VAAST 2.0：使用保守控制氨基酸替代矩阵改进变异分类和疾病基因鉴定

摘要

介绍

传统上，全基因组关联研究（GWAS）被用于使用分布在基因组中的一组“标记”单核苷酸多态性（SNPs）来识别疾病相关变异。然而，GWAS方法在检测罕见偶然变异的影响方面能力不足，因为它们通常与标记SNP处于较差的连锁不平衡状态Visscher等人，2012年新的测序技术大大降低了人类基因组重新测序的成本，并正在鉴定许多新的罕见变体。因此，对于疾病基因研究而言，对这些罕见变体的分类和优先排序已成为一个重大问题。

迄今为止，已经开发了几种变体优先排序工具来识别个人基因组数据中的破坏性等位基因。SIFT公司Ng和Henikoff，2006年和校准GV-GDTavtigian等人，2006年例如，使用多重比对来分析新氨基酸变化变体的保守性水平，其基本假设是，改变蛋白质序列中高度保守位置的序列变体更可能具有破坏性。最近出版的两种算法，PolyPhen-2Adzhubei等人，2010年和突变品尝器施瓦兹等人，2010年，改进这一基本方法，将其他信息（如蛋白质结构变化）集成到计算中，从而与SIFT相比，显著提高了其变化优先排序的准确性Ng和Henikoff，2006年.

许多变体优先化工具的一个主要缺点是，它们只能优先化系统发育保守编码区内的变体，因此在整个蛋白质组中覆盖率很低。例如，SIFT和PolyPhen只能分别获得人类蛋白质组的60%和81%Adzhubei等人，2010年这些方法的另一个弱点是它们没有利用等位基因频率信息。人们早就知道，次要等位基因频率（MAF）与净化选择压力呈负相关Kryukov等人，2007年因此，公开可用的人类基因组数据库（例如，HapMapThorison等人，2005年1000基因组计划（1KGP）Altshuler等人，2010年和dbSNPSmigielski等人，2000年提供有价值的频率信息，原则上可用于变量优先级。VAAST公司Yandell等人，2011年在这两方面都是向前迈出的一步，因为它使用了一种变体分类方法，将氨基酸替代（AAS）信息与变体频率信息结合起来，使其能够以更高的准确性对所有变体进行评分，无论它们位于基因组中的何处Yandell等人，2011年.

然而，扩大VAAST方法的范围是有代价的：VAAST在其最初的形式中，没有利用任何系统发育保育数据。在本研究中，我们描述了VAAST变体优先级方法的扩展，该方法利用守恒控制的AAS矩阵（CASM）来克服这一缺点。CASM方法允许VAAST对基因组中的每个变体进行评分，同时利用系统发育保守性信息。我们在这里提供的基准分析表明，CASM方法产生了迄今为止最高的变体优先级准确性。

利用罕见的变异体进行疾病基因鉴定是另一个挑战。一种方法是简单地搜索病例基因组中稀有变异密度增加的区域。这是ANNOVAR采取的方法Wang等人，2010年它允许用户对dbSNP或1000基因组项目中观察到的不同频率设定阈值Altshuler等人，2010年;Smigielski等人，2000年，排除了人口频率高于用户定义阈值的变体。该工具的一个优点是它可以使用第三方变量优先排序分数，如SIFT和PolyPhen生成的分数，以提高搜索准确性；其主要缺点是，排除MAF高于用户定义阈值的变体会导致该工具无法搜索包含分布在一系列人群频率上的致病等位基因的数据集。作为回应，出现了克服这一局限性的概率方法。这些测试聚合了来自基因中每个变体的优先级信息，以获得更大的统计能力，从而避免了多次测试需要大量统计校正。这些工具包括CASTMorgenthaler和Thilly，2007年、CMCLi和Leal，2008年、WSSMadsen和Browning，2009年、KBACLiu和Leal，2010年，VTPrice等人，2010年、SKATWu等人，2011年和VAASTYandell等人，2011年虽然每种算法处理问题的方式不同，但所有算法都显式或隐式地使用MAF信息来加权变量。此外，VT和VAAST 2.0还可以使用第三方变量优先级工具（如PolyPhen和PhastCons）的功能预测杨，1995至重量变量Price等人，2010年。我们将这些方法统称为聚合变量关联测试.

迄今为止，聚合变异关联测试被视为识别与常见疾病相关的基因和变异的一种手段。然而，作为罕见疾病基因发现者的不同关联测试的性能特征在很大程度上仍然未知。到目前为止，人口归因风险（PAR）、等位基因和基因座异质性等因素对其识别罕见和常见疾病相关基因和等位基因的能力的影响也很大程度上尚不确定Madsen和Browning，2009年.

在这里，我们描述了VAAST的新版本（VAAST 2.0）和CASM方法。我们使用各种数据集对VAAST 2.0进行基准测试，系统地将其性能与原始版本的VAAST进行比较Yandell等人，2011年以及其他已发布的关联测试，包括WSSMadsen和Browning，2009年、KBACLiu和Leal，2010年、SKATWu等人，2011年和VTPrice等人，2010年我们的结果证明了CASM方法对VAAST的改进是可能的；它们还提供了一个通用框架，用于使用已发布和模拟数据集研究不同聚合变量关联测试的性能。这些结果揭示了在个人基因组数据中搜索致病等位基因的复杂性，因为它们揭示了不同方法在不同场景下的意外优势和劣势，为每种方法的未来改进提供了路线图。

材料和方法

CASM方法

VAAST使用扩展复合似然比检验（CLRT）来确定基因组变异的严重程度评分Yandell等人，2011年CLRT的空模型表明，在对照人群（背景基因组）和病例人群（目标基因组）中，变异或变异群的频率相同，而替代模型允许这两个频率不同。在二项分布下，两种模型的可能性都可以根据对照和病例数据集中观察到的等位基因频率来计算。在VAAST 1.0中，该似然比（LR）由AAS严重性参数进一步更新(一_我/小时_我)，其中小时_我AAS与疾病无关的可能性一_我就是这样的可能性。我们估计小时_我通过将其设置为背景人群中这种氨基酸变化的频率，以及一_我将其设置为OMIM中所有致病突变中氨基酸变化的频率。VAAST 1.0使用(一_我/小时_我)模拟每个氨基酸变化的严重程度。然而，这种方法没有考虑到蛋白质在该位置的系统发育保守性，理论上可以用来提高(一_我/小时_我). 在VAAST 2.0中，我们通过使用额外的保守性测量PhastCons扩展了这个严重性参数杨，1995分数；这些分数估计该位点处于负选择状态的概率，并使用多物种核苷酸比对进行计算。

CASM的操作如下：首先考虑一个发生在基因组中某个位置的变体，该变体具有某些PhastCons评分，并将缬氨酸（V）变为丙氨酸（a）。为了计算严重性参数，我们首先计算在疾病和非破坏性变体数据库中任何保守水平下V到A引起变体的相对频率。实际上，由于疾病数据库中此类变体的数量可能有限，这种方法受到了阻碍。为了克服这个问题，我们从估算开始(一_我/小时_我)对于PhastCons得分为0和1（两个终点）的每种氨基酸，如下所示。对于任何给定类型的AAS我(我= 1, 2,…,米)，假设有n个_我疾病数据库中的变体和每个变体j个（j=1，2，…，n个_我)PhastCons评分为P（P）_ij公司。因为P（P）_ij公司可以解释为变异体位于保守位点的概率杨，1995，可通过以下公式估计变异引起疾病的可能性

(1)

PhastCons得分为1的变体，以及

(2)

PhastCons得分为0的变体，其中C类_D类是用于训练的疾病等位基因数据库中的变体总数。类似地，使用非破坏性变体数据库，可以通过以下方式估计变体不致病的可能性

(3)

PhastCons得分为1的变体，以及

(4)

PhastCons得分为0的变体，其中C类_N个是用于训练的无损伤等位基因数据库中的变体总数。

因此，AAS类型的严重性参数我PhastCons得分为0，1为(一_我0/小时_我0)和(一_我1/小时_我1)分别是。对于具有其他PhastCons评分的变体(x；0<x个<1），通过以下各项的线性组合来估计可能性(一_我0/小时_我0)和(一_我1/小时_我1)即，

(5)

哪里一_九/小时_九是CASM中的条款。这提供了对给定氨基酸变化的LR的估计，该氨基酸变化是病态的还是非破坏性的，受控于基因背景中的系统发育保守性水平。支持信息中详细介绍了CASM方法的培训和测试程序。

除非另有说明，否则我们使用人类基因突变数据库（HGMD）中的变体计算严重性参数库珀等人，1998年作为疾病变体并使用1000基因组项目中的变体（第一阶段数据）Altshuler等人，2010年带有MAF^三0.05作为非破坏性变体。我们首先使用来自三种不同基因组比对的PhastCons评分在一个小测试数据集上评估CASM：UCSC脊椎动物、哺乳动物和灵长类Karolchik等人，2004年脊椎动物比对产生了最准确的CASM评分，并用于所有后续分析。

结果

变量优先级

我们将VAAST 2.0的性能与其他变体分类器进行了比较。而SIFT、PolyPhen和Align-GD等工具Adzhubei等人，2010年;Ng和Henikoff，2006年;Tavtigian等人，2006年无法对缺少多序列比对信息的区域进行评分，VAAST 2.0没有这样的限制。在没有核苷酸或蛋白质保护数据的地区，VAAST 2.0使用等位基因频率和全球氨基酸变电站频率作为变体优先排序的基础；在有保护信息的地区，VAAST 2.0用PhastCons得分补充了这一信息杨，1995它覆盖了99.9%的人类蛋白质组。为了进行这一比较，我们将基准分析局限于所有四种算法（SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster和VAAST 2.0）都可以评分的变体。然而，应该记住，除此之外，VAAST还可以对这些数据集中的许多其他变量进行评分，而其他工具无法做到这一点。

为了评估每种工具的优先级性能，我们使用一组非破坏性变体（从1000基因组项目（1KGP）试验阶段随机抽取）绘制了每种算法的接收器-操作员曲线Altshuler等人，2010年)和一组致病变异体（来自HGMD数据库）（有关详细信息，请参阅支持信息）。图1A结果表明，VAAST 2.0和1.0的准确性明显优于其他算法，当假阳性率（FPR）为5%时，VAAST-2.0和VAAST-1.0的真阳性率（TPR）分别达到76%和68%。第三个最好的工具是MutationTaster，在相同的FPR水平下，它的TPR比VAAST 2.0低23%。VAAST 2.0仅使用CASM方法，无需求助于可变频率信息（中的“CASM”图1)是性能第四好的方法，其次是PolyPhen-2和SIFT。我们还计算了每种算法在FPR=0.05时的曲线下面积值和精确度，这表明了相同的趋势（表​（表11).

表1

变量优先级性能基准

	电子烟1.0	VAAST2.0公司	CASM公司	SIFT公司	聚苯基-2	变异品尝器
曲线下面积（AUC）
数据集1（HGMD+1KGP）	0.95	0.96	0.83	0.76	0.8	0.87
数据集2（罕见BRCA公司变体）	0.68	0.87	0.86	0.73	0.76	0.85
FPR为0.05时的精确度
数据集1（HGMD+1KGP）	0.81	0.86	0.68	0.57	0.62	0.74
数据集2（罕见BRCA公司变体）	0.53	0.72	0.72	0.52	0.62	0.68

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图1

变体优先化工具的接收方操作员曲线（ROC）。使用两个基准数据集显示了VAAST 1.0、VAAST 2.0、CASM、SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster的ROC：（A）来自HGMD和1000基因组项目的常见和罕见变体；（B）巴西航空公司1和巴西航空公司2稀有变量集。x个-axis：假阳性率；年-axis：真阳性率。虚线表示假阳性率为0.05。

对于第二个变量优先级基准，我们使用一组143个罕见的错义变量比较了每种算法的性能巴西航空公司1和巴西航空公司2由第三方评估临床意义的基因Easton等人，2007年此变体集不同于用于生产的HGMD/1KGP变体图1A其中数据集用于生成图1A包含非损伤和有害等位基因的常见和罕见变体，而这一组图1B仅包含非常罕见的变体（MAF<<1%）。本基准分析的结果如所示图1B和表​表1。1由于此集合中的大多数变体只被观察到一次，因此VAAST 2.0不能使用等位基因频率信息来提高其功率，因此在这种情况下，完整VAAST 1.0算法的性能仅略优于CASM方法。尽管如此，VAAST 2.0仍然是最准确的分类器。在FPR=0.05时，VAAST 2.0的准确度比第二好的分类器MutationTaster高4%。

HGMD/1KGP数据集上VAAST 1.0和2.0的变量优先级精确度(图1A和表​表1）1)非常相似。这是因为，在这个数据集上，这两种算法的大部分能量都来自控制群体中的变异MAF信息。然而，在此类信息不可用的情况下（例如，所有变体都同样罕见），VAAST 1.0的准确度会下降，而VAAST 2.0仍然可以使用CASM方法准确预测变体的严重性。这可以通过BRCA公司变量基准数据集图1B和表​表11.

多基因常见病的基准分析

接下来，我们使用三个不同的基于序列的疾病基因数据集比较了六种聚合变异关联测试的功效。使用的三个数据集是二氧化氮与克罗恩病有关Lesage等人，2002年;低密度脂蛋白与高甘油三酯血症有关Johansen等人，2010年; 和CHEK2（检查2），一种与乳腺癌有关的基因Le Calvez-Kelm等人，2011年。在二氧化氮数据集中，存在罕见和常见变体，而在低密度脂蛋白和CHEK2（检查2）数据集。在每项研究中，都报告了患病和对照个体的基因型或等位基因频率数据。在后一种情况下，假设变异之间没有连锁不平衡，则模拟病例和对照基因组的基因型。表中列出了三个数据集中每个数据集的汇总统计数据​表2。2。我们使用bootstrap方法计算功率。具体来说，我们对病例和对照组进行了替换抽样，评估了达到统计显著性的重抽样数据集的比例Yandell等人，2011年我们使用了2.4×10的全基因组显著性水平⁻⁶对于二氧化氮和低密度脂蛋白。对于CHEK2（检查2），我们将显著性水平设置为0.0005CHEK2（检查2）与原始研究一致Le Calvez-Kelm等人，2011年.

表2

的特征编号2,低密度脂蛋白、和CHEK2（检查2）数据集

	每个病例基因组的平均变异数	比值比>1的变体数量	独特的多位点基因型数量	标准一
二氧化氮	1.19	27	566	44.7%
低密度脂蛋白	0.10	10	14	8.4%
CHEK2（检查2）	0.05	22	30	3.81%

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^一人群归因风险（PAR）计算为所有易感性变量的PAR值之和。

在所有三个数据集中，VAAST 2.0始终是最强大的关联测试(图2). 对于低密度脂蛋白例如，在样本量为400时，VAAST 2.0的功率比VAAST 1.0（第二）高10%，比KBAC（第三）高25%；对于CHEK2（检查2）在最大样本量下，VAAST 2.0的功率比VAAST 1.0高3%，比KBAC高9%（第三）；对于二氧化氮VAAST 2.0的功率比VAAST 1.0高4%，比WSS（第三）高9%。其他每一种算法似乎都有其利基。例如，KBAC在这两个数据集上表现良好(低密度脂蛋白,CHEK2（检查2）)在这种情况下，只有罕见的变异会导致疾病，但如果同时存在常见和罕见的因果变异（例如。，二氧化氮). 另一方面，WSS在这两种情况下都表现良好，并且在观察到常见变体（例如二氧化氮数据）。

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图2

对三个已发表的常见疾病数据集的功效比较。（A）二氧化氮，（B）低密度脂蛋白，（C）CHEK2（检查2）. Thex个-axis显示了病例基因组的数量和年-轴表示统计幂。功率是基于100个引导计算的。

我们还在达拉斯心脏研究数据集上对VAAST 2.0进行了基准测试罗密欧等人，2009年，其中罕见的变体角度14在3551个测序个体中发现该基因与低甘油三酯水平相关。在本研究中，我们测试了角点43551名个体中甘油三酯水平最高四分位和最低四分位之间的基因。根据原始研究，种族和性别状况相匹配罗密欧等人，2009年。对于这个基准实验，我们没有使用bootstrap方法，因为原始研究没有报告每个个体的种族和性别信息，因此我们无法使用bootstap重新创建平衡的实验抽样设计。表中报告了每项测试的未修正显著性值​表3。三。所有测试都获得了P（P）< 0.05. 与我们的其他基准一致，VAAST 1.0和VAAST 2.0获得了最低的P（P）-值。

表3

关联的重要性（显示P（P）-低甘油三酯水平和罕见变异之间角点4基因

VAAST1.0（瓦斯特1.0）	VAAST2.0公司	比利时联合航空公司	SKAT公司	及物动词一	WSS公司
0.000371	0.000508	0.00402	0.00677	0.00452	0.00402

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^一VT以PolyPhen-2分数运行。

模拟数据集的基准分析

模拟数据集提供了一个机会来研究不同方法在呈现特定挑战的数据集上的性能；例如，在不同PAR下或在不同程度的等位基因异质性下，以受控方式。出于这些原因，我们使用了以前发布的模拟框架Madsen和Browning，2009年以比较六个聚合变体关联测试的能力（有关详细信息，请参阅支持信息）。

我们首先在不同的聚合PAR下对这些测试的能力进行了基准测试Madsen和Browning，2009年值，反映所有模拟突变的聚合疾病风险。这些结果如所示图3在主导模型下，VAAST 2.0在PAR小于0.04的情况下快速实现80%的功率，并且在PAR=0.05时实现100%的功率。VAAST 2.0的功率之后是VAAST 1.0和VT，在达到80%功率之前，两者的功率都比VAAST 2.0低10–15%。相比之下，SKAT在PAR=0.06左右达到80%的功率，而WSS在PAR=0.07后达到80%。在各种PAR的隐性固有情景中也可以看到这种趋势(图3B). 注意，在这个实验中，我们假设了相同数量的因果突变位点和非因果突变位点，但我们也探索了其他比例(图4).

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图3

PAR的影响。显示了六种关联测试在不同总体归因风险（PAR）水平下的功效。x个-轴显示所有贡献变量的总PAR值；年-axis显示了基于100个引导的统计功率。（A） 显性模型，（B）隐性模型。病例数和对照数设为1000，致病等位基因和非致病等位蛋白的数量均定为50。

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图4

不同比例的有害突变位点对疾病风险的影响。x个-axis是所有模拟位点中有害突变位点的比例；年-轴统计功率。（A） 主导模型；（B） 隐性模型。总PAR固定为10%；病例/对照的数量设置为500；偶然变异的数量为50个，非偶然变异的数目各不相同。

VAAST 2.0和WSS都可以使用用户特定的继承模型（例如，显性或隐性）来增强力量。然而，对于图3，我们没有调用这些选项，因为（1）其他测试没有此类功能，并且（2）继承模型的模式并不总是已知的。在已出版的WSS手稿中Madsen和Browning，2009年如果使用遗传模型信息，在隐性模型下，WSS在PAR=0.05时达到80%的功效；相反，即使没有遗传模型信息，VAAST 2.0在PAR=0.05时的功效也为97%。

接下来，我们探讨了在保持PAR不变的情况下增加疾病变异（ND）数量的效果，以模拟等位基因异质性对不同算法性能的影响。这些结果如所示图5。每个个体观察到的实际因果变异位点数量在补充报告中报告表S1可以看出，随着ND的增加，每个变量的风险贡献随着功率的增加而降低。例如，在显性和隐性遗传模型下，当有害变异体的数量为150时，每个个体变异体的PAR仅为0.07%。在此模型下，VAAST 1.0和VAAST 2.0的功率均大于80%。具有PolyPhen2评分的室性心动过速似乎对ND值的增加具有鲁棒性，直到ND大于100。对于SKAT而言，在显性模式下ND为50到100之间，以及隐性模式下约为50之间，功率下降到80%以下。与其他方法相比，KBAC和WSS对增加ND的鲁棒性较差。我们在表中总结了每种算法实现80%功率所需的案例/控制数量​表44对于ND=5和ND=50。

表4

对仿真中80%功率所需的案例和控制进行编号^一

	占主导地位		隐性的
	ND=5	ND=50	ND=5	ND=50
VAAST1.0（瓦斯特1.0）	150	300	300	500
VAAST2.0公司	150	300	300	400
比利时联合航空公司	300	>1,000	800	>1,000
SKAT公司	200	400	300	600
及物动词	200	300	400	500
WSS公司	300	700	800	>1,000

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^一总PAR设定为10%。

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图5

不同数量有害突变位点的影响。x个-轴是有害突变位点（ND）的数量；年-axis显示了基于100个引导的统计功率。（A） 显性模型，（B）隐性模型。病例数和对照数设置为500，总PAR值设置为10%。

WSS通常表现得很好，在许多情况下都优于KBACLiu和Leal，2010年我们认为等位基因异质性的差异是造成这种差异的原因。由于KBAC计算每个多位点基因型的样本风险，在存在许多不同的偶然等位基因或常见的偶然等位点的情况下，多位点基因类型的数量迅速增长，伴随着功率的损失。这种行为在图5与此假设一致，KBAC在CHEK2（检查2）和低密度脂蛋白数据集，但在二氧化氮数据，可能是因为二氧化氮包含最多的多位点基因型（表​（表2）。2). 我们通过比较WSS和KBAC在不同数量的有害等位基因下的功效来验证这个假设（补充图S2，表S2). 当ND=2且有少于10个多位点基因型时，KBAC在达到80%的功率之前比WSS多3–5%。然而，随着多位点基因型的数量随着ND的增加而增加，KBAC的功率逐渐减弱，当多位点基因型超过40种时，KBAC的功率严重受损。此结果与它在低密度脂蛋白,二氧化氮、和CHEK2（检查2）数据集，表明KBAC可能最适合分析不同多位点基因型数量不多的数据集，如图2和​和55.

罕见孟德尔病的基准分析

VAAST被设计成一个通用的疾病基因发现者，能够识别导致罕见和常见疾病的罕见和常见等位基因Rope等人，2011年;Yandell等人，2011年尽管大多数聚合变异关联测试都是针对常见遗传病设计的，但没有任何先验理由表明它们不能应用于罕见的孟德尔病。为此，我们使用来自Yandell等人，2011年简单地说，该管道用于从OMIM数据库中随机选择100个孟德尔病致病基因，其中每个基因至少有6个致病变异体。对于这些基因中的每一个，我们将已发表的致病变异体插入到在Complete Genomics平台上测序的一到三个健康白人基因组中Drmanac等人，2010年为了模拟患病个体。对于优势方案，我们在每个病例基因组中插入了不同的单一等位基因；对于隐性情况，我们在每个病例基因组中插入了两个不同的等位基因。

所有蛋白编码基因都是根据基因型和二分法疾病表型之间相关性的重要性进行排序的。据我们所知，这是首次对罕见的孟德尔病进行聚合变异关联测试的基准。

结果如所示图6.图6报告了100个OMIM“目标”基因按等级归入四个箱子的比例；在所有蛋白质编码基因中，它们分别是bin A:1-10、bin B:11-100、bin C:101-1000和bin D:1000以上。补充的图S3报告这些相同分析的平均值。

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图6

100种不同基因组范围的已知罕见疾病基因搜索排名。面板（A）和（B）分别显示显性和隐性模型。不同的颜色表示100个OMIM“目标”基因在全基因组排名（参见插入图例）的四个箱子中所占的比例，橙色表示疾病基因在全基因前10位候选基因中所占百分比。分别调查显性和隐性疾病情景。为了对显性疾病建模，将一个因果变异插入到感兴趣的基因中，在隐性病例中插入两个不同的等位基因（每个病例基因组）。对于每个算法，显示了三列，分别对应一个个体、两个个体和三个个体。

在优势疾病场景中，VAAST 2.0仅使用一个病例基因组（一个个体），将19%的疾病基因排在全基因组前10位候选基因中，55%的疾病基因组排在前100位候选基因的前面。随着病例基因组数量的增加，性能显著提高。只有两个病例基因组，79%的疾病基因在全基因组排名前10位；在三个病例的基因组中，90%的疾病基因在前十名中。在隐性模型下，VAAST 2.0的性能甚至更好。例如，只有一个病例的基因组中，73%的疾病基因排在前10位，而有两个病例的疾病基因中，97%的基因排在了前10位。我们注意到，在这一基准分析中，在大多数情况下，VAAST 2.0的性能与VAAST 1.0非常相似，这表明CASM方法主要在包含常见因果变异或复杂疾病病例的数据集上提高性能。

该分析最有趣的一个方面是，尽管我们在分析中包括了常见的非同义SNV，但普遍发现大多数关联测试在这些数据集上表现良好，这可能违反许多负荷测试的基本假设。例如，使用前10名作为实证显著性水平，样本量为3，在主导模型下，VAAST 2.0达到90%的功效，WSS达到82%，KBAC达到73%的功效。在隐性模型下，VAAST 2.0达到100%功率，WSS达到99%，KBAC达到74%功率。因此，这些分析表明，尽管已经针对常见的多基因疾病开发了一些聚合变异关联测试，但这些测试是极好的罕见孟德尔病基因发现者（例如WSS、VT和KBAC）。为了进行比较，我们还分析了SIFT和ANNOVAR在罕见疾病基因鉴定中的性能Ng和Henikoff，2006年;Wang等人，2010年正如所料，与其他测试相比，SIFT表现不佳。ANNOVAR作为一种鉴定罕见孟德尔病基因的最先进方法，与SIFT相比有优势，但总体上相对于关联测试表现不佳（参见补充图S3）。例如，仅使用VAAST 2.0和ANNOVAR的一个隐性病例的功效分别为73%和14%。这表明，与更复杂的稀有变量关联测试相比，基于过滤的方法在鉴别罕见孟德尔病方面并不理想。即使病例样本大小只有一个基因组那么小，情况也是如此。

讨论

系统发育保守性是区分良性变异和致病变异的宝贵信息来源。确定将此信息用于变量优先排序和关联测试的最佳方法，但这仍然是一个悬而未决的问题。变量优先化工具，如SIFTNg和Henikoff，2006年使用同源蛋白的多重比对，判断一个人类变异体是否改变了一个高度保守的氨基酸，从而造成损害。PolyPhen-2更进一步，利用蛋白质结构信息Adzhubei等人，2010年由于SIFT和聚Phen-2依赖于守恒信息，它们只能在守恒位置对变体进行评分。VAAST 1.0实现了一种不同的方法。VAAST 1.0没有评估多重比对的单个列来判断编码变体的影响，而是使用了在基因组中任何地方的任何基因中观察给定AAS的全球全基因组频率。在这方面，VAAST 1.0中的AAS矩阵与Grantham矩阵有一些相似之处格兰瑟姆，1974年，它量化了氨基酸变化之间的性质差异，除了VAAST 1.0根据经验估计了使用已知致病等位基因的每种AAS有害或中性的可能性。这意味着VAAST可以对每一个编码变化进行评分，而不管是否有特定基因，也不管其蛋白的特定区域是否保守。尽管这种方法有更广的范围，但VAAST 1.0无法利用特定位置的保护信息。因此，这项工作的基本动机是保持为基因组中的每个编码变体提供信息评分的能力，同时利用多序列比对提供的详细信息。CASM评估整个蛋白质组中AAS的全球频率，因此即使很少或没有局部比对，也仍然能够进行推断。虽然PhastCons在这些位置的得分信息量较小，但CASM仍然可以从氨基酸变化类型推断严重程度。作为图1表明，CASM方法为该问题提供了一个有效的解决方案，与其他最先进的工具相比，VAAST 2.0在变量优先级方面具有显著优势。

然而，VAAST 2.0不仅仅是一个变量优先化的工具；它也是全基因组搜索的工具。因此，VAAST是过去几年发表的几个综合变量关联测试之一Li和Leal，2008年;Liu和Leal，2010年;Madsen和Browning，2009年;Morgenthaler和Thilly，2007年;Price等人，2010年;Wu等人，2011年虽然已经发布了几个基准Ladouceur等人，2012年;Liu和Leal，2010年;Madsen和Browning，2009年;Price等人，2010年;Wu等人，2011年我们首次系统地比较了这些方法在不同疾病数据集（真实和模拟）以及常见和罕见疾病中的性能。在这些分析中，VAAST 2.0始终优于VAAST 1.0、WSS、VT、KBAC和SKAT，但性能优势因数据集而异。事实上，我们基准测试分析的一个重要结论是，没有一个单独的数据集是真实的或模拟的，这足以对聚合变量关联测试进行基准测试，因为这些工具显示了复杂的行为。图2提供了一个很好的例子。总之，我们的分析显示了病例对照数据集的三个基本特征如何影响不同工具的性能。这些是（1）疾病等位基因的数量；（2） 等位基因频率；（3）他们的集体PAR。

KBAC和SKAT的性能曲线突出了所有关联测试对这三个因素的总体敏感性。例如，KBAC显然对给定PAR的有害等位基因数量非常敏感(图5). 由于KBAC估计每个独特的多位点基因型的样本风险，当多位点基因类型的数量较多且每个基因型的疾病风险相对较低时，KBAC的功效受到损害。KBAC在二氧化氮数据集，相比之下，它在CHEK2（检查2）和低密度脂蛋白数据集进一步说明了这种行为。这个编号2该数据集包含566个独特的多位点基因型，包括一个单一的共同变异（MAF 27.7%），解释了该数据集总PAR的47%。相比之下低密度脂蛋白和CHEK2（检查2）病例数据集分别只包含14种和30种不同的基因型（表​（表2）2)而且它们所有的有害变体都很罕见。

虽然SKAT在我们的模拟研究中表现良好，但在三个实际数据集上表现不佳。它在低密度脂蛋白和CHEK2（检查2）例如，数据集表明，SKAT不适合分析具有少量偶然变异的数据集，这些变异导致相对较小的总PAR（8.4%低密度脂蛋白和3.81%CHEK2（检查2）). 为了测试SKAT在这些数据集上表现不佳是否是因为它没有对低风险罕见变异进行分组，我们使用VAAST对低密度脂蛋白并在运行时将此信息传递给SKAT。这种方法提高了SKAT的统计能力，在最大样本量下从31%提高到45%（见补充表S3). SKAT是一种有监督的方法，要求用户选择核和权重，这也带来了挑战，因为在某些情况下，默认参数可能不是最佳的。例如，在二氧化氮数据集。SKAT的默认权重导致低功耗（样本容量为450时<40%），因为它严重低估了常见变体，这在该数据集中造成了很大比例的疾病风险。因此，我们使用SKAT的β权重值（1,1）作为二氧化氮数据，这大大提高了它的性能。

与其他工具相比，VT和VAAST在模拟数据上运行时，在广泛的PAR和等位基因异质性中，在不同的致病和中性等位基因比率下，在显性和隐性遗传模式下，表现出非常稳健和相似的性能(图5). 这些优势可能源于这两种工具共享的两个功能。首先，他们直接将每个部位的病例和对照之间的MAF变量与体重变量进行比较。其次，他们利用变量函数的外部预测来提高功率Price等人，2010年.

尽管VAAST在模拟数据上的性能特征相似，但在实际数据集上其性能优于VT。对这一事实的一种可能解释是，VAAST 2.0采用了更灵活的方差加权方法，该方法不依赖于关于变量严重性和MAF的先验假设。相比之下，VT假设频率较低的变体更有可能有害，并且存在单个最佳MAF阈值。因此，它探索了所有可能的阈值，以找到最大化病例和对照之间对比的MAFPrice等人，2010年此假设对我们的模拟数据集有效，但对实际疾病数据集不一定正确。与这些观察结果一致，VAAST是每个模拟和真实数据集上表现最好的整体工具，表明VAAST 2.0可以有效应对真实病例对照数据集的不同参数空间。

VAAST的一个局限性是，它目前仅支持病例对照研究设计中的二分法性状分析，而WSS、VT、KBAC和SKAT支持数量性状。对于连续表型，可以将样本分为两组（可能只使用表型极值），尽管这样做通常会损害统计能力。

除VAAST外，VAAST对稀有疾病基因搜索也有效Rope等人，2011年，这里的聚集性变异关联测试是为了识别与常见疾病有关的基因而开发的。我们的分析表明，这些测试也适用于鉴定罕见的孟德尔病基因。例如，WSS、VAAST 2.0和KBAC将疾病基因分别排在全基因组前10位的99%、100%和74%，在隐性模型下仅使用三个病例基因组。与传统的基于过滤的方法相比，性能非常好，这表明在这些场景中使用关联测试的必要性。

结论

总之，我们的分析说明了聚合变量关联测试意外复杂的性能特征。他们还证明，VAAST 2.0是一个强大的疾病基因发现工具，在各种模拟和现实病例对照数据集上表现强劲。

软件和数据访问

VAAST 2.0可从以下网址下载：http://www.yandell-lab.org/software/vaast.html拥有学术用户许可证。

致谢

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