美国国家科学院院刊。2013年10月1日；110（40）：E3780–E3789。
以长篇论文形式
受调控的结构转换释放αB-晶体蛋白的伴侣活性
德国加兴慕尼黑理工大学综合蛋白质科学与化学系中心，85748
由密苏里州哥伦比亚密苏里大学Linda L.Randall编辑，2013年8月26日批准（2013年5月9日收到供审查）
作者贡献：J.P.、S.W.和J.B.设计的研究；J.P.、N.B.、J.R.、K.C.B.、T.K.和A.K.进行了研究；J.P.、N.B.、J.R.、K.C.B.和T.K.分析数据；J.P.、S.W.和J.B.撰写了这篇论文。
1现住址：加利福尼亚大学生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山，邮编94158。
2现住址：加利福尼亚大学细胞与组织生物学系，加利福尼亚州旧金山，邮编94143。
三目前地址：GATAN GmbH，80807慕尼黑，德国。
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支持信息
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重要性
小分子热休克蛋白αB-晶体蛋白是一种典型的、普遍存在的分子伴侣。它是细胞蛋白稳定系统的一个组成部分，与阿尔茨海默病、肌病、白内障和多发性硬化症等人类疾病有关。αB-晶体蛋白的分子结构遵循一个有趣的构建计划，其特征是动态低聚物平衡。在这里，我们利用磷酸化模拟物作为一种工具，通过构象集合的改变将蛋白质转换为激活的功能状态。利用低温电子显微镜和图像处理技术，我们确定了活化的αB-晶体蛋白系综的结构。生化分析表明，在活化过程中，N末端区域获得了灵活性和溶剂可及性。这可以增强αB-晶体蛋白的活性，并促进其与Hsp70系统的合作。
关键词：sHsp，Hsp70，条件障碍，翻译后修饰，结构-功能关系
摘要
小的热休克蛋白αB-结晶蛋白是一种寡聚分子伴侣，可结合易聚集的蛋白质。作为蛋白质平衡系统的一个组成部分，它与白内障、神经退行性疾病和肌病有关。调节其伴侣功能的结构决定因素在很大程度上仍然难以捉摸。结合不同的实验方法，我们发现由N末端结构域（NTD）介导的磷酸化诱导的亚单位间相互作用的失稳导致低聚物整体的重塑，同时增加较小的活性物种，主要是12-mers和6-mers。通过低温电子显微镜和生化分析确定的它们的3D结构表明，这些物种中的NTD具有灵活性和溶剂可及性。这些调节特性伴随着体内外伴侣活性的增加，以及在客户折叠中与热休克蛋白70系统的更有效合作。因此，如本文所述的磷酸化，NTD结构灵活性的调节似乎调节了αB-晶体蛋白的伴侣活性，使NTD成为非天然蛋白质的构象传感器。
分子伴侣具有结合非天然、聚集性多肽并协助其折叠和组装的能力(1——三). 其中，小分子热休克蛋白（sHsp）αB-晶体蛋白（也称为HspB5）是脊椎动物眼睛晶状体的主要成分之一，在那里它既是伴侣蛋白又是结构蛋白(4,5). 在非脉络组织中，αB-晶体蛋白（αB）参与维持细胞蛋白质平衡。神经退行性疾病(6,7)、多发性硬化(8)，肌病(9)以及细胞周期控制、凋亡和癌症(10,11)强调其对细胞蛋白质平衡的重要性。
αB展示了一个三方组织()中心α-晶体蛋白结构域（ACD）两侧有N末端结构域（NTD）和短C末端延伸（CTE）(12,13). ACD形成稳定的二聚体(14——16)通过NTD和CTE介导的相互作用进一步组装成高阶低聚物(17——19). αB形成具有可变数量亚基的多聚体的动态群体(20,21). 结构研究表明，低聚物的各种状态包括对称的24聚体(22)通过将亚基添加到现有低聚物（或从中减去）而产生(17,18). 对于许多其他sHsps(23)，αB的多分散性与尚未确定单元的自发亚基交换耦合。αB四元动力学归因于C末端IXI基序介导的亚单位间接触的波动(24). 然而，考虑到其参与低聚物的形成，NTD也必须发挥决定性作用。
αB拟磷酸化物的低聚物大小、疏水性和四元动力学。(A类)人类αB的结构域组织：具有三个主要体内磷酸化位点Ser19、Ser45和Ser59、ACD（蓝色）和CTE（绿色）的NTD（橙色）。(左下方)根据Braun等人(17)叠加（功能区表示，如上所述着色的域）。沿着垂直于NTD所在区域的分子三重对称轴观察分子（闭合三重区域，3c（c）). (右下角)区域3伪原子模型特写c（c）。彩色球体表示残留物S19（绿色）、S45（蓝色）和S59（青色）。(B类)沉降速度AUC分析αB-WT及其三重Glu突变体（αB-3E）。通过c（s）分析得到了αB-WT（黑色）和αB-3E（红色）的s值分布。(C类)用钼酸铵[1.5%（wt:vol），pH 5.5]负染色的αB-3E（0.02 mg/mL，pH 7.4）的透射电子显微照片。（比例尺，100 nm。）(插入)按αB-3E所述制备的αB-WT（0.05 mg/mL）的TEM图像。(D类)αB-WT和αB-3E的亚单位交换动力学。图中显示了415nm处供体荧光强度的时间变化，这是由于在AIAS-和LYI-标记的αB-WT-S153C的FRET平衡杂低聚物中添加过量的未标记αB-WT（黑色）和αB-3E（红色）时FRET发生逆转所致。αB-3E的亚单位交换率较高（0.369±0.028 min−1)大于αB-WT（0.053±0.013分钟−1). 各荧光光谱以相同色码的插图表示。
通常，包括αB在内的sHsps识别聚集蛋白、部分未折叠底物(4,25,26)并使其处于可折叠状态(27,28). sHsps的底物结合位点尚未确定。最近的研究表明，所有三个序列区域都涉及多个位点(29——32). 然而，由于缺乏NTD的结构信息，仍然不可能提出αB或sHsps一般作用模式的分子机制。新出现的观点是，它们的结构可塑性可能是基底识别和结合的重要因素(25,29,33——35). 在此背景下，一个关键问题是确定αB结构集合的变化如何与伴侣功能相关。
由于sHsps不具有ATP酶活性，它们的伴侣功能受到不同方式的调节。对于许多哺乳动物的sHsps，磷酸化在这方面起着重要作用(36). 对于αB，三个主要的磷酸化位点Ser19、Ser45和Ser59都位于NTD内()，被磷酸化以应对各种压力(37,38). 已证明αB的磷酸化与平均低聚物尺寸的减小和增强的底物结合有关(39——42). 然而，它对分子结构和潜在激活机制的影响仍然难以确定。
为了探讨αB的NTD在低聚物组装、平衡和动力学中的作用及其对伴侣功能的影响，我们使用了磷酸化突变体和磷酸化αB。通过破坏较大低聚物中NTD相互作用的稳定性，我们能够在重塑的整体中填充和识别伴侣活性物种，并确定活性低聚物的结构，其中NTD的结构灵活性和可接近性是有效结合以及随后折叠客户端的关键因素。
结果
αB的NTD在低聚物完整性中起决定性作用。
最近的结构研究(17,18)提出αB低聚物是分层组装的：ACD介导αB二聚体的形成，其中三个二聚体通过使用C末端IXI基序的相互作用构成稳定的六聚体单元(43). 这种六聚体单元通过N端相互作用进一步与高阶多聚体相关联。根据我们的αB 24-mer伪原子模型(17)六个NTD中的三个主要体内磷酸化位点Ser19、Ser45和Ser59都位于一个结构元件内()正如二硫键交联在半胱氨酸取代丝氨酸上所证实的那样(图S1). 这种空间接近性表明，在引入负电荷时，N-末端亚单位间相互作用显著不稳定，因此对低聚物完整性有重大影响。我们利用αB的磷酸化修饰突变体，其中这些丝氨酸被谷氨酸盐取代，以探索NTD在低聚物组装和集成组成中的作用。所有七种可能的单（1E）、双（2E）和三（3E）谷氨酸（Glu）变体均在大肠杆菌并纯化至均匀。
为了检测突变蛋白的四元结构，我们使用了尺寸排除色谱（SEC）、分析超速离心（AUC）和电子显微镜（EM）（有关详细信息，请参阅材料和方法). SEC表明，与WTαB（αB-WT；图S2A类). 沉积速度（SV）AUC实验表明，重量平均沉积系数（<s20，宽>)对于αB-WT，从16.1 S开始()所有Glu变体的值都较小(图S2B类;表S1). 三重突变体αB-3E显示出不对称分布，表明存在至少两个不同寡聚物物种种群(). αB-3E在3S处的另一个小峰表明存在二聚体物种。沉降平衡（SE）AUC实验得出的径向浓度分布证实，在平衡条件下，αB-WT和αB-3E的平均分子质量不同（490 kDa对330 kDa）(图S2C类). 为了更详细地研究低聚物大小的变化，我们将αB-WT及其磷酸化修饰变体置于阴性染色EM（NS-EM）中，并测定其大小分布(图S2D类). 所有Glu变体都显示出向较小的低聚物的转移。与αB-WT相比，αB-3E含有大量较小的低聚物().
为了测试N-末端亚基接触的失稳如何影响αB的四元动力学，我们进行了FRET研究。为此，将供体和受体标记的αB-WT-S153C低聚物混合并培养，直到达到FRET平衡。在这些FRET杂寡聚物中添加过量的未标记αB-WT或αB-3E后，由于亚基交换（SX），随着时间的推移，观察到供体荧光增加(). 使用SX动力学的指数模型(23)，速率常数为0.053±0.013和0.369±0.028 min−1分别获得了αB-WT和αB-3E，这表明磷酸化修饰突变体中的四元动力学增强，与先前的建议一致(40). 与平均低聚物大小类似，SX速率也表明与引入Glu残基的数量相关(图S2E类;表S1).
为了进一步证明αB-WT和αB-3E之间形成杂低聚物，我们使用Atto488-标记的αB-WT和未标记的α-B-3E进行了荧光AUC。当在标记的αB-WT中添加越来越多的未标记αB-3E时，尺寸分布逐渐向αB-3E方向移动(图S2F类). 由于荧光光学的使用允许选择性监测标记的αB-WT亚基，这种转变只能通过混合络合物的形成来解释。
αB低聚物中N-末端相互作用的破坏导致六聚体单元与高阶低聚物分离。
磷酸化修饰突变体平均低聚物大小的减小并不一定意味着Glu变体观察到的小低聚物是由于αB中存在的高阶多聚体的部分解离所致。它们也可能在电荷诱导的结构重排上形成，并遵循不同于WT蛋白的组装原理。因此，解析较小低聚物的结构对于阐明αB-晶体蛋白的伴侣机制至关重要。为此，我们对3E变体进行了冷冻电镜和图像处理。αB-3E低聚物在低温电子显微照片中的投影图像(图S3A类)类似于先前确定的αB-WT(17). 通过多元统计[多元统计分析（MSA）]和分类对αB-3E数据进行无模型分离，表明存在不同的αB-3E组装体，其尺寸和结构特征与αB-WT低聚物相似(图S3C–F类). 这一观察结果证明了使用先前计算的αB-WT低聚物模型作为初始参考对数据进行进一步分类的合理性。通过这种方法，我们可以明确地将～80%的粒子图像分配给不同的αB-3E低聚物，并通过投影匹配循环计算最密集低聚物的3D模型，即6-、12-和24-mers(;表S2). 应当指出，方法的局限性阻碍了对小于六聚体的物种（如二聚体）的分析。
在磷酸模拟物αB-3E中保留了αB低聚物的分级组装原理。(A类)在低温电子显微镜中观察到的αB-3E低聚物的三维重建。等表面阈值被设置为包含分子量为485 kDa的24聚体，242 kDa为12聚体，121 kDa是6聚体。(B类)根据Braun等人(17)叠加（带状表示，域的颜色如). 注意，只有24-mer伪原子模型是能量最小化的。沿着三重对称轴观察24个mers，该轴拦截了窗口所在区域（开放的三重区域，3o（o）). 围绕3的质量丰富的圆顶o（o）并通过星形和NTD所在的三重对称区域（闭合三重区域，3c（c）)通过闭合箭头。12-mer几乎垂直于与24-mer的双重对称轴相对应的轴。6 mers以三种不同的方向显示（俯视图、侧视图和仰视图）。所有重建均以18º的分辨率呈现，以提高可比性。注意αB-3E和αB-WT低聚物结构的一致性。
根据我们的重建，观察到αB-3E的低聚物结构()和αB-WT()是一致的。与αB-WT对应物一样，αB-3E 24-mer是一种中空的球形复合物，具有四面体（P23）对称性，其特征是在两个对称轴的位置和三个对称轴截取蛋白质外壳的两个区域之一（三个开放区域，3o（o）;). 此外，三重轴相对截距位置处的质量富集区（闭合三重区域，3c（c）)和周围的特色浮雕3o、，在αB-3E 24-mer中也保存良好。αB-WT和αB-3E的12-和6-mers的结构也显示出惊人的相似性。六聚体的特征是由三个结构单元组成的对称（C3）环状排列，每个结构单元都有一个从环向下的“臂”，而十二聚体由两个相邻的六聚体组成，两个相邻六聚体通过两个桥接密度互连(). 从αB-WT和αB-3E相应低聚物结构的奇偶性来看，很明显，在3E突变体中，αB低聚物的层级“二聚-六聚体-多聚体”结构和亚基组织是保守的。然而，αB-3E的相对低聚物群体与观察到的αB-WT的相对低聚物群体大不相同(图S3H（H）)：虽然对称的24-mer占αB系综的～42%，但它只占αB-3E粒子的～6%。另一方面，WT蛋白中丰度较低的物种，主要是6-和12-mers，共同贡献了约65%的αB-3E颗粒。由六聚体构建块组成的物种的优势以及αB-3E低聚物中保守的亚基组织清楚地表明，在容纳NTD的六聚体组装位置，高阶αB-3E低聚物的解离趋势增强。
根据我们的模型，NTD中额外的负电荷将进一步削弱有助于组装较大低聚物的相互作用。为了验证这一点，我们构建了一个αB变异体，该变异体在19、21、43、45、53和59位含有六个类似磷酸化的Ser-To-Glu突变（αB-6E）(44). 在这种变体中，高阶低聚物（如24单体）的形成几乎被完全抑制。AUC测定的αB-6E的加权平均沉降系数为6.3S(图S4A类;表S1)以及通过流体动力学模拟预测的六聚体物种的6.0 S的沉降系数(表S2)表明αB-6E系综主要由六聚体组成。
综上所述，这些结果强调了NTD在调节低聚物平衡和αB动力学方面的重要性，因为NTD介导的亚单位相互作用的失稳导致SX动力学增强，并导致系综成分的重塑。
αB的NTD表现为条件障碍。
由于高阶αB-3E低聚物分解为较小的物种，相当数量的NTD不再参与低聚物相互作用，因此可能会发生结构改变和/或具有改变的可接近性。为了在αB-3E系综的背景下评估后者，我们监测了固有探针Trp9和Trp60的丙烯酰胺荧光猝灭，它们是αB序列中唯一的色氨酸残基，都位于NTD内(). 滴定实验显示，与αB-WT相比，αB-3E具有更大的猝灭作用，表明两种色氨酸残基的溶剂可及性增加().
αB-3E中NTD的构象性质。(A类)丙烯酰胺对固有色氨酸荧光的猝灭。αB-WT（黑色方块）和αB-3E（红色圆圈）的固有Trp探针（Trp9，Trp60）的荧光被丙烯酰胺猝灭。Stern-Volmer图（荧光相对减少[F类0/F类]相对于猝灭剂浓度）显示在αB-3E系综的背景下色氨酸残基的更多猝灭，表明更高的可及性。(B类)通过ANS荧光探测αB-WT（黑色）和αB-3E（红色）的整体表面疏水性。注意，与αB-WT相比，αB-3E的荧光强度增加，表明整体表面疏水性增加。(插入)αB序列的疏水性图。表示NTD的序列段为橙色。Eisenberg等人根据疏水性量表计算疏水性得分(70)使用基于web的应用程序ProtScale(71). (C类)αB-WT的有限蛋白水解(左侧)和αB-3E(赖特)α-糜蛋白酶。蛋白质样品（10µM）与α-糜蛋白酶以1:25（wt/wt）的比例孵育。蛋白质水解反应在不同时间点后终止，并通过SDS/PAGE进行分析。使用LC-MS对裂解产物进行鉴定。用箭头指示各个条带，并用鉴定的肽进行标记。不含糜蛋白酶（阴性）的样品作为对照。LMW，低分子量标记。
为了评估解离诱导的整体表面疏水性变化，我们监测了环境敏感染料8-苯胺-1-萘磺酸盐（ANS）与αB结合的荧光。与αB-WT相比，αB-3E存在时ANS荧光发射强度增加(). 由于ANS与蛋白质的结合主要涉及疏水相互作用(45)，光谱表明疏水区域的暴露增加，其中大多数位于NTD(,插入)或结构灵活性的增加，允许局部重排以适应染料(46). 两者的结合似乎也是可以想象的。
为了在αB-3E系综的背景下进一步探索NTD的构象特征，我们使用了有限的蛋白质水解实验。为此，用α-糜蛋白酶孵育αB-WT和αB-3E，并用SDS/PAGE分析不同时间点的蛋白水解消化(). 实验表明，与αB-WT相比，磷酸化突变体的降解速度更快。45分钟后，αB-3E几乎完全降解，而全长αB-WT的条带仍然存在(). 重要的是，这些蛋白质的裂解模式也不同。对蛋白水解裂解的主要肽产物的MS分析显示，W9、F47和M68是αB-3E的三个主要蛋白水解位点，而αB-WT只有前两个(图S5). 与片段10–175相对应的条带是以两种蛋白质相似的动力学形成的(). 然而，与αB-WT相比，磷酸拟态突变体的片段48-175出现得更快(). 对于片段69–175，差异更为显著，该片段在培养10分钟后已经存在于αB-3E中，但在实验过程中无法检测到αB-WT(). 这些结果强烈表明，NTD在αB-WT和αB-3E中采用不同的构象状态：而含有裂解位点W9的大多数N端αB链段显然具有相似的可接近性，包括位点F47和M68的链段似乎在（主干）中增加αB-3E的灵活性，从而暴露于蛋白水解攻击。
αB-3E中NTD柔性增强的迹象促使我们更详细地分析6-和12-聚体的结构。为此，我们首先对αB-3E 6分子数据集进行3D-MS分析，这是一种解释差异并解释动力学的方法(47). 分析表明，不同的3D类别平均值明显代表了αB-3E 6分子的不同构象状态(). 所有结构都具有由三个ACD二聚体形成的特征环状结构(，第一行）。然而，它们在手臂的末端区域存在显著差异，这些末端区域容纳来自相邻ACD二聚体的NTD(，第二排）。在一些群体中，这些片段是断开的，指向结构的外部或内部，而在另一些群体中，它们相互接触，部分关闭一侧中心环的开口(，第二排）。对12岁人群的分析也揭示了显著的结构差异。除了在6 mer重建中观察到的末端臂区的实质性运动外，12 mer的两个六聚体单元的相对方向显示出主要差异，这表明在容纳NTD和连接6 mer的铰链区域也存在显著的灵活性().
小αB-3E低聚物的结构变化。(A类)不同构象状态下αB-3E 6分子低温电子显微镜密度图（C1对称）的表面表示。等表面阈值设置为包含121 kDa的分子量。当从外部观察时，模型方向对应于αB-WT 24-mer中六聚体单元的方向（第一排；顶视图）()或从内部（第二行；底视图）。方差最大的区域为红色。请注意由三个ACD二聚体构建的环状结构（第一行）的一致性以及含NTD臂末端区域的灵活性（第二行）。(B类)不同构象状态下αB-3E 12-mers低温电子显微镜密度图的表面表示。注意两个六聚体单元相对方向的（轻微）差异，这表明铰链区域的灵活性，以及N末端臂相对位置的实质性差异，其范围可达其他开放的12聚体结构的部分闭合。
具有构象可变NTD的多个6和12聚体结构的存在表明了NTD在暴露时的灵活性，以及高阶低聚物的更刚性。
αB的NTD对底物结合和伴侣活性至关重要。
磷酸化已被描述为影响αB的伴侣活性(40,41,48). 如图所示，具有柔性NTD的较小物种在磷酸拟态化方面的优势意味着N末端构象在伴侣活性中起着重要作用。一个关键的问题是，较小的物种是否确实是伴侣活性形式。为了验证这一点，我们以苹果酸脱氢酶（MDH）为模型底物，以肿瘤抑制剂p53为生理客户，分析了αB-3E的伴侣活性。后者已知在体外高温下具有聚集性(49,50)并与体内αB相关(51). 伴侣分析表明，αB-3E比同等浓度的αB-WT更能抑制温度诱导的MDH聚集并将其保持在可溶性部分(图S6A类和B类). 与此结果一致，抑制热诱导的p53聚集也显示出对磷酸化替代的强烈依赖性。虽然αB-WT不能阻止p53的热聚集，但αB-3E有效地抑制了光散射的形成，即已经达到亚化学计量浓度的不溶性聚集物(). αB-1E和αB-2E变异体根据引入的Glu残基的数量表现出中间活性(图S6C类). 为了证实这些发现的体内相关性，我们在体外使用纯化的丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白（MAPKAP）激酶2对αB进行酶促磷酸化。Hsp27和αB被证明是该激酶在体内的底物(38,52). αB内的两个Ser残基Ser-53和Ser-59存在于MAPKAP激酶2的优选肽序列Hyd-X-Arg-X（2）-Ser中（其中Hyd是一个大的疏水残基）。我们使用Phos-tag凝胶确认了改性(图S4B类). 磷酸化αB（αB-磷酸）的平均低聚物尺寸减小(图S4A类)对MDH更有效的聚集抑制证明了伴侣功能的增强(图S6A类)和p53(图S6C类).
模拟磷酸化对伴侣功能的影响。(A类)p53聚集。在42°C下通过热休克诱导1µM p53（蓝色）的聚集，并在350 nm下通过吸光度进行监测。在存在0.5µM各自的αB变体的情况下，评估αB-WT（黑色）、αB-3E（红色圆圈）、N末端缺失突变体αB-ΔNTD（茶色）和αB-6E（灰色）的伴侣活性。注意，αB-WT和αB-ΔNTD无法抑制光散射聚集物的形成。(B类)通过离心分离（10 min，10000×克). 尽管在αB-WT存在的情况下，在颗粒部分中发现了大量p53，但αB-3E能够将几乎所有p53保持在可溶性底物/伴侣复合物中。注意，αB-ΔNTD不能结合p53。(C类)荧光SV-AUC分析FAM标记的p53单独（灰色）和与αB-3E复合（蓝色）。根据c（s）分布，配合物的大小介于αB-3E（红色）和αB-WT（黑色）之间。
使用FRET SX动力学()和荧光AUC实验(图S2F类)，我们发现αB-WT和αB-3E动态交换亚基以形成混合低聚物。有趣的是，在保持αB-3E总浓度恒定的同时，随着αB-WT数量的增加，WT/3E杂合物对p53的伴侣活性降低(图S6D类). 因此，αB的保持酶活性不是由磷酸模拟亚基的总量决定的，而是由低聚物的性质决定的，更准确地说，是NTD的平均构象状态。
为了确定αB-3E系综中的结合活性物种，我们用荧光染料（FAM）标记p53，允许p53-αB-3E复合物形成，并用SV-AUC分析它们。使用荧光检测系统，我们专门监测了游离p53-FAM和所有含有p53-FAM的配合物。根据c（s）分布()在αB-3E存在下，p53-FAM的计算s值从4.9S移动到11S。此外，αB-3E/p53-FAM配合物的大小介于αB-3E和αB-WT之间，最大分布比αB-3E.大1S。结果表明，p53优先与较小的αB-3E低聚物结合，并支持N末端灵活性在p53识别和结合中的关键作用。NTD对αB伴侣功能的功能重要性进一步得到证实，一个缺失NTD的突变体（αB-ΔNTD）不能抑制p53的热诱导聚集()和MDH(图S6A类). 虽然αB-ΔNTD与αB-6E类似，组装成小寡聚物(图S4A类)，它没有形成稳定的底物络合物或与客户聚集(;图S6B类). 尽管引入了大量带负电荷的Glu残基，但αB-6E对两种测试底物的聚集抑制效果最好(;图S6A类). 因此，NTD在小寡聚物环境中的结构灵活性和溶剂可及性对于客户绑定至关重要，而不是小寡聚物本身的存在。
为了测试αB-3E识别和结合热不稳定底物蛋白的增强能力是否不仅限于体外客户，而是一个一般特征，我们对HeLa细胞裂解物进行热应激，并通过SDS/PAGE分析可溶性和不溶性部分。在缺乏αB-WT或αB-3E的情况下，在不溶性部分中发现了大部分裂解蛋白(图S6E类). 在存在αB变体的情况下，在可溶部分中发现了较大比例的蛋白质。与αB-WT相比，需要较低浓度的αB-3E才能产生这种效果(图S6E类). 通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）对颗粒部分进行分析，产生了300多种蛋白质，属于受αB保护的蛋白质组的热敏部分（见数据集S1对于完整列表），表明与展开多肽的结合相当混乱，这与αB在蛋白质组保护中的一般功能一致。
N终端灵活性有助于Hsp70系统重新激活客户端。
为了有效地重新折叠sHsp-稳定的非天然蛋白质，需要与ATP-依赖性伴侣进行合作(27,28,53). 为了阐明αB-3E中NTD的调制特性是否影响Hsp70系统的客户复性，我们监测了以Hsc70和Hdj1为复性系统，以αB-WT或αB-3E为持酶条件下MDH酶活性的恢复。正如预期的那样，客户端释放和重折叠严格依赖于ATP的存在，并且需要Hsc70和Hdj1(). 有趣的是，与αB-WT相比，αB-3E的存在使MDH的最终产量几乎提高了两倍，尽管在每种情况下，MDH聚集都被完全抑制(,插入).
基质结合和与Hsp70伴侣系统的相互作用在客户端重塑中。在没有αB-WT和αB-3E的情况下，MDH在46°C下变性。随后，在人类Hsc70混合物的存在下重新激活了未激活的MDH(70)Hsp40 cochaperone Hdj1（J）和ATP再生系统。通过其酶活性来评估MDH的再活化。复折叠产量基于同等处理的本地对照的活性。不含任何重折叠成分、含Hdj1/ATP和含Hsc70/Hdj1/1无ATP且未产生任何重折叠的样品用星号标记。(插入)实验条件确保了MDH的完全聚集抑制。
对于p53，利用EMSA通过其DNA结合能力来探测热变性p53的重折叠。这里，当在αB-3E存在下进行热失活时，还观察到Hsc70和Hdj1对p53的ATP依赖性复性(图S7)而αB-WT不允许p53重新激活。与MDH的结果类似，Hsc70和Hdj1都不足以重建DNA结合活性p53。
从上述结果中，我们得出结论，αB-3E系综中增强的N末端灵活性不仅对与去折叠多肽的杂乱结合至关重要，而且还促进下游依赖ATP的伴侣分子对其重新激活。
讨论
sHsps是一个古老而有效的保护系统，能够在蛋白毒性应激条件下结合去折叠蛋白(54——56). 大多数sHsps，其中也包括人类αB，显示出异常的结构可塑性(21). 要了解sHsps对细胞伴侣机制的贡献，首先要揭示其结构、动力学以及底物结合和伴侣活性调节之间的机制联系。
由于磷酸化常常与构象变化相耦合，并且αB的所有主要体内磷酸化位点都位于其NTD内，我们推断NTD为构象变化提供了关键的开关点。我们使用不同的实验方法来表征各种αB磷酸拟态突变体。如下文所述，这些结果揭示了NTD在αB机制中的双重作用：它对αB低聚物的组装和动力学起决定性作用，并在调节αB活性中充当可调构象传感器().
αB分子伴侣机制的模型。未经修饰的WT蛋白主要形成高阶低聚物，如图中所示的对称24聚体。低聚物平衡中的主要αB物种用深蓝色表示；不太丰富的是浅蓝色的。为了应对压力，激酶通过NTD内的磷酸化激活αB（用黄色圆圈表示），从而导致部分分解为较小的低聚物，主要是12、6和二聚体。在这些物种中，以增加灵活性和可访问性为特征的NTD可以调节非本地客户端的高效绑定。稳定的αB受体复合物的形成阻止了蛋白质聚集，并为Hsp70伴侣机依赖ATP的复性创造了一个折叠竞争性受体分子库。然而，由于存在少量具有可获得NTD的较小寡聚体，αB-WT也表现出对非天然蛋白质的基本伴侣活性。高级低聚物是否也是活性伴侣尚待确定。
与αB相比，拟磷酸突变体的平均低聚物尺寸减小，加上半胱氨酸交联和FRET测定，表明NTD中引入的负电荷的紧密接近使低聚物接触不稳定，反过来，通过加速高阶低聚物的离解，提高SX速率。此前，已有报道称，C末端IXI基序与相邻单体ACD内疏水沟槽结合的波动可以确定αB中的亚基交换过程(24). 虽然这种相互作用可能对低聚物动力学有贡献，但我们的结果和其他sHsps的结果(33,57)提示了NTD介导的亚单位间接触在低聚物动力学中的重要作用。
我们使用低温电子显微镜/单粒子分析进行的结构研究表明，αB的模块化组装原理(17,18)在突变体αB-3E中保持保守。αB-3E系综的一个显著特征是由六聚体构建块组成的物种占主导地位，例如6-和12-单体，因为在容纳NTD的六聚体组装位置，高阶低聚物的离解趋势增强。从6-和12-mers的3D重建来看，很明显，向NTD中引入电荷不会在很大程度上影响ACD介导的亚单位相互作用，从而导致αB二聚体的形成，也不会影响CTE介导的相互作用，因为它们的六聚体单位结构保持不变。
我们研究的一个有趣发现是，在较小的αB-3E低聚物中，NTD的柔韧性增加，整体表面疏水性增加。在磷酸化变体中，高阶低聚物的离解使得NTD可以溶剂进入，并允许它们采样多个构象状态。这种情况最好描述为NTD的有序-无序转变：当在高阶低聚物中参与亚基间相互作用时，它们更加受限，而当暴露于较小物种的溶剂中时，它们更无序。在其他伴侣的客户互动中也发现了有序到无序的转变(58——60). 一般来说，已知内在无序区域会促进结合混乱，因此可能对伴侣结合结构和序列不同的客户端的能力很重要(61——63). 因此，对于αB，NTD的结构灵活性可以解释在适应多个客户时观察到的混杂现象。由于在柔性NTD内检测到许多哺乳动物sHsps的磷酸化位点，因此很容易推测所描述的激活机制具有普遍相关性。此外，真核蛋白的翻译后修饰优先发生在无序区域(61)，约75%的磷酸化位点位于已知Pfam结构域之外(64).
αB-3E中具有柔性NTD的小寡聚体增多的功能后果是更有效的伴侣活性。对于与非天然蛋白质的相互作用，NTD中疏水残基的暴露可能很重要，因为缺少整个NTD的突变体无法形成稳定的底物复合物。在αB-WT中，NTD很可能表现出类似的性质。然而，由于具有“自由”NTD的低聚物仅在αB-WD系综中的低丰度下出现，因此它们对伴侣活性的贡献将相当低。这一结论与正常条件下αB的结合亲和力降低一致，并支持αB的整体性质由激活和休眠储存组件的相对频率决定的观点。NTD的构象状态对细胞中的下游过程也很重要(65). 我们的结果表明，对于较小的αB低聚物，Hsp70和Hsp40对αB结合客户端的折叠更有效。我们研究中使用的伴侣系统不能完全模拟复杂的细胞折叠机制。例如，Hsp90可能在体内p53折叠中起作用(66,67). 我们表明，与WTαB-crystallin相比，Hsp70/40系统与3E突变体的协同效率更高。更有效的复性表明，αB-3E要么以不同构象结合底物，要么促进Hsp70系统的可接近性。
NTD中磷酸化（模拟物）引入的负电荷似乎不会对客户交互作用产生负面影响。关于对结构和功能的影响，我们无法观察到所研究的磷酸化位点之间的主要差异。在体内，大多数磷酸化形式的αB被发现在一个或两个丝氨酸残基上修饰(37). 不同的Glu突变体表现出与引入的拟磷酸残基数量相关的活性。因此，多个位点的存在可能会根据细胞的需求调节αB对未折叠蛋白的结合亲和力，这些位点会根据不同的应激条件进行差异磷酸化。
总之，我们的结果支持的观点表明，NTD的结构灵活性使αB能够作为一种针对非天然蛋白质的可调构象传感器。根据这一原理，其他触发器是否也激活αB或sHsps的伴侣功能尚待确定。
材料和方法
克隆和蛋白质纯化。
如前所述，克隆并纯化了αB的所有变体(22). 使用与αB-WT类似的方案，使用Superdex 75-pg色谱柱（GE）作为第二个纯化步骤，纯化αB-ΔNTD（残基67-175）。Hsc70如其他地方所述进行纯化(68)使用Superdex200 SEC列（GE）作为附加的最后一步。对于Hdj1型基因表达，大肠杆菌用Hdj1-pET21b质粒转化BL21（DE3），在37℃下培养细胞，并用1 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导。将清除的裂解液涂敷在与TE缓冲液（50 mM Tris和2 mM EDTA，pH 7.5）平衡的SP Sepharose柱（GE）上。将合并的级分加载到PBS中的Superdex 200pg柱上。如前所述克隆和纯化人p53(69).
第四纪结构分析。
如前所述，通过分析凝胶过滤（SEC）和AUC对所有αB变体进行四元结构分析(17,22). 有关详细说明，请参见SI材料和方法.
EM和图像处理。
如前所述进行阴性染色实验(17,22). 对于冷冻-EM，将3μL蛋白质溶液（0.2 mg/mL）涂敷在辉光多孔碳格栅（Quantifoil，Multi-A）上，并在液体乙烷中冷冻，以吸走多余的溶液。在低剂量条件下，使用在120 kV下操作的JEOL JEM-2011透射电子显微镜，以49500倍的校准放大率记录显微照片。
如前所述，通过投影匹配循环进行6-、12-和24-mers的3D重建(17). 有关图像处理的更多详细信息，请参阅SI材料和方法.
外源和内源荧光。
对于ANS结合研究，将10μM蛋白质与1 mM ANS混合在PBS缓冲液中。使用FluoroMax 3光谱仪（Jobin-Yvon）在37°C下记录荧光光谱，波长范围为400至520 nm，激发波长为372 nm。添加ANS后的信号强度在2小时以上保持不变，并且ANS的存在不会影响SV-AUC验证的低聚物平衡。
在20µM蛋白质存在下，通过逐步添加丙烯酰胺（5M）来猝灭固有探针Trp60的荧光。荧光监测采用Fluoromax 3（Jobin Yvon）。实验在37°C的PBS缓冲液中进行。
亚单位交换动力学。
根据制造商的方案，在PBS中室温下用荧光素黄碘乙酰胺（LYI）和4-乙酰氨基-4'-[（碘乙酰）氨基]二苯乙烯-2,2'二磺酸（AIAS）（均来自分子探针）标记αB-WT的S153C突变体2小时。使用HiPrep 26/10脱盐柱（GE）去除未结合的标记分子。在测量之前，供体和受体标记的蛋白质（每个1µM）分别在37°C的PBS中培养。以等摩尔比混合标记的αB低聚物，并在30°C下培养过夜，以通过亚基交换产生饱和能量转移。将25倍摩尔过量的未标记αB-WT或αB-3E添加到该FRET杂低聚物中，使用Fluoromax 3（Jobin Yvon）在37°C下记录荧光光谱。根据Bova等人(23).
用α-糜蛋白酶进行有限的蛋白质水解。
在100 mM Tris、100 mM NaCl和10 mM CaCl中以1:25（wt:wt）的比例将αB（10µM）与α-糜蛋白酶（Sigma）孵育2pH 7.8，在25°C下保持30分钟。在不同时间点（0–45分钟）后，用2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF；Sigma）终止蛋白质水解反应，并用SDS/PAGE在15%丙烯酰胺凝胶上分析，然后进行考马斯蓝染色。通过LC-MS鉴定了裂解产物和蛋白水解位点(SI材料和方法).
聚集分析。
所有聚集分析均在配备温度可调试管支架的Varian Cary 50 UV/Vis分光光度计（安捷伦）中进行。底物蛋白质的聚集是由热引起的。随着浊度引起的信号增加，聚集反应在350 nm处随时间变化进行监测。通过SDS/PAGE和考马斯染色评估在无或存在αB的情况下，受试者在热休克后的溶解度。通过离心（10分钟，10000×克，4°C）。在第一步离心后，通过在PBS中重新悬浮颗粒来清洗不溶性部分，然后进行第二步离心。
HeLa裂解物的热聚集。
HeLa细胞裂解物(SI材料和方法)在45°C下，在不同量的αB存在下进行40分钟的热应力。如上所述，将可溶性和不溶性蛋白质级分分离并洗涤。
MDH复性。
MDH（2µM；在25 mM Hepes、50 mM KCl、5 mM MgCl中2和1 mM DTT，pH 7.4）在有或无αB-WT或αB-3E（10µM）的情况下在46°C下培养45分钟。将MDH样品在冰上冷却，并通过添加包含Hsc70（2µM然后移至30°C，在不同的时间点后取样。将每个样品的10微升与190µL分析缓冲液（0.5 mM草酰乙酸和0.2 mM NADH）混合。在Varian Cary 50 UV/VIS分光光度计（安捷伦）中，在340 nm的波长下，在30°C下测量MDH活性15分钟。
p53再活化测定。
在没有或存在15µMαB-WT或αB-3E的情况下，将p53（3µM）在42°C下培养30分钟，培养液为25 mM Hepes、150 mM KCl和5 mM MgCl2pH值7.4。作为阳性对照，p53保持在4°C。在存在ATP再生系统（3 mM磷酸烯醇丙酮酸、20µg/mL丙酮酸激酶和2 mM ATP）的情况下，在25 mM Hepes、150 mM KCl和5 mM MgCl中使用2µM Hsc70和0.5µM Hdj1对p53进行再活化2和1 mM DTT，pH 7.4，在30°C下270分钟，在25°C下30分钟。为了测定p53 DNA结合活性，进行了EMSA(SI材料和方法).
致谢
我们感谢马克·韦默（Marc Wehmer）、索尼娅·施密德（Sonja Schmid）和弗兰齐斯卡·蒂佩尔（Franziska Tippel）提供的全面实验帮助，感谢奥利弗·洛伦茨（Oliver Lorenz）提供的纯化Hsc70，感谢伊娃·克里胡伯（Eva Kriehuber）提供的HeLa细胞。J.B.和S.W.由德意志联邦基金会（SFB1035）资助。J.P.承认德国沃尔克斯研究所的博士奖学金。
工具书类
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