腺病毒生物学和癌症生物学以互补的方式取得了进展。例如，发现病毒E1区编码的蛋白质与肿瘤抑制蛋白p53和pRB结合，这些相互作用在表征这些肿瘤抑制蛋白在病毒依赖性和非依赖性转化中的作用方面发挥了重要作用(1,2). 也许，人类腺病毒现在被开发成抗癌药物是这一历史的自然延伸。具有讽刺意味的是，尽管基因工程的进展已经允许开发复制障碍型腺病毒作为治疗基因的简单载体(三–5)，复制能力强的野生型菌株实际上是第一个安全给患者使用的菌株(6). 近半个世纪后的今天，具有复制能力的腺病毒再次被作为治疗剂进行研究(7–9). 然而，基因工程现在已被用于最大限度地提高肿瘤选择性复制的目标。
复制选择性腺病毒作为生物治疗剂具有一些吸引人的特性。复制可放大溶瘤病毒的输入剂量，并有助于将药物传播到邻近的肿瘤细胞(9). 此外，腺病毒感染可能产生抗肿瘤免疫反应(10–12). 鉴于治疗基因和具有复制能力的病毒方法的有利属性，携带治疗基因的腺病毒可能最终会取得最佳临床成功，用于补充标准的手术、放射和化疗方法。
当考虑将一种用于开发的病毒作为溶瘤治疗时，需要评估许多疗效、安全性和制造问题。首先，根据定义，病毒必须在人体肿瘤细胞中复制并摧毁肿瘤细胞。病毒的合理工程取决于对病毒基因调控感染、复制和发病机制的详细了解。由于大多数实体肿瘤的生长分数相对较低，病毒应该会感染非循环细胞。此外，病毒进入受体必须在患者的靶肿瘤上表达。从安全的角度来看，父母的野生型病毒最坏会导致温和且易于控制的人类疾病。非整合病毒也有潜在的安全优势。从安全和制造的角度来看，一种基因稳定的病毒是可取的。最后，根据临床研究的良好生产规范（GMP）指南，该病毒必须适合高滴度生产。人类腺病毒具有这些特点，因此是治疗发展的最佳候选。
人类腺病毒生物学
所有腺病毒（图)具有约38 kB的线性双链DNA基因组(13). 衣壳无包膜，由结构蛋白己糖组成；结合αV（V）β三和αV（V）β5整合素允许病毒内化；纤维结合柯萨奇病毒和腺病毒受体CAR。基因组的E3区域编码几种蛋白质，使病毒能够逃避免疫反应(14). gp19-kD蛋白抑制细胞表面MHC-I类表达（即避免细胞毒性T淋巴细胞介导的杀伤）(15)E3 10.4/14.5 kD和14.7 kD蛋白抑制FasL或肿瘤坏死因子（TNF）介导的凋亡(12,14).
人类腺病毒的结构，表明衣壳蛋白的排列。纤维和戊聚糖识别介导病毒内吞的细胞受体。
腺病毒的生命周期（参考文献。16)进行以下步骤：（a）病毒在CAR和整合素结合后进入细胞，（b）细胞进入S期，（c）抑制宿主细胞凋亡，（d）阻止细胞蛋白合成，（e）病毒DNA复制，（f）病毒结构蛋白合成病毒释放。腺病毒在靶肿瘤细胞内复制可通过多种机制导致细胞破坏（表). 首先，病毒蛋白，包括E3 11.6腺病毒死亡蛋白(16)和E4ORF4(17)，在感染过程中后期表达的是直接的细胞毒性。相应基因的缺失显著延缓了感染细胞的死亡。此外，在腺病毒生命周期的早期，E1A的表达使细胞对肿瘤坏死因子（TNF）介导的杀伤敏感(18). E3蛋白10.4/14.5和14.7抑制了这种作用；这些E3蛋白的缺失导致体内TNF表达的增加和细胞对TNF的敏感性的增强。最后，病毒在肿瘤细胞中的复制和裂解在模型系统中诱导对肿瘤细胞的细胞介导免疫（R.Martuza，本系列）。患者是否会从类似的效果中受益还有待确定。
野生型腺病毒的临床试验结果
腺病毒可以在体外消灭多种肿瘤细胞，这一认识导致了20世纪50年代对宫颈癌患者进行了10种血清型野生型腺病毒的临床试验(6). 对30名患者进行了总共40种治疗，包括直接瘤内注射、瘤内动脉灌注注射或静脉注射。在可能的情况下，这些患者接受了一种血清型的治疗，他们没有出现中和抗体。在大约一半的病例中，皮质类固醇被作为非特异性免疫抑制剂使用。
未报告有明显的局部或全身毒性。这种相对安全性值得注意，因为许多患者对使用的血清型和伴随使用的皮质类固醇缺乏预先存在的免疫力。一些患者出现相对轻微的病毒综合征，持续2至7天，并自行缓解。三分之二的患者在接种后17天内从肿瘤中回收了感染性腺病毒。三分之二的患者表现出“明显到中度的局部肿瘤反应”，肿瘤坏死和溃疡。不幸的是，反应的定义尚未见报道，但在使用无病毒组织培养液或热灭活病毒治疗的7名对照患者中均未出现反应。给药后7天内，中和抗体增加。尽管对这些患者的临床益处尚不清楚，而且所有患者最终都有肿瘤进展并死亡，但这项研究表明，野生型腺病毒可以安全地应用于患者，并可在面临免疫反应时导致肿瘤坏死。
由于这项研究没有包括病毒剂量的系统性增加，因此它没有确定最大耐受剂量，也没有阐明治疗指数的大小，这是对野生型病毒治疗的效力和选择性的衡量。由于所有治疗途径都会使正常组织暴露于活病毒(19,20)任何此类药物的临床效用都取决于其治疗指数。目前正在寻求一些优化选择性和效力的方法。
优化肿瘤选择性腺病毒复制
目前有两种广泛的方法被用于工程肿瘤选择性腺病毒复制（图). 第一种是通过使用肿瘤或组织特异性启动子来限制E1A基因产物在肿瘤组织中的表达。E1A刺激S期进入并激活病毒和细胞基因，这些基因对生产性病毒感染至关重要(21). 组织或肿瘤特异性启动子可以取代内源性病毒序列，以限制病毒复制到特定目标组织。例如，前列腺特异性抗原基因(PSA公司)启动子/增强子元件已插入E1A公司基因；结果是病毒复制与特定细胞中PSA表达水平相关(22). 该病毒CN706（Calydon Pharmaceuticals，Sunnyvale，California，USA）目前正在进行肿瘤内注射治疗局部复发前列腺癌患者的一期临床试验。第二个前列腺特异性增强子序列随后被插入E1B公司CN706病毒区域；使用这两种前列腺特异性增强子元件驱动分离早期基因区域，提高了对第一代病毒的选择性。其他小组也采用了类似的方法，使用组织特异性启动子在特定癌中选择性地驱动E1A表达（例如α-脂肪蛋白、癌胚抗原、MUC-1）。
用复制选择性试剂选择性杀死癌细胞。病毒制剂可以被改造成在肿瘤细胞中复制并特异性杀死肿瘤细胞，使健康细胞免受伤害。有几种策略可用于设计此类代理。
优化肿瘤选择性的第二个策略是删除对正常细胞中病毒高效复制至关重要的基因功能，而不是肿瘤细胞中的基因功能。许多在腺病毒复制过程中被病毒基因产物灭活的关键调控蛋白在致癌过程中也被灭活(2,23,24). 由于这种融合，通常需要灭活细胞蛋白的病毒基因产物在已经失去目标蛋白的癌细胞中变得多余(25,26). 例如，p53抑癌基因产物的功能在肿瘤和腺病毒感染细胞中都受到损害。一株腺病毒因E1B-55kD基因，数字图书馆1520（ONYX-015，现在称为CI-1042，Park-Davis Pharmaceuticals，Inc.，division of Warner Lambert，Inc.Ann Arbor，Michigan，USA）正在开发用于治疗缺乏p53功能的肿瘤(2). 由于E1B-55kD基因产物负责p53结合和失活，因此假设缺失突变体无法使正常细胞中的p53失活，从而无法有效复制。相反，缺乏功能性p53的癌细胞对病毒复制和随后的细胞溶解很敏感。同样，被病毒蛋白E1A抑制的肿瘤抑制蛋白pRb在肿瘤发生过程中经常丢失。正在评估E1A的pRB结合域中的突变体用于对抗此类肿瘤；这些突变体在培养和体内均表现出比野生型或其他基因缺失腺病毒更大的效力(26).
p53依赖的特异性数字图书馆1520年一直存在争议。Bischoff等人(27)最初报告称第53页突变肿瘤细胞在体内外均以复制依赖的方式被破坏。一些研究小组随后发现，许多肿瘤细胞系与正常的第53页基因序列对数字图书馆1520 (28–31)，但考虑到除了遗传突变外，p53功能也可能丧失的多种机制，这一发现是可以预测的。数字图书馆与野生型腺病毒相比，在大多数被测正常细胞类型中，1520株腺病毒显著减弱(25,30,32)，对除p53功能外相同的细胞系的比较表明数字图书馆1520被功能性p53抑制（参考。27; I.Ganly和C.Heise，未公布数据）。另一方面，一种细胞系U2OS对数字图书馆显性阴性p53转染后1520(32). 很明显，肿瘤细胞中其他突变的背景将显著影响分力1520和其他腺病毒。
尽管数字图书馆1520年，利用肿瘤细胞中常见的功能丧失突变，将突变腺病毒直接复制到转化细胞上，必须考虑几个潜在的障碍。首先，重要的病毒功能可能通过冗余机制发生，因此单个病毒基因的改变或缺失可能不会完全消除给定的活性。数字图书馆例如，1520在正常内皮细胞和乳腺上皮细胞中严重衰减，但在其他一些正常细胞中没有衰减。此外，如果病毒基因被删除，只带来相对较小的生存优势，那么所产生的突变株在正常宿主细胞中的生长只会部分减弱。相反，许多腺病毒基因产物是多功能的；这种基因的缺失会导致一种以上的功能丧失。与野生型腺病毒相比，即使在所需基因型的肿瘤细胞中，这种缺失突变也可能显著减弱。例如，细胞杀伤的相对效率数字图书馆1520和野生型腺病毒在不同p53突变癌细胞系之间差异显著(34). 在处理这些基因时，引入细微的突变而不是缺失可能是有用的，以避免在突变病毒中引入多效性缺陷。最后，癌细胞的功能途径非常复杂，可以通过多种机制使其失活；对癌细胞内单个基因序列的分析不太可能准确预测任何病毒突变的疗效。
临床进展dl1520（ONYX-015，现为CI1042）：分阶段开发方法
数字图书馆1520是一种具有新颖作用机制的新型药剂。我们预测，毒性和疗效将取决于特定肿瘤复制病毒的固有能力、待治疗肿瘤的位置（例如颅内与外周）以及病毒的给药途径。为了在整个临床开发过程中跟踪病毒复制、抗病毒免疫反应及其与抗肿瘤疗效的关系，我们采用了分阶段临床开发方法。在肿瘤内注射方案之后，进行了腔内滴注、动脉内滴注和最终静脉注射的试验。选择复发性头颈癌患者作为我们的初始研究人群，因为此类肿瘤通常带有p53异常，并且即使在门诊，也可以直接注射和活检。由于大多数患者因这些肿瘤的局部进展而出现严重的发病率，甚至死亡，我们希望局部治疗可以显著改善他们的状况或延长他们的生存期。
肿瘤内注射数字图书馆1520例复发性和难治性头颈癌。先前报告的初步结果(20,33,34)，建立复制选择性腺病毒方法的生物证据概念：大多数头颈部癌活检显示出选择性的瘤内复制，在某些情况下出现肿瘤坏死和病毒诱导的细胞病变效应。注射肿瘤块附近的正常组织没有显示出明显的毒性。重要的是，基线中和抗体滴度似乎不会影响抗肿瘤活性或毒性(33).
数字图书馆1520名患者还接受了局部晚期胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、非小细胞肺癌和口腔异型增生的I期和II期试验，使用多种全身或局部治疗方法接种病毒。数字图书馆1520已经安全地给药给200多名患者，并且在剂量高达2×10的任何给药途径中都没有确定最大耐受剂量13粒子。与头颈部癌数据一样，经治疗的结直肠癌肝转移的活检显示ONYX-015已经复制，但在其他试验中，卵巢癌或胰腺癌中没有明显的瘤内复制。尽管有明确证据表明一些患者具有抗肿瘤活性（例如诱导坏死），但ONYX-015作为单一药物的治疗并没有在患者中产生经典定义的客观肿瘤反应。因此，数字图书馆许多行政途径都能很好地容忍1520，但作为单一代理，其效力有限。
增强腺病毒生物疗法的效力
为了提高治疗效果，我们结合数字图书馆1520年，采用常规化疗方案[静脉注射顺铂和5-氟尿嘧啶（5-FU）]进行头颈癌II期研究。注射肿瘤的反应率优于单纯化疗的历史对照组；使用联合治疗，83%的注射肿瘤在治疗后6个月内没有进展，而历史上仅用相同化疗治疗的肿瘤中有25-30%没有进展(35). 有多个肿瘤肿块的患者，其中一个肿瘤注射了数字图书馆1520例，未注射继发肿瘤；这些未注射的肿瘤作为单独化疗效果的内部控制。数字图书馆与未注射肿瘤相比，1520个注射肿瘤的反应率和肿瘤进展时间明显更好。一项结肠直肠癌肝转移试验也提供了初步证据，证明5-FU和数字图书馆1520年可以进行良好的互动（Tony Reid和D.Kirn，未发表的数据）。今年将开始一项随机III期试验，比较病毒和化疗联合治疗与单纯化疗对该患者的影响。
另一种增加选择性复制腺病毒溶瘤活性的方法是通过工程这些载体来表达外源治疗基因（参见T.Hermiston和D.Springer，本系列）。这些方法显然不是相互排斥的，第二代转基因构建物可能将直接的局部和全身抗肿瘤活性的优势与选择性复制和特异性增强的癌细胞化疗敏感性相结合。
