，并且在48小时时可以清楚地看到这两种类型的新血管的生长（图​（图2）。2). 有趣的是，淋巴管有时生长在生长前沿的血管之前（图​（图22).

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早期炎症HA和淋巴管生成的时间进程。（A–D）在炎症性角膜新生血管形成过程中，从角膜缘血管拱廊（每张图片的底部）向缝合线延伸到正常的无血管角膜（每张照片的顶部），两条血管（绿色）和淋巴管（红色）很早就平行生长。这两种类型的血管在损伤后24小时即萌芽，并随着时间的推移而发展，淋巴管（红色染色）通常位于血管之前（绿色染色）。放大倍数，×100。

VEGF陷阱的给药R1R2型在炎症性CNV中完全抑制HA和淋巴管生成。

为了确定VEGF-A对炎症相关淋巴管生成的重要程度，我们用一个分子陷阱对小鼠进行系统治疗，该分子陷阱选择性地结合和中和VEGF-A-，但不结合VEGF-C或-D（VEGF-trap）R1R2型). VEGF-Trap的管理R1R2型根据角膜检查结果，缝线放置7天后，HA和淋巴管生成均被完全阻止（图​（图3；三; 经Fc处理的小鼠血液和淋巴管的血管化面积为49%±12%，经VEGF Trap处理的小鼠为2.3%±1.5%R1R2型,P（P）< 0.001). 此外，在缝线放置后第2天、第4天和第7天对角膜进行的检查显示，Trap治疗组的角膜缘从未长出血管和淋巴管。

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VEGF-A的中和抑制HA和淋巴管生成。（A–F）设计用于结合VEGF-A的分子陷阱（VEGF陷阱R1R2型)损伤后1周内，HA和淋巴管生成均被完全抑制。手术时腹腔注射Fc蛋白的小鼠（Fc对照）在1周后显示出强劲的血管生成（A，狭缝图；B，CD31染色）和淋巴管生成（C，CD31和LYVE-1染色），而单次注射VEGF Trap的小鼠R1R2型不显示HA（D和E；血管为绿色）或淋巴管生成（F；淋巴管为红色）。放大倍数，×100（C–F）。（G） VEGF Trap对HA和淋巴管生成几乎完全抑制作用的形态计量学分析(P（P）< 0.001). 放大倍数（A和B），×20。

尽管体外结合研究表明VEGF陷阱R1R2型仅与高亲和力的VEGF-A和PlGF结合，而不与VEGF-C或-D结合（见下文），我们通过重复上述实验，使用VEGF-Trap进一步排除了观察到的反应可能是由于体内VEGF-C-和-D的中和作用R1/A40型虽然它的生物利用率较低，对VEGF-a的亲和力较低，但该试剂仅包含VEGFR1的配体结合域，而不包含VEGFR2，因此它天生就不能结合VEGF-C或-D。使用该试剂，我们观察到类似的平行性和显著性，尽管不太完整，抑制HA（53.8%±14.6%对23.6%±6.8%）和淋巴管生成（45.7%±15.6%对26%±8.2%）；P（P）< 0.05).

VEGF陷阱R1R2型和陷阱R1/A40型仅绑定VEGF-A和PlGF，但不绑定VEGF-C/VEGF-D。

当以近似等摩尔浓度添加到组织培养物中时，VEGF TrapR1R2型已经证明可以阻断VEGF-A诱导的VEGFR2磷酸化以及原代人脐静脉内皮细胞的增殖(24). VEGF陷阱R1R2型结合VEGF165具有很高的亲和力（KD类，～1 pM）。使用小鼠VEGF也获得了类似的结果164在初步研究中，还发现小鼠PlGF与VEGF陷阱结合R1R2型高亲和力（KD类，～1.8 pM）。Biacore结合研究的结果证实，VEGF陷阱R1R2型和陷阱R1/A40型选择性结合VEGF-A（VEGF165和血管内皮生长因子121)和PlGF，但在高达200 nM的浓度下，VEGF-C或-D与任一VEGF陷阱均未检测到结合（图​（图44和表​表1）。1). VEGFR1-Fc与上述VEGF家族成员的结合模式相同。相反，VEGFR3-Fc强烈结合VEGF-C和-D，但不结合PlGF或任何一种VEGF-A亚型。这些数据清楚地表明，VEGF陷阱R1R2型和VEGF陷阱R1/A40型仅结合VEGF-A和PlGF，而不结合VEGF-C或-D，而VEGFR3-Fc仅结合VEGF-C和-D，但不结合VEGF-A或PlGF。

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VEGF陷阱R1R2型和VEGF陷阱R1/A40型仅结合VEGF-A/PlGF，而不结合VEGF-C/VEGF-D。对VEGF/PlGF生长因子与VEGF陷阱和VEGF受体嵌合蛋白（VEGFR1-Fc、VEGFR2-Fc和VEGFR3-Fc）结合的双核心生化评估表明，VEGF陷阱R1R2型和VEGF陷阱R1/A40型在本研究中，仅结合VEGF-A/PlGF，而非VEGF-C或-D。相反，VEGF-C-和-D，而不是VEGF-A/PlGF与VEGFR3-Fc结合。

表1

VEGF陷阱R1R2型和VEGF陷阱R1/A40型选择性结合VEGF-A和PlGF，但不结合VEGF-C和VEFG-D

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只表达VEGF-A的小鼠188或VEGF-A164显示HA和淋巴管生成显著降低。

为了进一步评估VEGF-A在促进淋巴管生成中的作用，我们研究了只表达VEGF-A164或188亚型的小鼠。我们假设，如果VEGF-A参与调节淋巴管生成，则VEGF-A亚型的特异性基因缺失只会影响淋巴管生成。在角膜上缝合；1周后，VEGF164/164缺乏VEGF-A亚型120和188的小鼠HA面积为27.9%±12%，淋巴管生成面积为22.7%±13.6%。VEGF缝合角膜188/188转基因动物（缺乏VEGF-A亚型120和164）的HA面积为20.3%±10%，淋巴管生成面积为25%±12.7%。这表明与野生型对照组相比，淋巴管生成和HA的面积显著减少（HA，44%±10.2%；淋巴管生成面积，57.2%±9.6%；P（P）< 0.05; 图​图5）。5). 因此，HA和淋巴管生成都可以在不存在VEGF-A亚型120和188以及不存在亚型120和164的情况下发生。然而，在这些情况下，角膜HA和淋巴管生成的程度都相应减少，这表明VEGF-A亚型的协同作用对淋巴管生成是必要的。

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VEGF-A亚型对淋巴管生成的重要性。（A–E）野生型小鼠（A）、VEGF-A164/164转基因小鼠（B）和VEGF-A188/188转基因小鼠（C）角膜平垫的CD31/LYVE-1（血管，绿色；淋巴管，红色）双重免疫染色显示HA（D）显著降低；P（P）<0.05）和淋巴管生成（E；P（P）< 0.05). 放大倍数，×100（A–C）。

血管内皮生长因子-A164在角膜微袋试验中可以诱导淋巴管生成和血管生成反应。为了确定外源性VEGF-A是否能发挥直接的淋巴管生成作用，我们研究了VEGF-A的作用164在角膜微袋试验中。在植入了200 ng VEGF-A颗粒的20个角膜中，有17个角膜诱导了淋巴血管生成和HA。淋巴血管明显短于伴随的血管（半定量分级，2.7±0.7对1±0.9；P（P）< 0.01; 图​图6）。6). 这些发现表明，VEGF-A单独可以诱导淋巴管生成，尽管不如HA强烈。作为对照的VEGF-C颗粒也发现了同样的情况。VEGF-C和-A颗粒之间HA与淋巴管生成的比率没有显著差异(P（P）= 0.8).

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角膜微袋试验中VEGF-A对淋巴管生成的影响。（A–C）含有200 ng VEGF-A的微丸（*）总是能诱导强烈的血管生成反应（A，绿色；Li，边缘血管拱廊[箭头]），此外，20个微丸中有17个微丸存在轻度至中度的淋巴管生成反应（红色），与血管生成反应相比，该反应明显减少（B）。C组显示了VEGF-C颗粒（200 ng）具有代表性和可比性的效果。放大倍数（A和C），×100。

VEGF陷阱R1R2型显著减少炎症细胞向角膜的募集。

因为VEGF对炎症细胞具有趋化作用，例如单核细胞/巨噬细胞通过VEGFR1(27,28)因为巨噬细胞可能会分泌淋巴管生成因子，如VEGF-C和-D(8,35)，我们研究了是否使用VEGF Trap中和VEGF-AR1R2型也会削弱缝合损伤后骨髓衍生细胞向角膜的募集。一次性腹腔注射VEGF Trap的动物R1R2型与对照组相比，手术时基质炎症细胞的数量显著减少（图​（图7）；7); VEGF Trap中每个角膜横截面的炎性细胞数量R1R2型治疗组小鼠为188±14，而对照组小鼠为909±167(P（P）< 0.01). Fc-治疗对照组的炎症浸润由GR-1组成+中性粒细胞和F4/80+巨噬细胞。

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捕获VEGF-A的抗炎作用。（A–C）使用分子细胞因子陷阱VEGF-trap捕捉VEGF-A/PlGFR1R2型在缝合诱导的新生血管模型中，显著减少炎症细胞向角膜的募集。手术后一周，用Fc蛋白治疗的对照小鼠（Fc对照）显示炎症细胞（IC和箭头）大量涌入中央角膜基质（a）。捕获VEGF-A可显著减少这种内流（B；C，正常角膜）。（D） 捕获VEGF-A可减少约80%的基质炎症细胞(P（P）< 0.01). （E和F）缝线放置和Fc治疗（对照组）7天后，在角膜基质中发现的炎症细胞主要是GR-1+中性粒细胞（E，红色），较少是F4/80+CD11b+巨噬细胞（F，绿色）。放大倍数，×100（A–C）和×400（E和F）。

全身γ射线照射对骨髓源细胞的消耗会抑制淋巴管生成。

巨噬细胞可通过VEGFR1相互作用被VEGF-A招募到炎症部位(27,28)已知活化的巨噬细胞表达多种细胞因子和生长因子，包括VEGF-a、-C和-D(8,35). 自从VEGF Trap抑制角膜新生血管以来R1R2型与角膜中炎性细胞募集的显著减少相关，我们确定通过其他方法去除炎性细胞是否也会抑制角膜损伤后的HA和淋巴管生成。在初步实验中，我们证实，单次剂量为9 Gy的全身照射在照射后1周内几乎完全耗尽了外周血中的白细胞（数据未显示）。图中的结果​图88研究表明，照射导致骨髓源性细胞的耗竭，在角膜炎症刺激下，实质上抑制了HA和淋巴管生成。受照小鼠的血管和淋巴管面积分别为18.4%±4%和16.4%±3.2%，而未受照对照组的血管和淋巴细胞面积分别为49.6%±10.4%和38%±12.23%(P（P）< 0.05).

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骨髓衍生细胞介导炎症相关淋巴管生成。（A–C）骨髓源性细胞的耗竭导致HA和淋巴管生成同时受到抑制，以应对角膜炎症刺激（血管，绿色；淋巴管，红色）。（A） 缝线放置七天后，对照组小鼠的角膜缘血管拱廊（左）出现平行的血管和淋巴管生长。（B和C）单次全身照射可显著平行抑制HA和淋巴管生成。插图B显示了正常角膜缘血管拱廊的代表性区域，没有血管外长。在C中，将对照组与受辐射的小鼠进行比较（S+Rx）；P（P）< 0.05. 放大倍数（A和B），×100。

局部巨噬细胞耗竭抑制角膜淋巴管生成。

接下来，我们通过结膜下注射氯膦酸盐脂质体来评估角膜中选择性巨噬细胞耗竭的效果(31,32). 吞噬氯膦酸盐脂质体的巨噬细胞迅速死亡。在第0天、第2天、第4天和第6天对角膜中央缝合的眼睛进行结膜下脂质体注射。巨噬细胞的局部耗竭几乎完全抑制了角膜淋巴管生成和HA（图​（图9）；9); 接受氯膦酸钠治疗的小鼠的血管和淋巴管面积分别为11.3%±5.8%和10.8%±2.5%，而PBS治疗的对照组的血管和淋巴液血管面积分别为42.3%±11.3%和38.8%±4.7%(P（P）< 0.01). 局部应用氯膦酸盐脂质体对预先存在的角膜缘和病理性角膜血管或淋巴管没有明显的直接影响。这些结果表明，通过结扎VEGFR1募集到损伤部位的巨噬细胞对炎症相关HA和淋巴管生成至关重要。

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巨噬细胞对病理性HA和淋巴管生成至关重要。（A和C）PBS处理的对照。（B和D）接受结膜下氯膦酸盐脂质体的小鼠。放大倍数，×100（C和D）。（E） 巨噬细胞耗竭抑制炎症新生血管中HA和淋巴管生成（LA）(P（P）< 0.01). 放大倍数（A和B），×20。

炎症角膜中的巨噬细胞表达淋巴管生成性VEGF-C和-D。为了直接评估由VEGF-A招募到炎症角膜的巨噬细胞是否能够释放淋巴管生成生长因子VEGF-C和-D，我们在缝线放置48小时后对炎症角膜进行免疫组织化学研究，使用VEGF-C/VEGF-D和巨噬细胞标记物CD11b和F4/80的双重标记。如图所示​图10，10，这表明大多数CD11b+功能4/80+基质中的巨噬细胞对VEGF-C呈阳性反应，一些也对VEGF-D呈阳性。为了进一步支持小鼠巨噬细胞可以表达VEGF-C-和-D的观点，我们对培养的骨髓来源的小鼠巨噬细胞进行了RT-PCR研究。如图所示​图10，10，这些巨噬细胞能够转录VEGF-C和-D mRNA。

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炎症角膜中的巨噬细胞同时表达VEGF-C和-D。1、VEGF-C阳性对照；2、小鼠骨髓源性巨噬细胞VEGF-C；3、VEGF-D阳性对照；4：小鼠骨髓源性巨噬细胞VEGF-D。（B）损伤48小时后，炎症角膜中红染CD11b+巨噬细胞中VEGF-C（绿色）的表达。（C） 受伤48小时后炎症角膜红染CD11b+巨噬细胞中VEGF-D（绿色）的表达。箭头表示具有代表性的巨噬细胞。放大倍数（B和C），×600。

讨论

我们在炎症性新生血管角膜模型中获得的结果可以得出两个关于VEGF-A在血管和淋巴管生长中的作用的重要结论。首先，内源性VEGF-A可以促进淋巴管生成，至少在炎症性新生血管形成的情况下是如此。其次，通过VEGFR1对白细胞，尤其是单核细胞/巨噬细胞发出信号，是促进病理性HA和淋巴管生成信号“免疫放大”的关键步骤。

目前的观察结果表明，CNV中淋巴管生成和HA同时发生，并且这两种反应都被内源性VEGF-A的选择性抑制所阻断，这似乎与VEGF-A-VEGFR2结扎仅诱导HA的既定概念相矛盾，而VEGF-C/VEGF-D和VEGFR3之间的相互作用离散地介导淋巴管生成。事实上，大量文献支持VEGF家族蛋白及其受体功能的这种基本二分法。例如，当应用于分化的鸡绒毛尿囊膜（CAM）时，发现VEGF-A刺激HA，但不刺激淋巴管生成，而VEGF-C只诱导淋巴管生成(15). 有趣的是，在CAM试验中，VEGFR1选择性配体PlGF不能诱导淋巴管生成或HA。同样，在角膜微袋试验中，据报道VEGF-A可以诱导HA，但不能诱导淋巴管生成(11)在一些使用腺病毒过度表达的研究中，VEGF-C持续诱导淋巴管生成，而VEGF-A没有(12–14). 虽然这些研究确实表明，在某些条件下，VEGF-C/VEGFR3和VEGF-A/VEGFR2相互作用可以分别诱导纯粹的淋巴管生成反应和血管生成反应，但最近的研究开始表明，这种二分法还远未完成。

事实上，VEGF-C和-D具有双重淋巴管生成和血管生成特性(2,9,10,36,37)和VEGFR3，虽然普遍由淋巴管内皮细胞表达，但在某些条件下，尤其是在胚胎发育和血管重塑活跃期，包括在病理过程中，也由血管内皮细胞表达(34,37).

与VEGF-C和-D相比，几乎没有证据支持VEGF-A可能参与淋巴管生成的观点。然而，最近的一项分子分析研究表明，淋巴管内皮细胞可以表达VEGFR2，并且VEGF-a在支持其生存和促进试管形成方面与VEGF-C一样有效(16–19). 另一项最近的研究表明，腺病毒过度表达VEGF-A164在兔子耳朵中导致“巨大”淋巴管的形成(20). 这些研究提出了内源性VEGF-A在某些情况下可能在促进淋巴管生成中发挥作用的可能性，我们在目前的研究中已经证实了这一可能性。

具体而言，我们已经证明（a）在角膜袋试验中，外源性VEGF-a单独可以诱导淋巴管生成（先前研究的不同结果[参考文献。11]可能是因为使用了不同的小鼠菌株、VEGF-A的数量和染色技术）；（b） 淋巴管生成和HA同时发生在炎性新生血管形成的角膜损伤模型中；（c） 在该模型中，VEGF-A/PlGF的选择性药理学中和完全抑制了HA和淋巴管生成，这是由于主要抑制了血液和淋巴管的形成，而不是通过加速消退；（d）角膜损伤后，在只表达VEGF-A的转基因小鼠中，淋巴管生成和透明质酸的水平都相应降低164或VEGF-A188(25,26). 综上所述，这些结果表明，至少在某些病理生理条件下，内源性VEGF-A在促进淋巴管生成和HA方面起着关键作用。

接下来，我们将注意力转向可能解释该模型中HA和淋巴管生成的协同诱导机制，以及选择性抑制VEGF-A对这两种反应的有效抑制。这里我们注意到，除了抑制CNV外，VEGF Trap的使用也显著抑制了基质内角膜缝合线放置引起的炎症反应。众所周知，VEGF-A是一种有效的单核细胞化学吸引剂，这种作用是通过连接VEGFR1介导的(27,38,39). 因此，一种可能的情况是，VEGF-A通过将骨髓来源的细胞，特别是单核细胞/巨噬细胞募集到受影响的部位，间接刺激CNV中的淋巴管生成，而这些细胞又是一种或多种淋巴管生成因子的来源。众所周知，活化的白细胞表达并分泌大量细胞因子和其他调节肽和蛋白质，包括VEGF-a(31,40,41). 此外，最近有研究表明，循环VEGFR3的一个子部分+CD14号机组+单核细胞在向瘤周部位募集或体外刺激时也强烈表达VEGF-C和VEGF-D(8). 此外，VEGF-C+巨噬细胞与新的瘤周淋巴管共存，强烈提示这些细胞在淋巴管生成中的作用(8,42). 此外，已知促炎细胞因子而非缺氧上调VEGF-C的表达(43)VEGF-C因此在炎症状态下高度表达(44)更强烈地表明，VEGF-A募集的巨噬细胞上调VEGF-C/VEGF-D对角膜炎症细胞因子的反应。事实上，我们已经在这里证明了CD11b+功能4/80+炎症角膜基质中的巨噬细胞表达VEGF-C（大于VEGF-D），骨髓来源的小鼠巨噬细胞转录VEGF-CmRNA和-D mRNA。

本研究的结果直接支持了这样一个概念，即通过结扎VEGFR1，VEGF-A介导的炎性细胞募集是CNV淋巴管生成反应启动的重要步骤。VEGF-A的药理中和作用显著抑制了缝线放置后炎症细胞向角膜的募集。此外，在炎症刺激后，辐射导致的骨髓源细胞的系统性耗竭显著减弱了角膜淋巴管生成。此外，使用结膜下氯膦酸盐脂质体局部消耗巨噬细胞可显著抑制淋巴管生成。最后，炎症角膜中的巨噬细胞同时表达淋巴管生成性VEGF-C和-D。总之，这些发现提供了强有力的证据，证明巨噬细胞募集是VEGF-A（间接）淋巴管生成作用的重要介质（图​（图1111描述了此概念）。值得注意的是，巨噬细胞耗竭不仅抑制角膜损伤后的淋巴管生成，而且有效抑制了伴随的HA。这一观察结果与之前的一项研究一致，该研究表明选择性巨噬细胞耗竭可抑制其他疾病模型中的病理新生血管(45)支持炎症也是VEGF-a介导的病理性HA的必要成分的观点(45,46).

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提出了VEGF-A通过招募骨髓源巨噬细胞发挥（间接）淋巴管生成作用的概念，骨髓源巨噬细胞反过来可以释放血管生成和淋巴管生成生长因子。巨噬细胞似乎对免疫放大很重要，导致病理性HA和淋巴管生成。

虽然VEGF介导的炎性细胞募集在促进病理性新生血管形成方面显然起着重要且明显的主导作用，但VEGF-A的其他更直接的作用很可能有助于启动血管生成和淋巴管生成反应。例如，VEGF-A直接作用于血管内皮细胞，上调促进白细胞抑制的粘附分子的表达(47,48). 同样，VEGF介导的常驻血管通透性的快速增加以及由此产生的血清蛋白外渗也有助于促进随后血管和淋巴管的形成(17,49). VEGF-A也可能直接作用于VEGFR2，促进淋巴管内皮细胞的生长和组织(16,50). 最后，除了招募向损伤部位提供细胞因子和生长因子的炎性细胞外，VEGF-A还可能通过招募VEGFR1阳性造血祖细胞到损伤部位并促进其分化为血管内皮细胞来增强血管生成反应（有关综述，请参阅参考文献。2,51).

虽然我们的数据强烈支持这样一个概念，即VEGF-A通过VEGFR1招募单核细胞/巨噬细胞是导致炎症HA和淋巴管生成的免疫放大级联反应的早期和必要步骤（见图​图11），11)在形式上，VEGFR1配体PlGF也可能部分促进角膜HA和淋巴管生成。事实上，VEGF陷阱R1R2型和VEGF陷阱R1/A40型结合PlGF以及VEGF-A。尽管其他研究的结果表明PlGF可以与VEGF-A协同刺激病理性HA(51,52)，有三个事实“反对”内源性PlGF在促进炎症淋巴管生成中发挥重要作用的可能性：（a）PlGF仅与VEGFR1结合，而淋巴内皮仅表达VEGFR2和VEGFR3(53); （b） 兔耳中AD-PlGF的过度表达导致血管的形成，但与VEGF-A相比，它没有引起淋巴管生成(20); 在本研究中，VEGF-A亚型缺陷转基因小鼠的淋巴管生成和HA均相对减少。

目前，对血管内皮生长因子-A介导的CNV淋巴管生成的最简约的机制解释是，血管内皮生长激素-A通过与血管内皮生长素R1结合并招募在损伤部位分泌血管内皮生长蛋白-C和/或血管内皮生长基金-D的巨噬细胞，间接促进了这种反应。然而，在之前的一项研究中，外源性VEGF-C亚型（156S）的应用在角膜微袋分析中无法诱导淋巴管生成（相反，例如皮肤）(11,54). 因此，虽然有证据表明VEGFR3信号对角膜淋巴管生成是必要的(11)VEGFR3信号转导足以启动角膜淋巴管生成的假设尚待实验证实。

炎症是以病理性新生血管为特征的多种疾病的共同特征，因此VEGF-a很可能在促进淋巴管生成以及其他疾病状态下的异常HA中发挥重要作用(42). 如果是这样，目前的研究结果可能对目前正在开发的治疗多种疾病的“抗血管生成”疗法产生重要影响。如前所述，在不同类型的人类肿瘤中，瘤周炎症程度与淋巴管生成密切相关(42). VEGF-A在大多数实体瘤中高度表达，可能通过招募“淋巴管生成”单核细胞/巨噬细胞来增强肿瘤中的淋巴管生成和HA。因此，以VEGF-A信号为靶点的抗血管生成策略也可能被证明在至少部分抑制瘤周淋巴管生成方面有效。在角膜移植排斥反应的背景下，抗原呈递细胞向传入淋巴管的募集是宿主对外来移植抗原产生免疫反应过程中的一个重要步骤。旨在抑制新生淋巴管生长的治疗策略应通过抑制同种异体增敏来提高移植存活率（C.Cursiefen和J.W.Streilein，未发表的观察结果）。由于免疫排斥是角膜移植失败的最重要原因，我们的研究结果表明，有效的VEGF-A信号抑制剂有可能提高角膜移植的存活率。

在证明中添加注释。

J.Wayne Streilein去世。

致谢

我们感谢Schepens眼科研究所的同事，特别是J.Doherty的支持，J.Gu的组织学帮助，D.Pottle的共焦和免疫荧光成像帮助，M.Ortega和T.Truong的小鼠群体帮助，以及Peter Mallen的艺术工作帮助。我们感谢Ashique Rafique（Regeneron Pharmaceuticals Inc.）对VEGF陷阱的生化特性的帮助。这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（Cu 47/1-1和Cu 47/12）以及NIH拨款EY10765和CA45548的支持。P.A.D’More是朱尔斯和多丽丝·斯坦因预防失明研究的教授。

脚注

使用的非标准缩写：绒毛尿囊膜；角膜新生血管；血管生成；胎盘生长因子；血小板-内皮细胞粘附分子1（PECAM-1）；谐振单元（RU）。

利益冲突：J.Cao、C.Radziejewski和S.J.Wiegand是Regeneron Pharmaceuticals Inc.的员工。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会