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分子细胞。作者手稿；PMC 2014年7月25日发布。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2013年7月25日；51(2): 236–248.
2013年6月6日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2013.05.003
预防性维修识别码：项目经理3775267
美国国立卫生研究院：NIHMS511733号
PMID：23747014

富马酸原红细胞红细胞结合谷胱甘肽放大ROS依赖信号

卢卡斯·B·沙利文,1 伊娃·加西亚-马丁内斯,1 阮希恩,2 安德鲁·马伦,2 魁省政府律师迪富尔,三 苏尼尔·苏达珊,4 乔纳森·李希特,1 Ralph J.Deberardinis公司,2和Navdeep S.Chandel公司1,*
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补充资料

总结

三羧酸循环酶富马酸水合酶（FH）已被确定为人类肾细胞癌亚群中的肿瘤抑制因子。人FH缺陷癌细胞显示出高富马酸盐浓度和ROS水平以及HIF-1的激活。FH损失增加ROS和HIF-1的潜在机制尚不完全清楚。在此，我们报告了谷氨酰胺依赖的氧化柠檬酸循环代谢是生成富马酸和增加ROS和HIF-1水平所必需的。富马酸积累直接结合抗氧化剂谷胱甘肽在体外和体内生产新型代谢产物琥珀酸谷胱甘肽（GSF）。GSF作为谷胱甘肽还原酶的替代底物，降低NADPH水平，增强线粒体ROS和HIF-1活化。活性氧增加也与这些细胞中组蛋白的高度甲基化有关。因此，富马酸通过与谷胱甘肽结合而起到原红细胞代谢物的作用，从而导致活性氧的积累。

简介

细胞代谢的改变是癌症的一个新特征。增殖的癌细胞增加了代谢需求，这部分由葡萄糖和谷氨酰胺依赖的生长代谢途径支持。葡萄糖产生糖酵解中间体，而谷氨酰胺产生三羧酸循环（TCA循环）中间体，共同产生ATP、NADPH、核酸、脂质和氨基酸(Lunt和Vander Heiden，2011年DeBerardinis和Cheng，2010年）。除了支持癌症生长的适应作用外，代谢酶的突变也被证明是导致癌症发展的原因。一个例子是TCA循环酶富马酸水合酶（FH）被确定为负责遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌（HLRCC）的肿瘤抑制因子。受累家族继承一个FH缺陷拷贝，在杂合性缺失事件后，可发展为皮肤和子宫平滑肌瘤以及侵袭性肾细胞癌(Tomlinson等人，2002年). FH在TCA循环中催化富马酸转化为苹果酸。FH的丢失导致TCA循环功能减弱和富马酸积累。最近，从HLRCC患者的转移瘤中建立的UOK262细胞系被发现含有增加的富马酸水平(Yang等人，2010年). 这些细胞依赖糖酵解生存，线粒体耗氧量低，无法检测。然而，尽管FH时TCA循环功能丧失，这些细胞仍依赖线粒体谷氨酰胺消耗通过还原羧基化进行生长(Mullen等人，2012年). 富马酸的积累是否有利于癌症的发展尚不清楚。

FH缺陷的人类癌细胞中最具特征的信号变化是伪缺氧状态的诱导。尽管存在充足的氧气和耗氧量的损失，但FH缺乏的细胞会慢性激活缺氧诱导因子（HIF）(Pollard等人，2005年,Isaacs等人，2005年). HIF是与癌症相关的主转录因子，通常在O2依赖方式。HIF由两种碱性螺旋环-螺旋/PAS蛋白、HIFα亚基和芳基烃核转录因子（ARNT或HIF-1β）组成的异二聚体组成(Semenza，2012年). 在常氧条件下，HIFα亚基被2-酮戊二酸依赖酶脯氨酰羟化酶域包含蛋白2（PHD2）羟化，其靶向HIFα子基，以被von Hippel-Lindau（VHL）E3泛素连接酶识别，导致其降解(Kaelin和Ratcliffe，2008年). 缺氧或假缺氧时，PHD2受到抑制，HIFα亚单位积累，导致与组成性表达的HIF1β发生异二聚体反应，并通过结合缺氧反应元件（HRE）激活缺氧反应基因的转录。与FH损失相关的另一个特征是由于组蛋白去甲基化酶的抑制而导致组蛋白的高度甲基化，组蛋白去甲基化酶与PHD2一样也是2-氧戊二酸依赖性酶(肖等，2012). 目前提出的解释因FH丢失导致HIF增加和超甲基化的机制表明，富马酸与2-酮戊二酸竞争，作为PHD2和组蛋白去甲基化酶的辅因子，产生功能阻滞(Hewitson等人，2007年).

有趣的是，尽管调节抗氧化基因的主要转录因子核因子（红系衍生的2）样2（Nrf2）过度激活，FH缺陷细胞仍显示出高水平的ROS(Sudarshan等人，2009年,Ooi等人，2011年,Adam等人，2011年). 为什么尽管Nrf2被激活，这些细胞仍然表现出大量活性氧尚不清楚。众所周知，与正常细胞相比，癌细胞显示出更高水平的活性氧，从而激活信号通路，如PI3K、MAPK和NF-KB，这些是肿瘤发生所必需的(凯恩斯等人，2011年). 在本研究中，我们研究了FH缺陷人类癌细胞中ROS水平升高的机制，以及高水平ROS如何影响HIF、Nrf2和组蛋白高甲基化的激活。

结果

FH阴性细胞中HIF1α的稳定依赖于ROS

FH的丢失触发了常压下HIF1α蛋白水平的异常增加。线粒体ROS（mito-ROS）可增加HIF1α蛋白水平(Chandel等人，1998年). 因此，我们试图研究FH缺陷的人UOK262癌细胞中HIF1α蛋白稳定是否需要有丝分裂-ROS。这些细胞表现出异常高的HIF1α蛋白水平和富马酸水平，通过将标记FH的功能性FLAG重组到线粒体可以缓解这两种水平(图1A–D). FH活性在UOK262癌细胞中缺失，但在其他肾癌细胞中丰富，包括HEK293和786-O细胞(图1B和第1部分). 如HRE荧光素酶活性降低和HIF1α靶基因PDK1表达降低所示，FH重组细胞中HIF1α活性也降低(图S1B和图1E). 使用线粒体靶向氧化还原敏感GFP（mito-roGFP），我们观察到FH缺陷细胞与FH充满细胞相比，线粒体ROS增加(图1F). 此外，如ROS探针DCFH和Amplex Red所示，FH的重建导致细胞内ROS的总体下降(图S1、C和D). 此外，shRNA介导的HEK293细胞FH的敲除增加了HIF1α水平和细胞内ROS(图S1、E和F). 为了确定在UOK262细胞中稳定HIF1α是否需要线粒体-ROS，我们使用线粒体靶向抗氧化剂线粒体维生素E（MVE）。MVE含有抗氧化剂维生素E，与三苯基膦阳离子（TPP）共价结合，使其优先积聚在线粒体基质中，并减弱H的释放2O（运行）2来自线粒体(Smith等人，2011年). 与模拟处理和TPP对照处理相比，MVE处理的细胞通过mito-roGFP显示出降低的mito-ROS(图1G). MVE处理细胞中线粒体ROS的减少降低了HIF1α水平(图1H). 用线粒体抗氧化剂mito-CP或MVE处理表达FH敲除shRNAs的HEK293细胞也能降低HIF1α水平(图S1G). 用MVE处理UOK262细胞也降低了HIF1α活性，如HRE荧光素酶活性降低和PDK1表达降低所示(图S1H和图1I). 因此，FH缺乏通过增加线粒体ROS导致HIF1α的积累。MVE治疗也降低了增殖(图1J)但没有生存能力(图1K)表明这些细胞的生长需要有丝分裂-ROS。

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FH缺陷细胞通过高ROS信号稳定HIF1α。

(A类)UOK262 FH-FLAG细胞的亚细胞分离和FLAG、SDHA（线粒体标记）和微管蛋白（细胞溶质标记）的western blot。(B类)表达控制载体（cv）或FH-FLAG的亲代UOK262细胞和UOK622细胞线粒体部分的FH酶活性。(C类)GC-MS分析显示cv和FH-FLAG UOK262细胞中富马酸的浓度。(D类)cv或FH-FLAG UOK262细胞中HIF1α、FLAG和微管蛋白的蛋白质印迹(E类)cv或FH-FLAG UOK262细胞PDK1和微管蛋白的Western blot(F类)cv和FH-FLAG UOK262细胞中氧化丝裂原GFP的相对水平(G公司)模拟、1μM TPP和1μM MVE处理的UOK262细胞中丝裂原GFP氧化的相对水平。(H（H）)模拟处理、1μM TPP和1μM MVE处理的UOK262细胞HIF1α和微管蛋白的Western blot。(我)模拟处理、1μM TPP和1μM MVE处理的UOK262细胞中PDK1和微管蛋白的Western blot。(J型)模拟治疗、1μM TPP和1μM MVE治疗48小时和96小时后的增殖效果。(K)模拟处理、1μM TPP或1μM MVE处理细胞48小时或96小时的存活率，由台盼蓝排除法测定。在(B、 C、F、G、J、和K)这些值表示平均值+s.e.m.n=3(B、 C、J、和K)n=4(F类)，n=5(G公司). *P<0.05**P<0.01。

2-氧戊二酸氧化代谢为富马酸对HIF1α稳定、高活性氧和UOK262细胞增殖是必需的

我们之前发现UOK262细胞依赖谷氨酰胺进行增殖。此外，碳标记实验表明，UOK262细胞将谷氨酰胺代谢为2-酮戊二酸，然后通过还原羧基化转化为柠檬酸或通过氧化代谢转化为富马酸(Mullen等人，2012年). 为了研究2-酮戊二酸盐到富马酸盐的代谢对产生ROS、HIF1α和增殖的重要性，我们使用shRNA来减少2-酮戊二酸脱氢酶（OGDH）和琥珀酸脱氢酶亚基A（SDHA）的表达，这是2-酮戊三酸盐到富马酸盐代谢中最近端和远端的酶(图2A). 琥珀酸脱氢酶亚单位B、C和D的缺失与癌症相关，细胞表现出基础的ROS依赖性HIF1α激活，而SDHA的缺失与线粒体脑病相关，并且不允许复合物II形成ROS(Guzy等人，2008年). OGDH表达缺失导致HIF1α水平下降(图2、B和C). 同样，SDHA的耗竭也降低HIF1α水平(图2D). 敲除OGDH降低了富马酸和琥珀酸水平(图S2、A和B). SDHA的敲除降低了富马酸盐水平，并使琥珀酸盐水平最低限度地增加(图S2、A和B). 琥珀酸的积累很可能会受到抑制，因为琥珀酸-CoA也会积累，并可流入血红素生物合成途径(Frezza，2011年). 与HIF1α水平一致，mito-roGFP表明OGDH或SDHA的敲除与对照载体相比导致了mito-ROS的减少(图2E). 此外，OGDH或SDHA的敲低抑制了细胞生长，表明增殖需要2-氧戊二酸的氧化代谢(图2，F和G). SDH抑制剂3-硝基丙酸（NPA）处理UOK262细胞也抑制HIF1α的稳定和增殖(图S2、C和D). 总的来说，这些数据表明，在FH缺陷的人类癌细胞中，富马酸盐的产生是ROS增加、HIF1α增加和增殖所必需的。

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2-氧戊二酸氧化代谢为富马酸对HIF1α的稳定、高活性氧和UOK262细胞的增殖是必需的。

(A类)TCA循环示意图强调了两种酶，OGDH和SDH，这两种酶负责2-酮戊二酸转化为富马酸的第一步和最后一步。(B类)实时PCR分析OGDH表达，以检查相对于NS对照的OGDH shRNA靶向的效力。(C类)Western blot检测表达NS和OGDH shRNAs的UOK262细胞中HIF1α和微管蛋白。(D类)Western blot检测表达NS和SDHA shRNAs的UOK262细胞中HIF1α、SDHA和微管蛋白。(E类)经NS、OGDH和SDHA shRNA处理的UOK262细胞中氧化丝裂原GFP的相对水平。OGDH敲除的增殖效应(F类)和SDHA击倒(G公司)在10时用电镀电池测量5分别在48小时和96小时后计算每个平板的细胞数和细胞数。在(B类和E–G公司)这些值表示平均值+s.e.m.n=3(B、 F、G)，n=5(E类). *P<0.05**P<0.01。

富马酸与谷胱甘肽共价结合在体外和FH空单元

富马酸盐含有一个碳-碳双键，最近发现它容易受到半胱氨酸硫代阴离子的亲核攻击。在蛋白质中，半胱氨酸残基的翻译后修饰通过添加富马酸盐产生S-（2-琥珀酰）-半胱氨酸（2SC）加合物，也称为琥珀酸化(Alderson等人，2006年). FH缺陷细胞显示出大量的2SC修饰，其全部后果尚不完全清楚(Bardella等人，2011年). 然而，反应性半胱氨酸经常用于氧化还原反应。谷胱甘肽（GSH）是一种由甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸组成的三肽，是最丰富、最重要的细胞内抗氧化剂。当细胞处于氧化应激状态时，来自两个谷胱甘肽分子的活性半胱氨酸氧化形成二硫键，生成谷胱甘苷二聚体（GSSG）。谷胱甘肽还原酶可以通过NADPH转化为NADP将GSSG还原为GSH+GSH的普遍性和重要性表明了富马酸盐在FH缺陷细胞中引起ROS信号增加的一种有吸引力的机制：富马酸盐与谷胱甘肽的半胱氨酸结合，降低抗氧化能力，从而增强内源性ROS信号。为了验证这一假设，将谷胱甘肽和富马酸结合在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中，并在37°C下培养3小时(图3A). 通过MS/MS鉴定得到的分子物种表明，富马酸可以通过半胱氨酸基的琥珀酸结合谷胱甘肽生成GSH+Fum（GSF）(图3B). GSF分子的碎片分析证实了这种共价键的位置(图S3A). 重要的是，除了中心碳碳键是单键而非双键外，丁二酸与富马酸相同，不能进行这种反应(图3B). 确定是否发生此反应体内从FH缺乏或充满的UOK262细胞中提取代谢物，并通过LC/MS/MS进行定量。GSF物种在FH空白细胞中很容易检测到并大量存在，而用FH-FLAG重组UOK622后，其丰度降低了近75%(图3C和第三方银行). 虽然细胞系之间的GSF水平差异显著，但FH阴性细胞中的GSSG有增加的趋势，而GSH池的损失(图3、D和E). GSSG和GSH的这些变化不太可能完全解释这些细胞中ROS水平升高的原因。然而，我们确实观察到FH阴性细胞线粒体NAPDH水平下降(图3F). NADPH是维持抗氧化活性的关键代谢产物。

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富马酸与谷胱甘肽共价键在体外FH空单元中。

(A类)谷胱甘肽上半胱氨酸对富马酸烯烃碳进行亲核攻击形成GSF的拟议反应。(B类)对10 mM GSH和10 mM富马酸（左）或10 mM琥珀酸（右）的混合物进行MS/MS分析，以确定富马酸是否结合谷胱甘肽在体外丁二酸缺乏富马酸的活性烯烃，因此用作阴性对照。(C–E类)从cv和FH-FLAG UOK262细胞中提取的谷胱甘肽物种的LC/MS/MS分析的定量。(F类)cv和FH-FLAG UOK262细胞线粒体部分NADPH比率的测量。在(C–F类)这些值表示平均值+s.e.m.n=3*P<0.05**P<0.01。

GSF作为谷胱甘肽还原酶的替代底物消耗NADPH

为了研究谷胱甘肽（GSF）在UOK262细胞中积累的后果，由富马酸二甲酯和谷胱甘苷合成了GSF。富马酸二甲酯（DMF）是富马酸的细胞渗透性类似物，与谷胱甘肽有良好的反应机理(施密特等人，2007年). DMF剂量依赖性地消耗GSH在体外成立GSF(图4A和S4A系列). 当允许DMF反应1小时时，它几乎完全消耗GSH，但是琥珀酸二甲酯（DMS）的细胞渗透性类似物不消耗GSH(图4B). LC/MS/MS对这些反应中代谢物的测量表明，GSH的消耗和GSF的生成仅在GSH+DMF条件下进行(图4C). 接下来，我们决定研究GSF对谷胱甘肽依赖性反应的影响。出乎意料的是，我们发现GSF可以作为谷胱甘肽还原酶（GR）的替代底物。GR通常通过将GSSG还原为GSH和NADPH氧化为NADP来充当关键的抗氧化酶+NADPH/NADP+比率可以改变ROS水平(Jeon等人，2012年). 在一个在体外缓冲液、NADPH和GR的溶液，GSF激活NADPH的消耗(图4D)，表示GR正在消耗GSF。GSH和DMF的组合不会产生GSSG（数据未显示）。该反应依赖于GR，不能单独用DMF或GSH重建(图S4 B和C). GSF的消耗也会产生GSH，这表明它被分为GSH和DMS(图4E和S4D系列). 因此，该反应类似于GR和GSSG之间的内源性反应。反应的Vmax相似，尽管GSF的Km预计大约高出10倍(图S4、E和F). 因此，GSF可能在FH阴性细胞中通过GR代谢，同时摄入NADPH，这解释了FH充满细胞中线粒体NADPH比率增加的原因(图3F). 用细胞渗透性GSF处理FH充满的UOK262细胞足以降低NADPH水平(图4F). 细胞渗透性GSF单独处理也增加了ROS和HIF1α水平(图4、G和H). 为了验证GSF通过降低抗氧化能力增强内源性ROS的假设，用线粒体靶向抗氧化剂MVE处理FH充满细胞，以阻止线粒体产生ROS。MVE减弱UOK262 FH-FLAG细胞对GSF的HIF1α稳定诱导(图4H). 因此，GSF充当先前未描述的谷胱甘肽还原酶的替代底物，并消耗NADPH；NADPH的减少将降低抗氧化能力，这将放大内源性线粒体生成的ROS，从而稳定HIF1α。

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GSF是谷胱甘肽还原酶的替代底物。

(A类)在与DMF浓度增加的孵育后测量谷胱甘肽在体外持续3小时。(B类)在所列条件下孵育1小时后测量谷胱甘肽。(C类)对所示代谢物孵育1小时期间产生的代谢物进行LC/MS/MS分析。(D类)在250μM NADPH和0.05 U/ml谷胱甘肽还原酶的溶液中添加模拟溶液、5 mM GSH+5 mM DMF或5 mM GSH+5 mmM DMS时，NADPH浓度随时间变化的代表性测量图。(E类)GSF和NADPH溶液中GSH水平的测量，无论是否含有谷胱甘肽还原酶。(F类)测量用模拟处理或0.5 mM GSF处理3小时的FH-FLAG UOK262细胞中的NADPH比率。(G公司)通过DCFH荧光测定模拟处理或0.5 mM GSF处理3小时的FH-FLAG UOK262细胞的相对细胞内ROS水平。(H（H）)用模拟处理、1μM TPP和1μM MVE预处理21小时的FH-FLAG UOK262细胞HIF1α和微管蛋白的Western blot，并用模拟处理或0.5 mM GSF处理3小时。在(A类)这些值表示平均值+/-s.e.m，n=3，而在(B、 E–G公司)这些值表示平均值+s.e.m.n=3*P<0.05**P<0.01。

FH缺陷癌细胞中Nrf2缺失增加ROS和HIF-1

最近的研究表明，FH缺陷细胞显示转录因子Nrf2的高稳态水平，Nrf2是一系列下游抗氧化基因的主调节器(Ooi等人，2011年,Adam等人，2011年). 据报道，FH阴性细胞中富马酸积累可通过将氧化还原敏感半胱氨酸琥珀酸化至KEAP1（E3泛素连接酶复合物的组成部分）来增加Nrf2水平。KEAP1的吸吮抑制了Nrf2的降解能力，导致Nrf2积累和核移位，并激活抗氧化基因。Nrf2激活的重要性在FH无效细胞中尚不完全清楚。虽然琥珀酸是这些细胞的一个重要机制，但ROS也抑制KEAP活性以稳定Nrf2(Fourquet等人，2010年). 因此，我们试图确定Nrf2在UOK262细胞中的积累是否是琥珀酸、活性氧或两者共同作用的结果。如前所述，通过FH重组，Nrf2蛋白丰度和Nrf2靶基因血红素氧合酶1（HMOX）、NAD（P）H脱氢酶醌1（NQO1）和醛酮还原酶家族1成员B10（AKR1B10）的mRNA丰度降低(图5A). SDHA或OGDH的减少降低了UOK262细胞中Nrf2的活化和靶基因的表达，表明富马酸的积累对Nrf2活化的增加至关重要(图5、B和C). 为了测试Nrf2激活是否需要有丝分裂-ROS，我们用MVE或对照TPP处理FH缺陷细胞。MVE没有阻止Nrf2的稳定或减少UOK262细胞中的Nrf2靶基因，这表明有丝分裂-ROS对Nrf2的激活不是必需的(图5D). 此外，用富马酸、富马酸二甲酯的细胞渗透性类似物处理，无论MVE处理如何，都能增强Nrf2和Nrf2靶基因的表达(图S5A). 然而，细胞通透性富马酸二甲酯而非琥珀酸二甲酯以有丝分裂-ROS依赖的方式增加了FH充满细胞中HIF1α的水平(图S5 B–D). 因此，富马酸介导的Keap1琥珀酸可能是Nrf2激活的主要机制(图S5E). 注意，HMOX在MVE存在时确实减少，这表明该基因可能被Nrf2以外的其他转录因子靶向。以前的研究表明HIF1可以增加HMOX(Lee等人，1997年). 为了研究Nrf2水平和ROS之间的相互作用，在含有shRNA的UOK262细胞中，Nrf2被耗尽，导致HIF1α进一步稳定(图5E)细胞内ROS随之增加(图5F). 有趣的是，Nrf2的减少降低了FH缺乏的UOK262细胞的增殖，这表明Nrf2维持良好的氧化还原平衡可能是细胞增殖所必需的(图5G).

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Nrf2由富马酸稳定，有助于缓解ROS。

(A类)来自cv和FH-FLAG UOK262细胞的Nrf2和微管蛋白的蛋白质印迹和Nrf2靶基因的RT-PCR。(B类)表达NS和OGDH shRNAs的UOK262细胞Nrf2和微管蛋白的Western blot和Nrf2靶基因的RT-PCR。(C类)表达NS和SDHA shRNAs的UOK262细胞Nrf2和微管蛋白的Western blot和Nrf2靶基因的RT-PCR。(D类)模拟处理、1μM TPP和1μM MVE处理的UOK262细胞的Nrf2和微管蛋白蛋白的Western blot和Nrf2靶基因的RT-PCR。(E类)表达NS或Nrf2 shRNA的UOK262细胞中HIF1α、Nrf2和微管蛋白的蛋白质印迹。(F类)在表达NS或Nrf2 shRNAs的UOK262细胞中，通过DCFH荧光测定相对细胞内ROS水平。(G公司)在48小时和96小时后测量Nrf2敲除的增殖效应。在(A–D、F、和G公司)量化值表示平均值+s.e.m.n=3*P<0.05**P<0.01。

FH缺陷癌细胞显示组蛋白高甲基化

人们越来越认识到组蛋白甲基化对癌症发展的重要性(Chi等人，2010年). 据报道，RNAi导致的FH缺失也会增加组蛋白的整体甲基化(Xiao等人，2012年). 组蛋白去甲基化酶是2-氧戊二酸依赖酶，与ROS抑制酶PHD2和因子抑制HIF-1α（FIH）（HIF1α的负调控因子）属于同一家族(Loenarz和Schofield，2011年). 因此，我们假设组蛋白去甲基化酶也可能被UOK262细胞中的ROS抑制。事实上，FH的重组降低了几个赖氨酸残基上的组蛋白甲基化(图6，A和B). 而富马酸可以作为组蛋白脱甲基酶JMJD2A的抑制剂在体外(图6C)，H的毫摩尔水平2O（运行）2还可以减少JMJD2A活动在体外(图6D). 在细胞环境（如UOK262细胞）中，这两种抑制剂都可能存在，因此我们测试了富马酸亚抑制剂量（1mM）的组合，发现它可以与H协同作用2O（运行）2进一步抑制JMJD2A在体外(图6E). 总的来说，我们的结果表明增强的H2O（运行）2可能与富马酸配合抑制组蛋白去甲基化酶并增加FH缺陷癌细胞的组蛋白高甲基化(图S6).

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活性氧抑制组蛋白去甲基化。

(A类)表达cv和FH-FLAG质粒的UOK262细胞核提取物组蛋白甲基化标记和H4蛋白负载控制的代表性western blot。(B类)与UOK262 cv和FH-FLAG细胞H4负荷控制相关的组蛋白甲基化标记物的密度定量。(C类)在富马酸盐、琥珀酸盐和N-草酰甘氨酸（NOG）存在下体外测定JMJD2A的脱甲基酶活性。(D类)JMJD2A脱甲基酶活性的测定在体外在H存在的情况下2O（运行）2. (E类)在存在或不存在1mM富马酸盐和不同剂量H的情况下，体外测定JMJD2A的协同抑制作用2O（运行）2值是相对于没有H的模拟或富马酸盐处理的细胞的活性2O（运行）2.英寸(B–E类)这些值表示平均值+s.e.m.n=3*P<0.05**P<0.01。

复合物I缺乏导致FH缺乏癌细胞的高ROS和糖酵解表型

最近的一项研究表明，UOK262细胞几乎没有线粒体复合体I的活性(Tong等人，2011年). 研究表明，癌细胞中复合物I活性的丧失会增加ROS水平，从而导致HIF1α稳定、AKT磷酸化增加和转移(Sharma等人，2011年,石川等人，2008年). 为了测试复合物I缺乏是否导致UOK262细胞的线粒体损伤、ROS升高和HIF1α稳定，我们使用酵母NADH醌氧化还原酶（NDI1）在FH缺失和充满的UOK622细胞中重建复合物I电子转移，而不是质子泵。NDI1是一种鱼藤酮不敏感的单亚单位蛋白，能够恢复NADH氧化，并能恢复复合体I活性缺陷哺乳动物细胞的线粒体呼吸(Seo等人，1998年). 将表达控制载体（cv）和FH-FLAG的UOK262细胞感染含有蓝色荧光蛋白（BFP）控制载体或含有BFP的NDI1（NDI1-BFP）的病毒(图7A). NDI1在用NDI1转导的细胞中表达丰富且大致相等(图7B). FH和复合物I的重组恢复了UOK262细胞的线粒体耗氧量(图7C). 线粒体功能的恢复使细胞能够在含有半乳糖的无糖培养基中存活(图7D). 半乳糖在糖酵解中的利用率很低，可以控制培养基中的糖。有趣的是，NDI1的表达仅恢复FH充满细胞中的复合物I活性，这是由与TCA循环中间代谢物丙酮酸/苹果酸、谷氨酸/苹果酸或棕榈酰肉碱/苹果酸孵育的皂苷通透细胞的线粒体耗氧量确定的(图7E和图S7B和C). 吸吮代谢酶可以抑制其活性，这为为什么NDI1表达不能在FH阴性细胞中重建复合物I活性提供了一种潜在的机制(Blatnik等人，2008年). 复合物I活性的鱼藤酮不敏感部分代表NDI1对复合物I活动的贡献。生产富马酸所需的复合物II活性不受FH或复合物I状态的影响(图7F). FH空细胞和充满细胞中复合物I活性减弱的HIF1α水平的重建(图7G). 根据丝裂原GFP相对氧化和丝裂原SOX荧光测定，NDI1表达也降低了丝裂原ROS(图7H和图S7D). 表达NDI的细胞组蛋白甲基化降低；进一步表明ROS可能抑制组蛋白去甲基化酶(图S7E). 因此，除FH缺乏外，复合物I损伤还增加了线粒体ROS的生成，从而触发UOK262细胞中HIF1α的稳定。

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FH和复合物I功能障碍均导致UOK262细胞中HIF1α稳定、高ROS、线粒体耗氧量损失和还原羧基化。

(A类)描述细胞系标签及其相关质粒的表格。(B类)NDI表达的实时PCR分析。(C类)四种UOK262细胞系的线粒体OCR。(D类)在含有10 mM葡萄糖的完整DMEM或补充有10 mM半乳糖的无葡萄糖DMEM中24小时后，四个UOK262细胞系的细胞死亡，由摄取碘化丙啶的细胞百分比决定。(E类)当用10 mM丙酮酸和2 mM苹果酸处理时，皂苷渗透性UOK262细胞系的线粒体OCR。通过添加2μM鱼藤酮后OCR的降低来测量鱼藤酮敏感部分。(F类)当用10mM琥珀酸盐处理时，皂苷透化的UOK262细胞系的线粒体OCR。(G公司)四个UOK262细胞系HIF1α和微管蛋白的Western blot。(H（H）)四个UOK262细胞系氧化丝裂原GFP的相对水平。(我)用GC/MS分析柠檬酸在D[U培养细胞中的质量同位素分布-13C] 葡萄糖和未标记的谷氨酰胺。(J型)枸橼酸盐在L[U培养细胞中质量同位素分布的GC/MS分析-13C] 谷氨酰胺和未标记葡萄糖。在(B–F、H)这些值表示平均值+s.e.m.In(我和J型)这些值表示平均值+标准偏差。n=3个(B、 D、I、J)，n=5(C、 E、F)，n=6(H（H）). *P<0.05**与细胞系1相比，P<0.01。

在正常细胞中，柠檬酸盐是在TCA循环中由乙酰-CoA的2个碳添加到4个碳的草酰乙酸分子中生成的。我们最近报道了一种新的机制，通过这种机制，线粒体突变的细胞，包括UOK262细胞，可以在不使用糖酵解衍生的乙酰辅酶a的情况下产生柠檬酸盐(Mullen等人，2012年). 在这些细胞中，谷氨酰胺被转化为2-酮戊二酸，这是一种5碳的代谢产物，通过典型TCA循环代谢的相反方向，将添加碳来生成柠檬酸盐，这一过程称为还原羧基化(图2A). 因此，我们试图研究复合物I损伤是否有助于UOK262细胞的还原羧基化。代谢物的碳标记使我们能够确定细胞用于的代谢途径从头开始的柠檬酸盐合成。为了确定葡萄糖衍生碳对这一过程的贡献，我们培养了所有6个碳（U-13C-葡萄糖），并通过气相色谱-质谱（GC/MS）观察柠檬酸盐池的质量同位素分布。柠檬酸标记的m+2是葡萄糖衍生丙酮酸氧化脱羧形成1,2的结果-13C-乙酰-CoA，然后与未标记的草酰乙酸（OAA）缩合。仅观察到FH和复合物I重组的UOK262细胞产生糖酵解衍生柠檬酸盐(图7I). 此外，这些细胞还产生柠檬酸盐标记的m+4，这是当m+2标记的柠檬酸盐分子保留在TCA循环中生成m+2标记OAA，然后与标记的乙酰辅酶a结合，从而产生m+4标记的枸橼酸盐时形成的；这是一个完整的TCA循环的证据。同样，为了确定谷氨酰胺碳对柠檬酸盐池的贡献，我们培养了所有细胞系，在所有5个碳（U-13C-谷氨酰胺）。我们之前已经证明，UOK262细胞通过还原羧基化途径代谢谷氨酰胺衍生的2-酮戊二酸生成柠檬酸盐；与U培养时-13C-谷氨酰胺生成标记为m+5的柠檬酸。UOK262中FH的重建降低了柠檬酸盐m+5的量，并增加了通过氧化TCA循环代谢形成的量，即柠檬酸盐m+4(图7J). 当谷氨酰胺衍生的2-酮戊二酸在TCA循环中氧化形成OAA m+4，然后与未标记的乙酰辅酶A缩合时，形成柠檬酸m+4。FH和NDI1的加入进一步增加了氧化柠檬酸的生成量，并减少了还原性柠檬酸的形成。总之，这些结果表明FH缺失和复合物I损伤都会导致人类FH缺陷癌细胞的代谢功能障碍和还原羧基化。

讨论

线粒体代谢为癌细胞提供生物合成大分子所必需的代谢产物，并为细胞增殖和适应代谢应激提供活性氧。然而，有一部分癌症是由TCA循环酶（包括FH）活性丧失的突变引起的。FH缺乏的一个后果是HIF1α在常氧下异常稳定。以HIF1α为降解目标的羟基化反应需要2-酮戊二酸。富马酸积累在FH阴性细胞中，可以与2-酮戊二酸竞争以防止羟基化(Koivunen等人，2007年). 然而，值得注意的是，PHD2对2-氧戊二酸的解离常数（Kd）比富马酸低得多，而且在FH缺乏的细胞中，富马酸的水平必须大大超过2-氧戊二酸的水平(Hewitson等人，2007年). 另一种非互斥的HIF1α积累机制是FH缺陷细胞利用ROS增加HIF1α的稳定性。线粒体中FH的重建降低了ROS和HIF1α蛋白水平。重要的是，清除线粒体ROS可以防止FH缺陷癌细胞中HIFα蛋白的异常增加。此外，通过降低SDHA和OGDH的表达来阻止富马酸的积累，可以减少线粒体ROS和HIFα蛋白的积累。因此，这表明富马酸积累本身可能导致活性氧增加。

活性氧的增加是由于富马酸与还原型谷胱甘肽的反应在体外并在FH缺陷细胞中产生GSF，即新的癌症相关代谢物。GSF可以与谷胱甘肽还原酶反应，消耗NADPH，NADPH是用于还原还原型谷胱甘蛋白和过氧化物酶原的关键辅助因子。后者是用来解毒H的主要酶2O（运行）2对于蜂窝信号来说是必需的。在GSF存在的情况下，NADPH被消耗，即使GSF没有被用作抗氧化剂。因此，GSF消耗了NADPH的还原当量，而没有抗氧化效果。随着NADPH被GSF消耗，FH缺陷细胞的NADPH降低，导致ROS水平升高。事实上，用GSF处理FH充满细胞足以降低NADPH、增加ROS和增加HIF1α水平。重要的是，在MVE存在下，GSF不能激活HIF1α，这表明GSF本身并不产生ROS，而是通过降低稳态抗氧化能力来增强内源性ROS。

FH缺乏的人类癌细胞和小鼠细胞的一个令人困惑的方面是，尽管ROS增加，但Nrf2也增加，Nrf2是一种激活抗氧化基因表达的转录因子。癌细胞需要适量的有丝分裂-ROS来促进细胞增殖和适应压力(凯恩斯等人，2011年). 富马酸在FH缺陷的人类癌细胞中的积累触发Nrf2，Nrf2通过其抗氧化途径的刺激，阻止ROS积累到引发损伤的水平。事实上，降低UOK262细胞中的Nrf2水平会增强ROS并降低细胞增殖。因此，我们认为Nrf2在UOK262细胞中的主要功能是控制富马酸升高的ROS水平，使其与细胞增殖相容。

最近的一项研究表明，HEK293细胞中FH的RNAi也会增加组蛋白的超甲基化(肖等，2012). 我们通过证明天然FH缺陷癌细胞UOK262细胞也表现出异常的高甲基化，而2-HG没有明显增加来扩展这些观察结果。Jumonji-domain组蛋白去甲基化酶（JHDMs）是与PHD和FIH类似的2-酮戊二酸依赖性双加氧酶。JHDM先前已被证明在高浓度下被富马酸盐抑制。在本研究中，我们观察到低浓度的H2O（运行）2还可以降低JDMH的活动在体外此外，H2O（运行）2配合富马酸的亚抑制水平进一步抑制JHDM的活性在体外.我们建议H的标高2O（运行）2FH阴性细胞通过抑制JHDMs促进组蛋白的超甲基化。组蛋白的超甲基化是否有助于UOK262细胞的致瘤和转移潜能，尚待确定。

有趣的是，我们对UOK262人癌细胞的代谢分析表明，除了FH缺乏外，这些细胞还获得了复杂的I损伤。发生这种情况的机制尚不清楚。RNAi介导的FH抑制不会导致HEK293人类癌细胞中的复合物I损伤（数据未显示）。此外，由于FH缺乏已经损害线粒体代谢，因此没有明显的理由说明细胞会因进一步的线粒体缺陷而受益。UOK262细胞中复合物I活性的丧失确实导致ROS水平的进一步增加和HIF1α蛋白的稳定，这可以通过NDI1的表达来挽救。虽然先前的研究表明，HIF不太可能是FH缺陷癌细胞生长所必需的(Adam等人，2011年)，它们代表活性氧增加的产物，可能在侵袭和转移中发挥作用。事实上，复合I突变已被证明增加ROS、HIF1α和转移(Sharma等人，2011年,石川等人，2008年). 我们认为UOK262细胞中ROS水平升高有助于进一步增加其致瘤性和转移潜能。

总之，我们的结果表明，与HLRCC相关的FH丢失导致富马酸积累，富马酸与还原型谷胱甘肽发生化学反应，形成一种新的癌症相关代谢物GSF。GSF与GR反应以耗尽NADPH水平，从而增加ROS和ROS依赖信号。虽然HLRCC是一种相对罕见的癌症，但富马酸积累的相关性超出了这种情况。来自患者样本和细胞系的非HLRCC肾细胞癌中FH水平已被证明降低(Sudarshan等人，2011年). 富马酸水平在其他形式的癌症如结肠癌和胃癌中也会升高(平山等人，2009年). 在糖尿病大鼠和小鼠中观察到富马酸积累和蛋白质琥珀酸化(Alderson等人，2006年,Frizzell等人，2009年). 未来的研究将需要确定富马酸积累和伴随的活性氧增加是否在其他类型的癌症和代谢紊乱中起到因果作用。

实验程序

细胞培养

UOK262细胞在添加10%胎牛血清、1%HEPES和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养。用FH-FLAG和对照载体转导的细胞进行连续嘌呤霉素选择（2μg/ml）。通过使用MoFlo（Beckman-Coulter）对BFP阳性细胞进行周期性荧光激活细胞分选，选择含有含NDI1的BFP的细胞和对照载体。增殖测定、RT-PCR分析和亚细胞分级方法在补充程序中提供。

FH活性测定

细胞线粒体部分FH活性的量化如(哈奇，1978年).

shRNA感染

pLKO.1验证的针对OGDH、SDHA、Nrf2和FH的shRNA慢病毒载体来自Sigma。病毒是在293FT包装细胞中产生的，病毒剂量是由用嘌呤霉素处理后使细胞死亡最少所需的最低病毒量决定的。

免疫印迹分析

使用细胞裂解缓冲液（细胞信号传递）提取蛋白裂解产物，并通过BCA蛋白检测（Pierce）进行定量。样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上溶解，并通过半干转移转移到硝化纤维素膜上。用HIF1α（BD Bioscience）、SDHA（MitoSciences）、Nrf2（Novus）、Tubulin、FLAG和FH（Sigma）抗体进行免疫印迹分析。

对于组蛋白分析，按照制造商的说明，使用核复合物co-IP试剂盒（Active Motif）制备核提取物。用以下抗体对每个样品的5μg进行免疫印迹：H3K9me2（Abcam）、H3K9 me3（Millipore）、H3 K27me2（Millibore）、H 3K27me3（Milipore”）、总H4（Abcam）。

ROS测量

Mito-roGFP、DCFH和Amplex Red的测量详见(Weinberg等人，2010年).

检测琥珀酸谷胱甘肽的LC/MS/MS条件

该实验在岛津UPLC系统（岛津科学仪器）和ABSCIEX QTRAP 5500质谱检测器（AB SCIEX）上进行。色谱分离在微溶剂技术（Eatontown）Cogent Diamond Hydride色谱柱上实现（150 mm×2.1 mm，4μm d第页，100μl孔径），在35°C下，使用水流动相A（10 mM醋酸铵）和有机流动相B（乙腈/水（90/10），10 mM乙酸铵）。梯度从90%B到70%B持续4分钟，从70%B到50%B持续1分钟，然后在50%B下保持5分钟。在每次运行之前，将色谱柱平衡5分钟。流速为0.4 mL/min，注射体积为10μL。质谱（MS）在负模式和多反应监测（MRM）下运行。根据输液实验，优化了所有相关MS参数。[M-H]母体离子的串联跃迁−71的碎片离子米/z富马酸（FUM），272米/z对谷胱甘肽还原（GSH）和氧化（GSSG）进行监测，以进行定量分析。使用1.6版Analyst软件采集和分析数据。补充程序中提供了定量琥珀酸谷胱甘肽的方法。

NADPH/NADP的测定+比率

NADPH比率是通过服用全细胞或线粒体裂解物并遵循制造商的NADP协议来确定的+/NADPH分析试剂盒（Abcam）。

谷胱甘肽定量

GSH来自在体外通过在缓冲液中稀释样品并添加300μM 5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（dtnb）并在10分钟后在412 nm处测量吸光度来测量反应。将数值与GSH的标准曲线进行比较。

谷胱甘肽还原酶测定

GSF和对照底物在室温下在50 mM Tris和5 mM EDTA的溶液中培养1小时。pH值为7.8，以模拟线粒体基质的pH值，其中最有可能合成GSF。将底物添加到250μM NADPH和0.05 U/ml谷胱甘肽还原酶的溶液中。通过在340nm处的吸光度损失来监测NADPH的消耗，并通过与标准曲线进行比较来确定浓度。

组蛋白脱甲基酶活性测定

组蛋白去甲基化酶JMJD2A的活性根据制造商关于JMJD2A-抑制剂筛选试剂盒（Cayman）的协议进行测定。

耗氧量测量

氧消耗率（OCR）在海马生物科学细胞外通量分析仪（XF24）上测定。具体方法见补充程序。

碳通量代谢物

碳标记代谢物的质量同位素分析如前所述(Mullen等人，2012年).

统计分析

除非另有说明，否则数据以平均值±SEM表示。统计显著性是通过两个样本的Student t检验来确定的，该检验将实验条件与适当的对照进行了比较。在P＜0.05或P＜0.01的值处确定统计学显著性。

​

集锦

  • FH损失增加富马酸，导致HIF-1线粒体ROS活化。
  • 富马酸盐与谷胱甘肽共价键合生成琥珀酸谷胱甘苷（GSF）。
  • GSF是谷胱甘肽还原酶的底物，通过消耗NADPH来增强ROS。
  • FH缺乏导致的活性氧增加有助于组蛋白的高甲基化。

补充材料

01

单击此处查看。（160万，docx）

致谢

这项工作得到了NIH（R01CA123067）对N.S.C.和NIH（R1CA157996）的支持，以及Robert A.Welch基金会（I1733）对R.J.D.的支持。这项工作还得到了L.B.S.对NIH培训拨款T32 GM08061的支持，A.R.M.对NIH-培训拨款（5T32GM083831）的支持。J.D.L由西北大学物理科学肿瘤中心资助U54CA143869。我们感谢Balaraman Kalyanaraman博士和Joy Joseph博士为MVE所做的贡献。我们感谢NCI的Youfeng Yang和W.Marston Linehan提供UOK262细胞。我们感谢Alena Heath设计图形摘要。作者声明没有利益冲突。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将进行编辑、排版和校对。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明都适用。

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