缺乏适配蛋白AP-3的小鼠体内肽激素释放的广泛失调

胰岛细胞释放失调的肽激素摩卡老鼠

NPY和VMAT2的基础胞吐增加摩卡嗜铬细胞与早期在PC12细胞中使用RNAi的实验一致[14]但是AP-3的缺失是否也会导致其他神经内分泌组织的失调释放？胰腺β细胞在LDCV中储存胰岛素，在形态和生化上与嗜铬颗粒相似[29],[30]评估胰岛素的调节释放体内，我们测量了空腹时的基线血清胰岛素水平和腹腔注射葡萄糖后15–20分钟的刺激水平(图2A). 在服用葡萄糖之前，我们观察到摩卡小鼠相对于对照组，但这没有达到显著性。给糖后，对照组动物的血清胰岛素明显增加，但摩卡老鼠没有(图2A)，表明监管释放失败。

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图2

摩卡小鼠出现胰岛素和胰高血糖素分泌失调。

（A） 在隔夜禁食（基线）和静脉注射葡萄糖（2毫克/克体重）后15-20分钟测定血清胰岛素水平。与控制相比，摩卡注射葡萄糖后，胰岛素水平没有显著升高。数据来自两个独立的实验；n=14控制，n=10摩卡老鼠**p<0.01***Newman-Keuls事后测试p<0.001。急性分离胰岛，并在37°C的2.8 mM（基础）或28 mM（调节）葡萄糖中浸泡1 h。（B）摩卡与对照组相比，胰岛的基础胰岛素分泌显著增加。相反，控制和摩卡胰岛分泌相当数量的胰岛素以应对高糖。对于对照胰岛，这表示随着葡萄糖升高，分泌增加了约6倍。对于摩卡胰岛，胰岛素分泌没有显著增加，对血糖升高的反应**经Dunnett的事后检验，p<0.01，n=7–10。（C）收集分泌的胰岛素后，将胰岛制成颗粒，并通过超声波溶解以提取细胞胰岛素。各组间的细胞胰岛素水平相似。（D） 在28 mM葡萄糖中测得的基础胰高血糖素分泌显著增加摩卡突变。（E） 细胞内胰高血糖素水平在摩卡和对照小鼠*p<0.02，n=6–8。条形代表平均值。

为了评估胰岛素释放失调对碳水化合物代谢的影响，我们还测量了血糖。令人惊讶的是，我们观察到对照组和对照组之间的空腹血糖水平没有明显差异摩卡小鼠(图S2A). 服用葡萄糖后，摩卡动物血糖升高，但低于对照组(图S2A)这是一个令人惊讶的结果，因为较低的血清胰岛素水平可能会损害糖耐量(图2A). The effects of the摩卡因此，血糖水平的突变与胰岛素的影响无关。然而，血糖水平反映了多种循环激素的联合作用，其中许多可能会受到AP-3缺失的影响。事实上，其他肽类激素的失调释放可能会间接影响胰岛素的释放。

为了检测独立于全身效应的胰岛素释放，我们分离了胰岛，并将其在含有低浓度或高浓度葡萄糖的培养基中急性孵育。图2B显示与对照胰岛细胞中高浓度葡萄糖明显刺激胰岛素释放相反，摩卡细胞表现出基础释放增加，而高糖几乎没有刺激。与SgII含量减少相反摩卡嗜铬细胞、细胞胰岛素水平之间无差异摩卡和控制胰岛(图2C)表明基础分泌的变化不是继发于激素表达的改变。在胰岛素的情况下摩卡因此，突变会显著且选择性地损害调节分泌。

由于摩卡其他肽类激素释放的突变可能会使观察复杂化体内，我们还检测了胰高血糖素，这是一种从胰腺α细胞中释放的肽，可对抗胰岛素的作用：胰高血糖素因饥饿而升高血糖水平。虽然我们没有观察到摩卡空腹血清胰高血糖素突变(图S2B)，急性分离胰岛的基线胰高血糖素分泌增加(图2D). 此外摩卡胰岛细胞与对照组无差异(图2E)以及胰岛的形态就地看起来没有变化(图S2C). 因此，摩卡小鼠表现出两种肽类激素的释放失调，并表现出相反的作用，这表明肽类激素释放受到全球影响，因此很难预测葡萄糖稳态的净后果体内.

需要同时缺失泛型和神经型AP-3等位基因才能重新概括LDCV表型摩卡老鼠

已知异四聚体AP-3复合物存在于两种亚型中，一种由所有组织表达，另一种由神经元和内分泌组织（包括肾上腺和胰岛）特异表达[16],[31],[32]在后生动物细胞中，普遍存在的亚型有助于通过不涉及多泡体的途径从早期内体运输到溶酶体[15],[33]相反，神经亚型与来自内体中间物的突触小泡的形成有关[34],[35]这表明该亚型也可能有助于LDCV的形成。为了测试这种可能性，我们使用了珍珠缺乏普遍存在的β3亚单位同种型（β3A）的小鼠和缺乏β3神经同种型的β3B敲除小鼠。由于AP-3的δ亚基仅以单个亚型存在，一个亚基的缺失通常会破坏复合物的稳定性[17],[36]我们首先对培养细胞进行δ染色，以评估突变对整个复合物的影响。我们惊讶地发现，丢失β3亚型对嗜铬细胞中免疫活性δ的水平没有影响(图3A)特别是考虑到大多数组织中普遍存在的β3A亚基的丰度。然而，我们确实观察到培养物中β3A缺乏的非嗜铬细胞δ的表达降低(图3B)可能是因为它们不表达神经亚型，因此不能表现出冗余。与肾上腺皮质细胞的相对丰度一致[37]在普遍存在的AP-3亚型中，肾上腺匀浆的西方分析显示β3A缺乏的AP-3δ水平较低珍珠动物(图3C)但在β3B敲除中处于正常水平(图3D).

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图3

同时丢失β3A和β3B是降低肾上腺SgII所必需的。

（A） 通过免疫荧光检测单个AP-3亚单位突变对SgII和AP-3δ水平的影响。肾上腺嗜铬细胞摩卡(δ),珍珠用兔抗SgII多克隆抗体和鼠抗AP-3δ单克隆抗体对（β3A）、β3B−/−和对照小鼠进行染色，然后用与Alexa Fluor 488结合的抗兔抗体和与Alexa-Fluor 594结合的抗鼠抗体进行染色。具有代表性的共焦显微照片显示，在摩卡嗜铬细胞，但两者的SgII和AP-3δ不变珍珠和β3B−/−细胞。（B） 非色素类成纤维细胞珍珠培养物中的细胞显示AP-3δ明显减少。比例尺指示5µm。（C） 肾上腺珍珠小鼠的总体AP-3水平明显降低，但SgII水平不变。（D） β3B−/-小鼠肾上腺的总体AP-3或SgII水平没有变化。（E） 双突变体肾上腺聚乙烯/聚乙烯; 与年龄匹配的C57BL/6对照组相比，β3B−/−小鼠的SgII水平明显降低聚乙烯/聚乙烯; β3B+/-对照。摩卡肾上腺显示SgII的减少类似于聚乙烯/聚乙烯; β3B−/−小鼠**通过Dunnett的事后检验，与对照组相比p<0.001，n=3。数据显示平均值，误差条表示标准误差。

为了确定β3A或β3B的丢失是否影响LDCVs的形成，我们随后检查了对SgII的影响。我们惊讶地发现，与之相反摩卡先前报道显示减少的细胞[14]，两个β3突变体的免疫荧光SgII水平均正常(图3A). 通过肾上腺提取物的西方分析，β3A缺乏珍珠β3B基因敲除物也含有正常水平的免疫反应性SgII(图3C–3D). 然而，双突变小鼠肾上腺中这两种亚型的丢失导致SgII的减少，与在摩卡小鼠(图3E). 就SgII的细胞含量而言，这两种亚型因此表现出冗余。

Granin含量降低反映了基因表达降低，而不是降解加剧

缺乏AP-3的小鼠SgII表达减少可能反映了基础分泌增加或一个完全不同的过程。事实证明，LDCV的含量通过多种机制进行转录调控[30],[38]因此，我们测量了对照组和对照组的肾上腺SgII和嗜铬粒蛋白A（CgA）转录本摩卡通过定量逆转录（qRT）-PCR检测肾上腺。SgII和CgA mRNA在摩卡小鼠，尽管与蛋白质的程度不同[14](图4A). AP-3 RNAi后PC12细胞的SgII mRNA也出现类似的减少(图4B).

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图4

AP-3的缺失会降低颗粒蛋白mRNA，但不会增加其降解。

（A） 肾上腺转录物的定量RT-PCR（qPCR）分析摩卡与同窝对照的肾上腺相比，小鼠的SgII和CgA表达减少了约50%*p<1×10⁻⁴，n=6–7个肾上腺/基因型。（B） 对转染AP-3δsiRNA的PC12细胞的qPCR分析表明，与转染对照siRNA的细胞相比，SgII表达降低了约60%。*p<0.02，n=5-6转染。（C） PC12细胞与溶酶体蛋白酶抑制剂孵育约24小时，对转染AP-3δ或对照siRNA的细胞中的细胞SgII水平没有影响。相反，蛋白酶抑制剂显著提高溶酶体水解酶前体procathepsin D的水平。数据显示平均值，误差条显示s.e.m。

由于AP-3影响内溶酶体途径内的运输，适配器的丢失也可能通过溶酶体中的降解增加影响SgII水平。为了测试这种可能性，我们在PC12细胞中AP-3敲除后抑制溶酶体蛋白酶，但没有观察到SgII水平的任何增加(图4C). 另一方面，溶酶体水解酶前体procathepsin D的水平因溶酶体降解的抑制而显著增加，表明抑制剂的有效性(图4C). 因此，在AP-3缺失的情况下观察到的细胞SgII减少反映了表达减少以及成分释放增加，但不是降解增加。

抗体

兔SgII抗体来自Meridian Life Science，小鼠肌动蛋白单克隆抗体来自Millipore，小鼠δSA4单克隆抗体来源于发育研究杂交瘤库，山羊组织蛋白酶D抗体来源于Santa Cruz，小鼠HA.11单克隆抗体源于Covance，来自BD Transduction Laboratories的小鼠适应性γ单克隆抗体、来自Sigma的小鼠胰岛素单克隆抗体，来自Linco的豚鼠胰高血糖素抗体、来自西格玛的小鼠胰高糖素单克隆抗体和来自Thermo Scientific的兔生长抑素抗体。

siRNA

消音器选择大鼠Ap3d1（感觉，5′-CAUGGAUCAGACAAGAA-3′)相应的非靶向对照siRNA来自Ambion。目标上加大鼠Ap1g1（感觉，5′-CAUAAAAUUCUGUGUCGA-3′,5′-古古加古加古加古古古亚-3′,5′-UGUAACAGUGAUAACGAUA-3′,5′-GGACUGGAAUUCACGGCAA-3′)相应的非靶向集合对照siRNA来自Dharmacon。

分子生物学

通过PCR扩增NPY-pHfluorin（密歇根大学R.Holz慷慨捐赠）和VMAT2-pHflu的序列，添加5′BamHI和3′EcoRI位点，然后亚克隆到FUGW慢病毒表达载体中，替换EGFP编码序列。

细胞培养和慢病毒生产

PC12细胞保存在补充10%马血清（HS）和5%宇宙小牛血清（CCS；HyClone）的DMEH-21培养基中，浓度为5%CO₂37°C时。根据制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行siRNA转染。HEK293T细胞保存在含有10%胎牛血清（FBS）和5%CO的DMEH-21培养基中₂37°C时。根据制造商的说明，将FUGW、psPAX2、pVSVG和Fugene HD（Roche）转染HEK293T细胞产生慢病毒[59].

嗜铬细胞的分离和培养

如前所述，分离并培养小鼠肾上腺嗜铬细胞[60]简单地说，肾上腺被解剖并放置在冷钙中⁺⁺-，镁⁺⁺-游离（CMF）Hank的平衡盐溶液（HBSS）。去除周围脂肪和皮层，将髓质转移到CMF-HBSS中含有300 U/ml胶原酶I（沃辛顿）的试管中。在37°C下摇晃40分钟，使髓质分离。然后用含有200µg/ml DNAse I（Sigma）和1%热灭活FBS（Gibco）的CMF-HBSS替换胶原酶溶液，首先用P200移液管尖端研磨组织，然后用23号针头研磨组织。细胞在300时被制成颗粒克在室温下保持8分钟，并在预先加热的培养基中重新悬浮。细胞保存在补充有10%FBS和抗生素的DMEH-21培养基中。对于慢病毒转导，将新鲜分离的嗜铬细胞镀在病毒上清液中，并在第二天早上添加新鲜培养基。

全内反射荧光显微镜

对于TIRF显微镜，控制或摩卡将嗜铬细胞镀到涂有聚赖氨酸的玻璃室上，立即用编码NPY或VMAT2-pHfluorin的慢病毒转导，4-7天后进行活体成像。通常使用倒置TIRF显微镜（TE2000E；尼康）在10 Hz和室温下收集40–50 ms的图像，该显微镜具有100×Plan Apo 1.49 NA油物镜、1.5×管透镜和电子倍增电荷耦合器件相机（QuantEM；Photometrics）。在含有（mM，119 NaCl，25 HEPES-NaOH，pH 7.4，30葡萄糖，2.5 KCl，2 CaCl）的Tyrode溶液中测量基础胞吐₂，2氯化镁₂)超过90秒，并在含有5µM 1,1-二甲基-4-苯基哌嗪（DMPP；Sigma）的Tyrode’s中刺激释放60秒。使用NIS-Elements软件（尼康）手动量化个别细胞外事件。通过在事件中心手动放置2×2像素ROI来测量单个细胞外事件的振幅，并从最大事件强度中减去事件前的平均ROI强度。

糖耐量试验和血清胰岛素测量

使用5-15周龄婴儿评估糖耐量并测量血清胰岛素水平摩卡小鼠和年龄匹配的对照组。小鼠隔夜禁食（～16小时），第二天早上称重，并采集血样以测定基线血糖和胰岛素水平。然后向小鼠腹腔注射2 mg/g体重的葡萄糖，并在指定时间点从尾静脉采集血样。使用FreeStyle血糖仪（雅培）测量血糖水平。为了测量血清胰岛素，血液被允许凝结，并在2000年沉淀克和4°C下持续20分钟，并使用超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Crystal Chem）测定胰岛素水平。

胰岛分离与胰岛素分泌

如前所述，9至16周龄的小岛被隔离摩卡小鼠和年龄匹配的对照组[61]简单地说，胰岛在Ficoll梯度上纯化，并在37°C下恢复1小时。将五个胰岛放入含有HEPES缓冲RPMI培养基的试管中，该培养基补充2.8 mM葡萄糖（基础）或28 mM糖（调节），并在37°C下培养1 h。然后沉淀胰岛并收集上清液以测量胰岛素分泌。将颗粒重悬并在2mM乙酸、0.25%RIA级BSA中超声处理以提取细胞内胰岛素。最后，在67 mM氢氧化铵（0.2%Triton X-100）中通过额外的超声波对细胞核进行裂解。根据制造商的说明，通过ELISA（Mercodia）对分泌胰岛素和细胞胰岛素进行定量，并对胰岛DNA进行定量，以确认不同条件下每管胰岛的数量相似。用ELISA（R&D系统）测定胰高血糖素。

免疫荧光

通过向培养基中添加等量的4%甲醛（CMF-PBS中）并在室温下培养20分钟来固定嗜铬细胞。细胞在含有2%牛血清白蛋白、1%鱼皮明胶和0.02%皂苷的CMF-PBS中被封闭和渗透。将一级抗体在1∶500（SgII）和1∶100（δSA4）的封闭溶液中稀释。以下与Alexa荧光染料（Invitrogen）结合的二级抗体在封闭溶液中以1∶1000的比例使用：山羊抗兔IgG 488和山羊抗鼠IgG 594。使用蔡司LSM 510共焦显微镜和100×油物镜采集图像。

肾上腺颗粒含量

珍珠和摩卡小鼠取自杰克逊实验室摩卡将动物回交至C57BL/6以去除灰白的和钯6b^第1版等位基因。Ap3b2号机组KO小鼠取自V.Faundez（Emory）和S.Voglmaier（UCSF）。双突变体聚乙烯/聚乙烯;Ap3b2号机组−/−小鼠是通过杂交产生的聚乙烯/聚乙烯;2022年4月3日+/−男性至体育课/+;Ap3b2号机组+/−女性。将3-6周龄小鼠的肾上腺在150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 8.0、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠和含有1 mM EGTA和1 mM PMSF的完整蛋白酶抑制剂（Roche）中均质。在14000 g沉淀以去除细胞核和细胞碎片后，通过聚丙烯酰胺电泳分离20–40µg蛋白质，转移至硝化纤维素，并对膜进行AP-3δ和SgII免疫印迹，以肌动蛋白作为负荷控制，以及与IRDye800（Rockland Immunochemicals）偶联的适当二级抗体。免疫反应性通过Odyssey系统（LI-COR Biosciences）和ImageJ（National Institutes of Health）成像定量，信号标准化为肌动蛋白。为了对嗜铬细胞分泌的SgII进行西方分析，收集了Tyrode的溶液，在300℃沉淀克在4°C下放置3分钟，将上清液与SDS-PAGE样品缓冲液混合，然后通过聚丙烯酰胺进行电泳。通过添加样品缓冲液直接裂解嗜铬细胞。在这种情况下，使用ECL plus（GE Healthcare）检测SgII和肌动蛋白。

定量PCR

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从PC12细胞和小鼠肾上腺分离总RNA。为了提高肾上腺RNA的产量，将超纯糖原（Invitrogen）作为载体添加到TRIzol中。此外，肾上腺RNA经RNAse-free DNAse I（NEB）处理以去除污染的基因组DNA。cDNA使用寡核苷酸（dT）或基因特异性引物和转录第一链cDNA合成试剂盒（Roche）合成。在Stratagene Mx4000机器上使用SYBR Green（Applied Biosystems）进行qPCR。使用以下引物：大鼠SgII fwd：5′-ACAATAAAGACAGAGAAAATTT-3′，版本：5′-TGGATAAGAGAACACTG-3′; 大鼠β-肌动蛋白fwd：5′-CCGTGAAAAGATGACCAGATC-3′，版本：5′-CAGGGACACACACACCCTG-3′; 鼠标CgA fwd：5′-CAACCGCAGAGCAG-3′，版本：5′-AGCTGGTGGGCCACCTT-3′; 鼠标SgII fwd：5′-AAGTGGCTGGAGTACCTCAACC-3′，版本：5′-TTACATGTTTCCATGCCCG-3′; 鼠标GAPDH fwd：5′-ATGGTAAGGTCGTGAAC-3′，版本：5′-TCCACTTTTGCCACTGCAATG-3′.

溶酶体抑制

在第二个siRNA转染两天后，将PC12细胞在添加溶酶体蛋白酶抑制剂（Sigma）载体或混合物（单位：µM）的完整培养基中培养约24小时，其中包括10 antipain、10 leupeptin和5 pepstatin a。用冷PBS在冰上清洗细胞，并添加50 mM Tris-HCl，pH 8.0，150 mM NaCl、1%Triton X-100和完整蛋白酶抑制剂（罗氏）加上10 mM EDTA和1 mM PMSF。样品通过定量荧光免疫印迹法进行分析。

分泌物分析

在电镀后第1天和第3天用siRNA（100 nM）转染细胞，2天后清洗并在含有2.5 mM K的Tyrode溶液中培养⁺（基本）或50 mM K⁺37°C下（刺激）30分钟。收集上清液，如上所述制备细胞裂解物，并通过定量荧光免疫印迹分析样品。

我们感谢科特·索恩和加州大学旧金山分校尼康成像中心在显微镜检查方面的协助，感谢格雷格·绍特和加州大学洛杉矶分校糖尿病中心在胰岛分离方面的帮助，感谢爱德华兹实验室成员的有益讨论。