蛋白激酶C磷酸化系统N谷氨酰胺转运子SN1（Slc38a3）并调节其膜转运和降解

摘要

介绍

化学突触的突触传递对许多神经元功能如认知、学习和记忆至关重要。它基于神经递质的胞外释放、通过突触间隙的扩散以及靶细胞表面特定受体的激活。谷氨酸是中枢神经系统（CNS）中主要的快速兴奋性神经递质，支撑着广泛突触的功能，而γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸是主要的抑制性神经递质，与主要神经元同步。此外，单胺类、乙酰胆碱、神经肽和其他分子在特定突触处维持神经元信号传递[参考文献(1)].

持续的神经传递依赖于神经递质的补充和有效终止信号以降低信噪比。对于单胺类和乙酰胆碱，神经递质或胆碱（乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱的最终产物）由神经末梢膜上的特定转运体从突触间隙中清除，这也允许它们在突触传递中重复使用(1). 相反，GABA转运体3（GAT3；部分为GAT1）和主要谷氨酸转运体（GLAST/EAAT1和GLT-1/EAAT2​（图1）1) (2,三). 随着对氨基酸转运体Slc38家族成员的特征描述，表明它们可能协同工作，将谷氨酰胺从星形胶质细胞穿梭到神经元，谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环的理论得到了振兴。特别是，释放谷氨酰胺的星形胶质细胞SN1似乎是这个循环的主要组成部分，因为它调节谷氨酰胺的细胞外浓度并显示动态的膜运输(4–6). 在这篇综述中，我们将讨论并巩固蛋白激酶C（PKC）介导的SN1调节及其功能意义的最新数据。

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图1

基于蛋白激酶C（PKC）调节SN1活性的综合数据的SN1膜转运模型这幅漫画描绘了成年大鼠大脑中的GABA能突触，GABA在那里通过细胞外释放并作用于特定的突触后受体。通过质膜GABA转运体（GAT）1将GABA运回神经末梢，将GABA从突触间隙中移除，从而终止信号。突触间隙中的大量GABA也被GAT3（和GAT1）转运到突触周围星形胶质细胞过程中，并转化为谷氨酸，然后在谷氨酰胺合成酶（GS）的催化下转化为谷氨酰胺。谷氨酰胺随后可通过电中性和双向系统N转运体1 SN1从星形胶质细胞中释放，随后可通过系统A转运体SAT1在GABA能神经元内积累。在这里，谷氨酰胺通过磷酸活化谷氨酰胺酶（PAG）和谷氨酸脱羧酶（GAD）的作用代谢生成谷氨酸，然后生成GABA。最后，GABA通过囊泡GABA转运体（VGAT）转位到突触小泡中，然后准备通过细胞外释放。星形胶质细胞PKC可在刺激星形胶质细胞膜上的特定受体或例如过量锰时被激活²⁺PKCα和PKCγ（和PKCδ）可以磷酸化丝氨酸上52位的SN1。这导致质膜SN1依赖于小窝蛋白（Cav）的内化（1）。蛋白质磷酸酶（PP）脱磷酸化后，内化的SN1可能重新定位到质膜上。PKC介导的SN1磷酸化也增加了SN1（2）的泛素化。这也可能将蛋白质内化到细胞内隔间，并将其靶向蛋白酶体降解途径。谷氨酸能突触也发生类似的SN1活性调节。同样的机制可能参与肝细胞、肾小管细胞和胰腺B细胞中SN1的调节。

谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环及其对谷氨酸和GABA神经递质补充的贡献

神经元突触稳定释放的大量递质需要可靠的补充机制。神经递质谷氨酸和GABA不能从三羧酸（TCA）循环中间产物中生成，因为神经元由于缺乏丙酮酸羧化酶而缺乏恢复能力(7). 事实上，单靠葡萄糖不足以维持脑片中的神经传递(8). 还提出了将单羧酸盐和TCA循环中间产物从星形胶质细胞穿梭到神经元以及对神经递质形成的贡献(7,9)但它们可以促进神经递质合成和突触传递，这一点尚待证明。因此，普遍的假设是，快速神经递质穿梭于突触周围的星形胶质细胞中，以维持神经传递。根据谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环，谷氨酸和GABA被隔离在星形胶质细胞中并转化为谷氨酰胺。然后，星形胶质细胞向神经元提供谷氨酰胺，以促进谷氨酸和GABA的形成。

有几个令人信服的发现支持谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环的存在，星形胶质细胞衍生的谷氨酰胺是神经递质谷氨酸和GABA的主要前体（图​（图1）。1). 星形胶质细胞包裹突触，为神经元提供代谢前体，优化神经元功能和信号传递的条件。它们携带GLAST、GLT-1和GAT3，通过结合神经递质并随后将其运输到星形胶质细胞中，迅速从突触间隙中清除神经递质，并远离其受体[(10–12)，审阅(三)]. 隔离的谷氨酸和GABA很容易通过谷氨酰胺合成酶代谢为谷氨酰胺，谷氨酰胺合合酶在星形胶质细胞中富集，并且在人体内能够合成谷氨酰胺(13,14). 转运到神经末梢的谷氨酰胺被磷酸激活的谷氨酰胺酶（PAG）分解代谢，这种酶在神经末梢中很明显，可以重新合成谷氨酸和GABA[参考文献(15)]. 最后，新合成的谷氨酸和GABA在突触小泡释放之前通过小泡转运体积累在突触内(16,17). 毫无疑问，谷氨酰胺是神经递质谷氨酸和GABA的前体(7,8,18–22). 然而，谷氨酰胺是如何从合成谷氨酰胺的星形胶质细胞穿梭到神经元以供利用的，这一直是个谜。

系统N和系统A转运蛋白维持谷氨酰胺的星形胶质细胞对神经元的转运

通过对与囊泡GABA转运体（VGAT）同源的孤儿转运体的特征分析，我们对谷氨酰胺细胞间转运和谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环的理解取得了突破性进展：SN1是一种504个氨基酸长转运蛋白，具有11个假定的跨膜结构域和一个长的细胞内N末端，转运谷氨酰胺、天冬酰胺和组氨酸，与生化描述的系统N活性一致(4). SN1传输与Na耦合⁺同向运输和H⁺逆向运输。因此，SN1活性与细胞内pH值变化有关。SN1与Na的化学计量耦合⁺和H⁺以相反的方向运行，使整个传输为电中性，并允许SN1双向工作(4,23–25). 除了Na的耦合运动⁺和H⁺离子、阳离子也以非偶联的方式穿透SN1并使SN1能够在生理条件下容易地以释放模式工作。在中枢神经系统中，SN1定位于包裹突触的星形胶质细胞过程(5,23,26). 在突触传递和星形胶质细胞随后的去极化过程中，离子和谷氨酰胺浓度梯度发生变化，有利于SN1的释放模式(27). 因此，SN1能够为神经末梢提供谷氨酰胺，用于神经递质合成。

有趣的是，SN1的分子鉴定揭示了一个氨基酸转运体家族（Slc38），包括SN2和单向系统a转运体SAT1和SAT2(27,28)]. 这些转运蛋白的异构体特异性特征及其互补定位使这些转运蛋白能够维持谷氨酰胺的细胞间转运（图​（图1）。1). SAT1在中枢神经系统的GABA能神经元中显著表达，靶向发育中神经元的生长锥和成熟完整神经元中与VGAT相同的细胞隔室，表明谷氨酰胺摄取在GABA形成中的作用(29–31). 相反，SAT2在整个中枢神经系统谷氨酸能神经元的体干细胞室中富集，并积累高水平的谷氨酰胺(32,33). 在刺激这些神经元时，谷氨酰胺被代谢产生谷氨酸，谷氨酸从树突中释放。事实上，SAT2的药理学破坏消除了逆行信号(33). 最后，系统N转运蛋白SN2在星形胶质细胞膜上独家表达，并介导几种中性氨基酸的电中性和双向转运(34,35). SN2参与星形胶质细胞释放谷氨酰胺以产生神经递质，但通过释放甘氨酸来共同激活NMDA受体(35).

系统A和系统N转运器的调节涉及多种机制

由于Slc38氨基酸转运体家族支持谷氨酰胺的星形胶质细胞到神经元的转运，系统A和系统N转运体的调节可能会影响神经递质的补充和突触可塑性。对其功能和调节相关分子机制的更好理解可能揭示这些转运蛋白和谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环的新（病理）功能作用，并揭示新的治疗靶点。真核细胞有一整套可能的调节机制来调节其蛋白质的活性和表达。原则上，细胞蛋白质的生产、成熟、运输和降解的所有步骤都可以进行调节，以控制其表达水平，此外，还可以通过与质子到大分子蛋白质复合物等分子的相互作用来调节蛋白质活性的所有类型的直接或间接影响。谷氨酰胺转运体也不例外。经典的生物化学实验早期证明了通过功能性运输分析测定的系统A和N活性的适应性、激素和渗透调节(36–38). 营养信号级联包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）的激活，已被证明对系统A的上调很重要(39,40). 对于SAT2，已经证明了一种调节启动子活性的氨基酸响应元件(41).

系统N活性和SN1在转录和翻译水平上受到调节(37,42). 还证明了通过相互作用的蛋白质和离子对SN1进行复杂的调节。例如，SN1被泛素连接酶Nedd4-2（表达的神经前体细胞，发育性下调4-2）靶向，该酶下调非洲爪蟾(X·莱维斯)卵母细胞(43). 胰岛素通过PI3K-mTor信号级联调节SN1的表达(44).

质子通过与钠竞争调节SN1活性⁺SN1的钠结合位点，如增加K（K）_米对于Li⁺（Na的替代品⁺)几乎没有变化V（V）_最大值降低细胞外pH值(23). 作为Na⁺与Slc38家族的结合是氨基酸移位前结合的先决条件，细胞外pH值的变化对SN1活性有深刻影响(23,24). 质子也在mRNA水平调节SN1。正常情况下SN1的表达仅限于肾脏近端小管的S3段。在慢性代谢性酸中毒（CMA）期间，肾上皮S1–S2段也会诱导SN1，从而增加谷氨酰胺代谢和碳酸氢盐生成，以抵消酸中毒(6). 在大鼠中诱导CMA导致SN1在mRNA水平上调约10倍，在蛋白质水平上调5倍以上(6,42,45). SN1 mRNA 3′非翻译区（3′-UTR）中的一个pH响应元件允许特定蛋白在低pH值下与mRNA结合，从而稳定mRNA。因此，SN1在肾脏的整个S1–S3段中被诱导表达(6).

PKC介导的磷酸化是调节质膜神经递质转运蛋白膜运输的核心

对于运输神经活性化合物的蛋白质，如多巴胺、血清素（SERT）、GABA和谷氨酸，由磷酸化/去磷酸化事件调节的膜运输已被证明是一个共同的分母。已经描述了Nedd4-2/血清和糖皮质激素诱导激酶1和3（SGK1和3）以及蛋白激酶B（PKB）对谷氨酸转运体EAAT1、2和5的调节(46). 然而，PKC的监管是一个主要机制。PKC亚型及其众多底物调节多种膜蛋白，特别是转运蛋白(47,48)]. 在一项综合综述中，GABA（GAT1）、SERT、多巴胺（DAT1）和谷氨酸（EAAC1）的转运体均被PKC磷酸化调节(48). 对于前三个转运蛋白，PKC磷酸化介导转运蛋白的内化，而蛋白磷酸酶2A（PP2A）或酪氨酸磷酸化的去磷酸化介介导转运回细胞膜。对于EAAC1，PKC似乎与PI3-激酶一起增加了表面表达，而PP2A去磷酸化引发了内化。甘氨酸转运蛋白也受到PKC的调节(49–51). 由于PKC广泛表达但严格划分，其亚细胞活化通过无数信号通路进行，在所有细胞类型的总磷酸化现象中占很大比例。有趣的是，PKC信号对中枢神经系统的发育、兴奋性、可塑性和衰老等过程具有重要作用(52–54). 鉴于PKC的中心调节作用，PKC调节谷氨酰胺转运体的想法也是由几个不同的小组独立构思的，这并不奇怪。

PKC介导SN1磷酸化的证据

最近两组研究表明，蛋白激酶C在生理条件下调节SN1（图​（图1），1)然而，所报道的机制存在差异(55,56). Balkrishna及其同事报告称X·莱维斯用佛波酯佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-醋酸盐（PMA）表达大鼠SN1的卵母细胞导致谷氨酰胺摄取快速下调min.由于这种PMA诱导的谷氨酰胺摄取减少是由特异性PKC抑制剂双吲哚甲酰胺（Bis）阻止的，并且不能由非活性形式的PMA（4-α-PMA）诱导，研究人员得出结论，PKC激活参与其中。PKC对SN1的特异性作用由相同卵母细胞中缺乏PMA诱导的单羧酸转运体1（MCT1）活性变化支持。作者在SN1序列中确定了七个假定的磷酸化位点，然而，这些位点的单一或联合突变对PMA诱导的SN1活性下调没有影响。为了进一步确定SN1上负责观察到的PKC效应的特定区域或基序的存在，将SN1胞质N末端替换为同源SAT1蛋白的N末端。用PMA处理SAT1-SN1杂种仍然导致SN1的下调，这一结果被解释为靶向区域不局限于SN1的N末端。基于所有这些数据，可以得出结论：SN1不是PKC直接磷酸化的；相反，SN1的下调是通过与卵母细胞内源性调节蛋白的一些相互作用介导的(55).

作者还生成了SN1的荧光标记结构EGFP-SN1，并表明PKC介导的谷氨酰胺摄取下调是由来自质膜的融合蛋白内化引起的。从质膜中提取SN1由小窝蛋白控制，但仍保持动力学独立性。最后，谷氨酰胺转运在肝细胞源性HepG2细胞和培养的大鼠星形胶质细胞中受到挑战；肝细胞和星形胶质细胞都有内源性SN1表达(26). PMA治疗可降低培养的HepG2细胞中谷氨酰胺的摄取，但不降低培养的大鼠星形胶质细胞中的谷氨酰胺摄取，这种差异可通过细胞特异性调节机制的差异来解释。

在Nissen-Meyer及其同事的报告中(56)在PMA处理稳定转染SN1的哺乳动物细胞后，我们还检测到质膜中SN1蛋白的类似时间依赖性下调，并将该蛋白隔离到细胞内贮存器中。在Bis I的存在下，下调被抑制，支持PKC激活的中介作用。然而，我们以三种不同的方式证明了PKC介导的SN1磷酸化：第一，SN1的直接磷酸化在体外使用含有SN1 N末端的GST融合蛋白和重组PKCα和PKCγ(56). 此外，利用定点突变产生不可磷酸化的SN1突变体，我们用这些突变质粒转染培养的COS7和PS120细胞。然后用代谢标记细胞³²在PMA刺激下，在免疫沉淀和2D-磷酸肽定位后，我们证明，当大鼠SN1 N末端的一个丝氨酸残基发生突变（S52A）时，活性细胞中依赖PKC的磷酸化被选择性地消除，这意味着这是主要的磷酸化位点。

第二，野生型和突变SN1的特征X·莱维斯卵母细胞的电生理学进一步证实了我们关于PKC直接磷酸化SN1的数据。PMA刺激导致SN1活性降低，如谷氨酰胺诱导的内向电流所示。然而，当PKC被Bis I抑制时，谷氨酰胺诱导的内向电流幅度的这种减少会消失。不可磷酸化的S52A突变体在PMA存在下抵抗下调，这意味着PKC亚型在S52处磷酸化SN1。

第三，我们还显示培养的大鼠星形胶质细胞中SN1的直接磷酸化。通过使用特异性亲和纯化抗体选择性识别S52处磷酸化的SN1，我们证明PKC刺激导致SN1的Bis-I敏感性磷酸化增加，磷酸化SN1积聚在细胞内，与蛋白质内化一致。PKC激活显著降低了SN1在PKC介导的磷酸化作用中的内化作用V（V）_最大值谷氨酰胺诱导电流X·莱维斯卵母细胞，但对K（K）_米最后，我们的生化分析表明，在去磷酸化后，SN1可能会从这些区室中动态募集，然而，PKC对SN1的长期激活会导致其降解。

有趣的是，Sidoryk-Wegrzynowicz及其同事最近也提出了PKC参与SN1下调的证据(57)：锰²⁺暴露可上调培养星形胶质细胞中PKCα和PKCδ的活性。这两种酶都被磷酸化激活，PKCδ还被caspase 3依赖性蛋白水解激活。在他们的实验中，PMA刺激4小时显著下调培养的星形胶质细胞中系统N介导的谷氨酰胺摄取，这种作用被PKC抑制剂Bis II抑制。与我们的工作一致，他们表明，在4小时之前，PMA就降低了生物素化表面膜的SN1含量。虽然他们没有成功地将SN1与PKCα共同免疫沉淀，但他们确实表明，SN1在0和2小时与PKCδ共同免疫沉淀在一起，但在随后的研究中没有。因此，这些实验也支持PKC是生理条件下SN1蛋白细胞表面表达的重要调节器，尽管没有证明SN1的直接磷酸化。因此，有令人信服的证据和一些迹象表明，SN1被PKCα、PKCγ和PKCδ直接磷酸化，随后是依赖小窝蛋白的SN1内化。

PKC参与SN1的降解吗？

如上所示，PKC磷酸化SN1并调节细胞膜上的SN1活性，从而调节跨膜谷氨酰胺转运，以符合神经递质前体的不同（病理）生理需求。然而，PKC的长期激活导致SN1降解（图​（图1）1) (56,57). SN1与Nedd4-2相互作用X·莱维斯卵母细胞和星形胶质细胞(43,57). 此外，锰刺激原代星形胶质细胞²⁺通过Nedd4-2/SGK1信号通路诱导泛素/蛋白酶体介导的SN1降解，从而为锰提供了部分解释²⁺-诱导性神经毒性(58). 所以，当SN1和SGK1和3以及PKB共同表达时，SN1介导的转运增加(43). 因此，该途径可能代表与PKC调节的联系，因为PKC的磷酸化经常是标记蛋白质以实现泛素化和进一步溶酶体或蛋白酶体降解的一种方式（图​（图1）1) (59,60).

SN1调节对谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环的功能意义是什么？

谷氨酸转运体GLAST和GLT-1以及GABA转运体GAT1和GAT3富集在突触周围星形胶质细胞突起的细胞膜上，捕获细胞外释放的神经递质并将其转移到星形胶质细胞中(10,11). SN1也针对相同的小胶质细胞突起(5,26). 谷氨酸和GABA转运体的激活将确保局部细胞内钠⁺-浓度可以增加到可以将SN1介导的谷氨酰胺转运出细胞的水平(61)只要存在谷氨酰胺合成酶，进口的谷氨酸和GABA就会转化为谷氨酰胺出口。事实上，谷氨酸刺激星形胶质细胞分泌谷氨酰胺(62).

Uwechue及其同事提供了令人信服的证据，证明谷氨酸通过与大鼠梯形体内侧核（MNTB）中Held突触的谷氨酸能花萼并列的星形胶质细胞中的系统N样活性，引发谷氨酰胺释放。随后，这种谷氨酰胺释放由MNTB主要神经元感应，其表达系统A转运体，与完整的谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环一致(63,64). 同样，对培养的Bergmann胶质细胞的研究表明，谷氨酸转运体的激活d日-天冬氨酸导致谷氨酰胺释放(65). 总之，这些数据有力地表明了谷氨酸和谷氨酰胺转运蛋白之间的功能偶联以及谷氨酸/GBA谷氨酰胺循环的存在。结合SN1活性的膜运输的动态调节(55–57)这表明SN1可能是谷氨酰胺神经元供应的关键调节器之一，因此谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环（图​（图1）。1). 此外，抑制SN1活性可能会刺激谷氨酸、GABA和谷氨酰胺的靶向氧化或增加跨天冬氨酸细胞谷氨酰胺流量，从而影响周围区域(66).

PKC介导的磷酸化可能调节外周器官的广泛功能

SN1还维持外周器官的关键功能。在肾脏中，SN1定位于近曲小管S3段的基底外侧膜，对谷氨酰胺代谢至关重要。CMA期间，K⁺-剥夺和/或高蛋白摄入，肾中SN1的总水平显著增加，肾单位的S1–S2节段也诱导了SN1(6,45,67). 在内分泌胰腺中，我们显示了SN1和SAT2的互补表达，并建议它们协同调节局部谷氨酸-谷氨酰胺循环和胰岛素分泌(68,69). 肝脏具有最高的SN1细胞浓度，建议通过调节谷氨酰胺内流促进门脉周围肝细胞中尿素的形成，以及通过调节静脉周围肝细胞的谷氨酰胺外流将谷氨酰胺转运至其他外周器官进行细胞代谢(26,27). 因此，肝脏中SN1的表达在饥饿和胰岛素分泌期间受到调节(44). 因此，SN1在几个生理过程中是必不可少的，并且可能在不同器官中进行差异调节，以优化广泛的功能。由于PKC亚型在全身广泛表达，但在不同的细胞和亚细胞隔室中存在差异，因此异型特异性PKC介导的SN1磷酸化可能具有一系列生理和病理作用。

结论

关于SN1法规的多篇论文的综合数据(55–57)表明PMA诱导和双I-抑制的SN1检索发生在几种哺乳动物细胞类型中，包括原代大鼠星形胶质细胞，以及X·莱维斯卵母细胞（图​（图1）。1). 这种膜转运由S52处SN1的特异性磷酸化控制，选择性地由PKCα和PKCγ控制。长时间的PMA刺激通过小窝蛋白依赖性和动力学非依赖性机制导致内化，并通过Nedd4-2/泛素化途径降解SN1。因此，PKC介导的SN1调控可能是调节中枢神经系统中谷氨酸/GABA-谷氨酰胺循环和外周器官广泛病理生理过程的关键步骤。需要进行进一步研究，以更好地了解调节质膜上SN1活性及其膜转运的分子机制，此类研究可能揭示对各种生理过程的新的机制见解，并发现新的治疗靶点。

利益冲突声明

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

致谢

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